火龙果类锌指蛋白基因片段的克隆及表达分析

锌指蛋白在原核生物与真核生物基因转录的调控中发挥着重要作用.根据火龙果抗逆cDNA 芯片中的一个 EST设计一对引物,采用RT-PCR克隆火龙果类锌指蛋白基因片段,生物信息学分析表明,该片段长334bp,编码 1中含有109个氨基酸残基的肽链,命名为HuZF.该基因序列与其它植物锌指蛋白基因核苷酸序列的同源性均在 70%以上,推测的氨基酸序列与其它植物锌指蛋白的氨基酸序列的同源性达60%以上.RT-PCR分析表明,高盐和 干旱胁迫下,火龙果茎中HuZF 的表达增强,低温胁迫时,HuZF 的表达先减弱后增强,初步推测该基因的表达与 火龙果低温、高盐、干旱等逆境胁迫响应相关.     

一个新的水稻C2H2型锌指蛋白cDNA的克隆与序列分析

锌指蛋白 (ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｐｒｏｔｅｉｎ)是一类具有“手指状”结构域的转录因子 ,负责调控基因的表达。锌指蛋白主要通过与核酸的相互作用 ,显示出不同的功能 ,如促进转录、抑制转录、单链ＤＮＡ结合、ＲＮＡ结合或ＲＮＡ/ＤＮＡ双向结合[1 ] 等。Ｃｙｓ2 /Ｈｉｓ2型锌指 (也称ＴＦⅢＡ型 )是真核生物的转录因子中结构描述的最为清楚的转录因子 ,其锌指区为ＣＸ2 - 4 ＣＸ3ＦＸ5ＬＸ2 ＨＸ3- 5Ｈ的结构[2 ] 。植物中目前已经克隆了一些Ｃ2Ｈ2型锌指蛋白基因 ,其中很多锌指区具有ＱＡＬＧＧＨ的保守区 ,如与拟南芥花发育相关的ＳＵ …     

陆地棉锌指蛋白(GZFP)的原核表达

采用大肠杆菌表达体系来获得陆地棉锌指蛋白（GZFP）的融合蛋白．以pMD18-GZFP质粒为模板,用PCR方法扩增获得GZFP基因的编码区序列,将其克隆到表达载体pET28b（＋）中,转化宿主菌BL21（DE3）,成功地构建了陆地棉GZFP基因原核表达载体pET—GZFP、经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析和蛋白质杂交检测表明,陆地棉GZFP以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到大量表达．     

沙冬青GATA型锌指蛋白基因序列及表达分析

根据沙冬青低温干旱诱导cDNA文库表达序列标签中锌指蛋白基因序列设计特异引物,采用PCR技术扩增锌指蛋白基因AmZFPG的cDNA全长.序列分析表明,cDNA全长669 bp,推测编码223个氨基酸残基、分子量约25 kD的蛋白质.氨基酸保守性分析及同类锌指结构比对表明AmZFPG属于GATA结合蛋白家族,且具有高度的...     

