陆地棉不同纤维发育突变体及其SSR指纹分析

 本研究对3组不同纤维发育突变体的近等基因系，利用SSR分子标记技术，进行了多态性分析及遗传相似性和聚类分析。3组近等基因系分别是：（1）陆地棉遗传标准系TM-1、无绒有絮突变体光子Nn、光子nn、H-154（n2）和毛子NN2-2；（2）无绒无絮突变体徐州142无絮和徐州142；（3）无绒无絮突变体新乡小吉无絮可能是中棉所12或豫棉4号的突变体。本文SSR分子标记和形态学鉴定表明新乡小吉无絮可能来源于豫棉4号，并从分子标记的角度表明了XZ142w突变体与野生型相比较，具有较多基因突变和遗传差异。研究还表明多态性SSR引物能将相似表现型的突变体聚在一起，这说明种质的表型变异度与SSR聚类分析结果间有很好的吻合度，因而，SSR标记技术是分析种质间遗传差异和遗传多样性的有效方法。     

海岛棉与陆地棉不同纤维发育时期苯丙烷代谢相关基因表达差异比较

[目的]比较研究在海岛棉与陆地棉纤维发育过程中苯丙烷代谢相关基因(PAL和4CL)表达模式的差异.[方法]利用荧光定量PCR,检测不同品种来源纤维在不同发育时期目的基因表达量.[结果]发现PAL1及4CL1基因的表达量随纤维发育天数的增加而增加,在陆地棉军棉1号中,基因表达量在15 DPA达到最高,而在海岛棉新海20号中PAL1及4CL1基因的表达高峰期则为20DPA.[结论]发现PAL1基因与4CL1基因的表达模式在海岛棉与陆地棉纤维发育过程中出现差异,海岛棉中两个基因的表达高峰期均晚于陆地棉,为逐步揭示海岛棉和陆地棉纤维品质差异的分子机理奠定了一定实验基础.     

转反义trxs基因小麦籽粒发育过程中基因表达差异

为探讨反义trxs基因在转基因抗穗发芽小麦中的作用机制,以转反义trxs基因和非转基因小麦开花后5~30 d的籽粒为材料,采用mRNA差异显示技术分析了转基因与非转基因小麦在籽粒形成过程中的基因表达差异。结果表明,在籽粒发育过程中,转基因与非转基因小麦存在明显的基因表达差异,差异可归纳为转基因增强型、转基因减弱型、转基因特异型和沉默型4种类型,而且特异型表达明显高于增强型和减弱型;差异条带数随种子成熟度的增加而不断增多,到花后第25天达到最高(77条),然后略有下降,且在胚乳中的差异明显高于胚中的。     

水稻寡分蘖突变体差异表达基因的鉴定和生物信息学分析

一般认为分蘖由QTL控制,对植物侧生组织的研究表明,水稻分蘖的形成可能受激素的控制.以寡分蘖突变体G069与广亲和材料"02428"构建的1对近等基因系02428-ftl为对象,采用RNA差异显示技术分析了此对近等基因系在分蘖前期的基因差异表达.经过片段回收,反式Northern杂交(Re-verse northern blotting)和测序分析,分离得到一个在"02428"中强势表达的基因片段.生物信息学分析表明,该片段与水稻的cDNA和mRNA以及基因组序列高度相似,但没有同源的氨基酸序列,说明该片段处于非编码区:电子延伸序列与多个水稻多肽序列高度同源,含有一个明显的蛋白激酶作用域,但未发现与已报道的基因同源.推测为一未知的调控蛋白.     

mRNA差异显示技术及其在动物发育研究上的应用

mRNA差异显示技术是一种分离表达水平出现差别的基因新技术。将其用于动物生长发育调控基因研究 ,为从分子角度阐明发育机制开辟了新的途径。本文介绍了这一新技术原理 ,及其在动物发育研究上的应用与展望。     