水稻B-box锌指蛋白基因OsBBX26的 克隆及表达分析

[目的]克隆水稻B-box锌指蛋白基因(OsBBX26),并分析其在非生物胁迫下的表达模式,为探究水稻B-box蛋白的非生物胁迫响应机制提供理论依据.[方法]以水稻模式品种日本晴为材料,采用RT-PCR克隆OsBBX26基因,对其进行生物信息学分析,并通过构建pBA-OsBBX26-YFP植物表达载体进行亚细胞定位.同时,采用实时荧光定量PCR检测分析OsBBX26基因的组织特异性及非生物胁迫(干旱、ABA、低温和高盐)下的表达模式.[结果]克隆获得的OsBBX26基因(LOC_Os08g42440)cDNA全长序列为1467 bp,编码488个氨基酸,其编码蛋白分子量为51.86 kD,理论等电点(pI)为6.63,包含1个B-box锌指结构域和1个CCT结构域,其中B-box结构域位于第13~60位氨基酸,CCT结构域位于第435~478位氨基酸,该蛋白定位于细胞核中.OsBBX26基因位于8号染色体上,启动子区域除了含有TATA-Box和CAAT-Box等基本转录元件外,还含有与逆境相关的顺式作用元件,包括低温响应元件LTR、脱落酸响应元件ABRE、水杨酸响应元件TCA-element、厌氧响应元件ARE、茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif,以及MYB转录因子结合位点.OsBBX26蛋白与粳稻B-box蛋白亲缘关系最近,其次与籼稻B-box蛋白亲缘关系较近,与其他植物B-box蛋白也存在较高的相似性,其中与小米、大麦、高粱、玉米和短柄草B-box蛋白的氨基酸序列相似性分别达72%、72%、71%、69%和68%.OsBBX26基因在幼叶中的表达量最高,其次是在成熟叶片中,在幼根、成熟根、茎和幼穗中的表达量均极低,表明该基因表达具有明显的组织表达特异性.干旱、高盐、ABA和低温胁迫处理下OsBBX26基因均上调表达,干旱、高盐和ABA胁迫处理12 h达峰值,但低温胁迫处理在24 h后才达峰值.[结论]OsBBX26基因受干旱、高盐、ABA和低温胁迫诱导均上调表达,推测其参与水稻植株响应多种非生物胁迫,在逆境响应中发挥重要调控作用.     

水稻CCCH型锌指蛋白亚家族Ⅰ基因的表达分析

CCCH型锌指蛋白是一类生物体中广泛存在的转录因子,与植物的抗逆性密切相关。水稻CCCH锌指蛋白家族包括67个成员,分为8个亚家族。本研究采用实时定量PCR技术分析水稻CCCH亚家族Ⅰ基因的组织表达模式以及盐、干旱、低温、高温等多种非生物胁迫和脱落酸(ABA)对CCCH基因表达水平的调节。结果表明,多数CCCH基因都不同程度地受到这些非生物胁迫及ABA的诱导或抑制,其中C3H10、C3H24、C3H33、C3H37和C3H67的表达量在不同胁迫处理后表现出不同程度的升高,C3H35、C3H50和C3H52在盐、干旱、ABA、低温和高温处理后表达水平呈下降趋势,表明这些CCCH锌指蛋白可能参与水稻的非生物胁迫响应。     

一个水稻CCCH型锌指蛋白基因的表达模式分析

利用RT-PCR、生物信息学及其启动区与GUS基因的融合表达分析等方法,分析了一个水稻CCCH型锌指基因OsZF77的表达模式。OsZF77开放阅读框包含843个核苷酸,编码280个氨基酸,含有2个CCCH锌指结构域。RT-PCR分析表明该基因在水稻种子的胚乳中具有较高丰度的表达而在胚中不表达。对OsZF77上游2．5kb左右的启动子区段进行分析发现含有种子特异性表达必需的序列元件RY（CATGCATG）。进一步分析了该基因启动子区段与GUS基因融合表达载体的转基因水稻植株,结果表明GUS在种子胚乳特别是靠种皮的外围胚乳中具强表达,而在胚中检测不到GUS活性。以上结果说明该基因是一个胚乳优势表达基因。     

陆地棉锌指蛋白(GZFP)的原核表达

采用大肠杆菌表达体系来获得陆地棉锌指蛋白(GZFP)的融合蛋白.以pMD18-GZFP质粒为模板,用PCR方法扩增获得GZFP基因的编码区序列,将其克隆到表达载体pET28b(+)中,转化宿主菌BL21(DE3),成功地构建了陆地棉GZFP基因原核表达载体pET-GZFP、经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析和蛋白质杂交检测表明,陆地棉GZFP以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到大量表达.     