陆地棉子叶基无紫斑突变体的遗传鉴定及其定位

本文对陆地棉的子叶基无紫斑突变体作了遗传鉴定和连锁测验。研究结果表明,这一突变体受一对隐性基因所控制。由于目前国内外还未见到有类似此突变体鉴定的报道,建议把它定名为子叶基无紫斑(cotyledon spotless),基因符号定为cs。连锁测验的结果还表明,红林R_1基因不仅可能对cs表现为显性上位性,两者还可能表现为连锁遗传。F_2和BC_1两群体算得的重组率分别为1.68％,24.03％。因此,cs基因可能和R_1基因一样在第1连锁群、16染色体上。cs基因在第Ⅲ连锁群的排列位置,BC_1、F_2两群体重组率的差异尚在深入研究中。     

鹅肥肝中差异表达基因的筛选、克隆及分析

实验以12只朗德鹅为实验素材,采用mRNA差异显示技术检测填肥组和正常组鹅肝中的差异表达基因.实验结果显示,共获得22条差异表达条带:对其中1条差异表达极显著的片段测序和分析,获得该基因部分mRNA序列731 bp,与鸡和人纤维蛋白原γ(FGG)基因同源性分别为88.78%和76.91%.进一步半定量RT-PCR检测发现,该基因在对照组中表达水平极显著高于填肥组(P＜0.01).该基因在鹅肝中的特异性下调控表达暗示其在鹅脂肪肝形成和耐受中发挥作用,是鹅肝脏脂类代谢研究和肥肝品系选育中重要的候选基因.     

陆地棉纤维品质性状遗传效应的分析

以6个陆地棉品种进行完全双列杂交,采用加性-显性遗传模型,对纤维长度、整齐度、强度、伸长率、马克隆值、反射率、黄度、气纺指标等8个品质性状进行了遗传分析,结果表明长度、强度、黄度等性状主要受制于基因的加性效应,其狭义遗传率分别为59.47%、51.68%、51.95%,均达极显著水平。相对遗传进度表明,马值、长度、强度的选择效果好于其他性状。亲本和杂交组合遗传效应预测值表明,在纤维品质中贝尔斯诺是较好的杂交亲本,29-1×贝尔斯诺为较好的杂交组合。     

陆地棉与海岛棉纤维发育的比较研究 Ⅰ.棉纤维的分化

对大田生长的陆地棉(Gossypium hirsutum L.)和海岛棉(G.bardadense L.)7个品种的纤维分化进行的比较研究表明,各供试品种首先在珠柄顶部突起纤维细胞,后在合点区和腰区,最后在珠孔区。纤维突起的时间和开花当天的 F/E 值(胚珠上纤维细胞数与胚珠表皮细胞总数的比值)因种和品种而异,纤维开始突起的时间与铃期有关。温度影响纤维的分化并最终影响单粒种子上的纤维量,纤维分化的最适温度为25～30℃。     

棉花SVP-like基因GhMADS29的克隆与表达分析

[目的]研究棉花中SVP类基因的功能。[方法]通过同源克隆的方法在陆地棉中棉所36中克隆SVP的同源基因GhMADS29,对其进行Blast搜索比对和进化树分析以及荧光定量的表达模式分析。[结果]GhMADS29与猕猴桃的SVP4基因相似度最高,其cDNA序列含有9个外显子、8个内含子,不同时期顶芽的荧光定量结果表明它在花芽分化起始期的花芽中表达量最高,且不同组织的荧光定量分析表明它在叶片和顶芽中表达量较高。[结论]首次获得棉花SVP亚族基因,命名为GhMADS29,其GeneBank登录号为JQ682642。     

陆地棉CAD基因家族的进化和表达分析

[目的]对陆地棉CAD基因家族成员进行进化和表达分析,了解其在棉纤维发育中的作用.[方法]应用生物信息学方法,从棉花基因组中筛选出21个CAD基因,并对CAD的基因结构、染色体分布、基因倍增模式以及系统进化进行分析.利用深度表达数据分析CAD基因在棉纤维发育各时期的表达.对比观察拟南芥cad5突变体和野生型根毛表型.[结果]同源性高的CAD基因复制对之间有相似的基因结构;片段重复和串联重复是CAD基因扩增的主要方式.进化分析可知,CAD基因可分为七个亚组,且功能相近的基因聚类在相同亚组.利用深度测序表达数据分析可知,CAD基因在棉纤维各个发育时期均有表达.对比拟南芥cad5突变体和野生型根毛发现,突变体相比于野生型有更长的根毛.[结论]CAD基因参与了棉纤维的发育的过程,并对棉花纤维发育起到一定的调控作用.     