玉米锌指蛋白基因ZmLSD1的生物信息学及表达特性分析

为探究锌指蛋白基因ZmLSD1的功能,采用实时荧光定量PCR技术分析在干旱、盐、低温、高温、脱落酸和水杨酸胁迫下根、胚芽鞘、叶部位中ZmLSD1基因的转录表达。结果表明,根中ZmLSD1基因在干旱、盐、高温、低温和脱落酸处理下表达量上升,水杨酸处理导致该基因的表达量降低;在胚芽鞘中,该基因受干旱、盐、脱落酸和水杨酸诱导上调表达,而高温和低温胁迫下基因呈现下调表达;在叶中ZmLSD1基因正向响应干旱、盐和脱落酸处理,但低温、高温和水杨酸条件下基因的表达受抑制。锌指蛋白基因ZmLSD1在玉米的干旱、盐、高温和低温等非生物胁迫响应中发挥了重要作用。     

普通白菜C3H类锌指蛋白基因家族鉴定及表达分析

植物CCCH (C3H)锌指蛋白是一种可识别并结合RNA的蛋白,在植物生长发育、胁迫响应中发挥重要作用。为了了解普通白菜C3H类锌指蛋白家族的特性,通过比对拟南芥C3H类锌指蛋白成员和普通白菜数据库,鉴定普通白菜中C3H类锌指蛋白家族成员,并分析其蛋白质理化性质、系统进化、染色体分布以及在花芽分化阶段不同时期的表达模式。结果显示,共鉴定到84个普通白菜C3H类锌指蛋白家族成员,根据在染色体上的顺序分别命名为BrcC3H1～84,这些成员不均匀地分布在10条染色体上,其中在3号染色体上分布最多,有15名成员;蛋白质理化性质分析表明,该家族成员编码蛋白质氨基酸数量为156～1 542个,理论等电点为4.96～10.84。通过构建系统进化树可将其分为3个亚族,各亚族间基因结构及保守基序差异明显,不同的C3H模型可能是导致差异的重要因素。基因结构分析表明,BrcC3H成员多数含有1个或7个CDS。通过转录组数据对BrcC3H成员在白菜花芽分化不同阶段的表达模式进行分析,发现有21个BrcC3H基因在花芽分化临界期高表达,而在后期表达逐渐降低,其可能参与帮助启动花芽分化。这为进一步研究BrcC3...     

猪BYSL基因克隆、序列特征及表达分析

BYSL基因是哺乳动物胚胎着床和胚胎发育的关键因子。为进一步研究猪BYSL基因的结构与功能,揭示其表达模式,本研究结合基因同源序列克隆技术和RT-PCR方法克隆了猪BySL基因;利用生物信息学软件对该基因进行序列特征和结构分析;利用Real-time PCR技术分析了BYSL基因的时空表达模式。结果表明,猪的BYSL编...     

草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因cDNA的克隆与表达分析

利用快速扩增cDNA末端(rapid amplification cDNA end, RACE)技术获得草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因全长cDNA序列为2 093 bp,含有1个1 944 bp的开放阅读框,5′非编码区长25 bp,3′非编码区长124 bp,可编码647个氨基酸.生物信息学分析表明,在IAP的N端无氨基酸残基组成的信号肽;与斑马鱼的同源性最好,其次是斑猫鲿;在系统进化上,与斑马鱼、斑猫鲿共聚为1支.用半定量RT-PCR分析正常及细菌诱导下草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因在不同组织中的表达分布,正常情况下,凋亡抑制蛋白基因在所取的7种组织中均有表达,其中脑、肠和肾表达最高,肝和心脏次之,鳃和肌肉最低,但差异不显著;用嗜水气单胞菌人工感染24 h后,所有组织中的IAP mRNA水平平均降低约26%,以肝脏和肌肉降低较为明显,在感染48 h后,所有组织中的IAP mRNA水平平均升高约4%,其中心脏、肝脏和鳃分别升高8%、16%、19%,这表明草鱼细胞凋亡抑制蛋白可能参与了机体对嗜水气单胞菌感染的免疫应答.     

草鱼CRP基因全长cDNA的克隆及其表达分析

利用草鱼C-反应蛋白(CRP)的EST序列(CK233056)设计引物,采用快速扩增cDNA末端(SMART-RACE)的方法克隆CRP基因的5′末端,获得1个约520 bp的cDNA片段.将该片段与EST拼接,得到CRP基因全长cDNA,长度为889 bp,含有1个672 bp的开放阅读框,两侧分别有74 bp和143 bp的5′和3′非翻译区域(open reading frame, ORF),CRP基因编码224个氨基酸残基,N端含有15个氨基酸残基的信号肽.利用RT-PCR半定量法对健康及被嗜水产气单胞菌人工感染的草鱼的心脏、脑、前肠、肾脏、肝胰脏、肌肉、脾等组织CRP的mRNA表达水平进行检测,结果表明,CRP基因在7种组织中均有表达,表达水平差异不明显.在人工感染24 h后,各组织中CRP的mRNA水平平均升高5倍左右,与哺乳动物和一些鱼类在炎症反应中血清CRP水平升高一致,而人工感染48 h后,除心脏和肌肉组织中有显著降低外,其他组织没有明显变化,仍维持较高水平.     

玉米病程相关蛋白1基因的克隆与表达分析

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从耐玉米穗粒腐病自交系R15中分离得到病程相关蛋白1(pathogenesis-related protein 1,PR1)基因的开放阅读框,命名为ZmPR1,测序结果显示该序列长为528bp,编码175个氨基酸,其蛋白质分子质量为18.7ku.利用NCBI/Blastp和Genedoc软件进行同源性比对显示,ZmPR1基因编码蛋白与水稻、小麦、拟南芥等高等植物中的PR1蛋白相似性较高,且具有相同的富含半胱氨酸蛋白(cysteine-rich secretory protein,CAP)的保守结构域.将构建的重组载体pET32a(+)-ZmPR1在宿主菌Escherichia coli BL21中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,在不同的诱导时间、诱导温度和IPTG诱导浓度下对诱导条件进行优化.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果表明,ZmPR1基因的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.6mmol爛L-1,诱导温度28℃,且诱导时间对表达量影响不大.免疫印迹(Western blot)检测证实有39ku的融合蛋白表达,表明ZmPR1基因在大肠杆菌中已成功表达,这为蛋白纯化及单克隆抗体的制备提供了一定的基础.     

一个棉花锌结合蛋白质(ZnBP)基因的克隆及原核表达

为了解棉花锌结合蛋白的理化性质及结构特征,从已构建完成的棉花(湘棉18)腺体形成时期的cD-NA均一化文库中筛选出1个棉花锌结合蛋白质(Zinc binding protein,ZnBP)基因的全长cDNA序列。经过克隆、测序及序列分析,发现该片段包含1个完整开放阅读框,长654个碱基,编码217个氨基酸,蛋白质分子量为2.46×104,等电点为9.33。以湘棉18叶片DNA为模板,通过PCR扩增分离获得棉花ZnBP基因。经测序拼接,得到1 731 bp的棉花gDNA片段,编码区含有3个内含子。利用pET-28a(+)载体,开展了该基因的原核表达研究,在37℃、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)终浓度1 mmol/L、诱导时间8 h和转速150 r/min条件下,实现最优表达;SDS-PAGE凝胶电泳及Western blotting检测分析结果表明,蛋白表达正确。     

口虾蛄proPO基因全长cDNA的克隆与组织表达

口虾蛄是海湾底拖网渔业中具有重要经济价值的种类,分布广泛.其自然资源日渐衰退,人工育苗技术获得成功后,口虾蛄养殖过程中病害问题及其防治应引起足够的重视.为此,拟通过分子生物学手段研究口虾蛄免疫系统的核心酶——酚氧化酶(PO)的分子结构及该基因的组织表达,从而在分子水平上深入探究其免疫机理.采用反转录PCR(RT-PCR)与cDNA末端快速克隆(RACE)技术从口虾蛄血细胞中克隆了酚氧化酶原(O-proPO)基因,cDNA全长为2436bp,其中开放阅读框为2142bp,编码713个氨基酸.预测分子量为82446Da,等电点(pI)为8.78.该基因与Genbank上登录的斑节对虾、凡纳滨对虾、罗氏沼虾、短沟对虾、日本对虾proPO基因序列具有较高的同源性,分别为82％、76％、76％、72％、70％.序列分析表明O-proPO为proPO家族中的一个成员,其氨基酸序列中含有多个免疫调节作用位点.系统进化分析显示O-proPO与十足目种类的proPO为同一分支的2个亚群,而后于丰年虫的proPO形成一分支.O-proPO基因表达具有组织特异性,在血淋巴和肠中表达,但在血淋巴中表达量明显高于肠.     

Sequence analysis and expression pattern of AmLEA14 encoding a late embryogenesis abundant protein in Ammopiptanthus mongolicus

从沙冬青叶片EST文库中获得了胚胎晚期发生丰富蛋白（LEA）基因cDNA全长序列,命名为AmLEA14。序列分析表明该基因全长579bp,含有一个459bp编码152个氨基酸的开放阅读框,推测编码的蛋白质分子质量为16.6ku。二级结构预测显示此编码蛋白属于第4类LEA蛋白。系统发生分析表明,此编码蛋白与大豆LEA14蛋白（P46519.1）的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,AmLEA14的表达量在低温、干旱、盐胁迫条件下升高,但是主要在低温胁迫后期富集。推测AmLEA14基因可能在沙冬青抵御低温、干旱、盐胁迫中发挥作用,主要是参与沙冬青的低温防御机制。     

沙冬青胚胎晚期发生丰富蛋白基因序列及表达特性分析

从沙冬青叶片EST文库中获得了胚胎晚期发生丰富蛋白（LEA）基因cDNA全长序列,命名为AmLEA14。序列分析表明该基因全长579 bp,含有一个459 bp编码152个氨基酸的开放阅读框,推测编码的蛋白质分子质量为166 ku。二级结构预测显示此编码蛋白属于第4类LEA蛋白。系统发生分析表明,此编码蛋白与大豆LEA14蛋白（P465191）的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,AmLEA14的表达量在低温、干旱、盐胁迫条件下升高,但是主要在低温胁迫后期富集。推测AmLEA14基因可能在沙冬青抵御低温、干旱、盐胁迫中发挥作用,主要是参与沙冬青的低温防御机制。      

山羊MC4R基因cDNA的克隆和序列分析及组织表达研究

【目的】克隆山羊黑素皮质素受体4(Melanocortin receptor 4)基因(MC4R)的cDNA编码区和部分5′、3′非编码区序列,分析其在不同组织中的表达规律。【方法】以安徽白山羊的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、大肠、小肠、瘤胃、子宫等组织为材料,运用同源序列克隆技术并结合RT-PCR方法,对其MC4R基因cDNA进行克隆,并对其进行了组织表达和生物信息学分析。【结果】克隆得到了山羊MC4R基因全长,包含999bp的完整CDS编码区,共编码332个氨基酸。山羊MC4R基因与绵羊同源性最高(96.9%),其次为牛(93.5%)。山羊MC4R基因在心脏、肝脏等10种组织中均有表达,其中在肾脏组织中的表达量最高,大肠和小肠组织中的表达量最低。MC4R蛋白的相对分子质量为36 444.0u,等电点(PI)为7.52,分子式为C1 664H2 619N413O454S24,含有7个跨膜结构、5个丝氨酸磷酸化位点、4个苏氨酸磷酸化位点和1个特异蛋白激酶的磷酸化位点。MC4R空间结构包括7个α螺旋和5个β折叠。【结论】MC4R基因在动物进化中比较保守,并具有相似的生物学功能。