陆地棉LTP家族基因的克隆与表达分析

长链脂肪酸能够通过调节胚珠内源乙烯信号变化来促进棉花的起始和伸长发育,为深入了解棉花脂肪酸的转运过程及参与基因,对棉花全基因组进行了分析,克隆了11个脂质转运蛋白。实时荧光定量PCR证实:LTP6, LTP7, LTP9, LTP11 4个基因在纤维起始时期（野生型与突变体之间）的表达存在差异,这4个基因可能与纤维起始发育有关。通过基因组步移技术克隆了Gh-LTP6基因的启动子,并对其结构进行分析,发现其具有多个MYB结合位点。这些结果为深入研究LTP基因在纤维起始过程中的角色奠定了基础。     

棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的克隆及表达分析

【目的】克隆棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的cDNA序列,并利用原核表达系统高效表达融合蛋白,检测融合蛋白的精氨琥珀酸合成酶活性及其表达对工程菌生长、耐盐能力及与游离L-瓜氨酸（L-Cit）和L-精氨酸（L-Arg）含量的影响,为解析该基因的功能及作用机制奠定基础。【方法】以拟南芥推断的精氨琥珀酸合成酶cDNA序列作为探针,利用电子克隆和RT-PCR技术,从棉花幼叶中获得cDNA片段,T/A克隆测序后得其序列信息,利用生物信息学软件分析其DNA结构、蛋白质结构、功能域和同源性,并构建系统进化树。利用qRT-PCR检测其在盐胁迫下的表达模式;将GhASS1的开放阅读框连接到原核表达载体pCold-TF上,构建融合表达载体pCold-GhASS1,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中进行IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE法测定表达产物分子量,焦磷酸荧光法测定酶活性和比活力,HPLC法测定工程菌中L-Cit和L-Arg的含量,对比不同温度和不同NaCl浓度下工程菌与对照菌的生长速度及其体内L-Cit、L-Arg含量及L-Arg/L-Cit。【结果】棉花GhASS1存在于D基因组的第1染色体上,由10个外显子和9个内含子构成,其cDNA全长序列共1 584 bp,其中5′非翻译区22 bp,开放阅读框1 485 bp,3′端非翻译区77 bp,编码产物由494个氨基酸组成,推断分子量为54 kD,等电点6.74;序列比对分析表明GhASS1与大肠杆菌、酵母和拟南芥中同源蛋白序列一致性分别为21.81%、41.1%和78.5%,且具有典型的精氨琥珀酸合成酶结构模序;系统进化分析显示GhASS1与番茄、马铃薯和烟草中同源蛋白亲缘关系最近,而与云杉、卷柏中同源蛋白亲缘关系最远;盐胁迫可上调叶片中GhASS1的表达,1 d时达到峰值,随后逐渐下降,推测GhASS1参与棉花对盐胁迫的早期响应。表达载体pCold-GhASS1在工程菌中表达的融合蛋白分子量约108 kD,与预期相符,在体外具有精氨琥珀酸合成酶活性;与对照菌相比,pCold-GhASS1工程菌中游离L-Cit含量下降,L-Arg含量上升,且在生长周期中较快进入对数生长期;在含高浓度NaCl的培养基中pCold-GhASS1工程菌表现出更强的生长活力和较高的L-Arg/L-Cit值,显示了其具有较强的L-Cit向L-Arg的代谢流。【结论】从棉花中克隆了植物精氨琥珀酸合成酶基因cDNA序列GhASS1,推测其在植物体内可参与植物的生长和耐盐能力的调控。     

棉花S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及表达分析

利用i TRAQ技术从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)HM-40中筛选并克隆到S-腺苷甲硫氨酸合成酶Gh SAMS基因。Gh SAMS基因的开放阅读框全长为1 182 bp,编码393个氨基酸,预测Gh SAMS蛋白质含有15个磷酸化位点,推测其功能的行使可能与激酶磷酸化相关,进化分析表明S-腺苷甲硫氨酸合成酶与茶树(Camellia sinensis)的SAMS蛋白质相似性最高。q RT-PCR分析表明,在接种黄萎病菌VD07菌系后,Gh SAMS表达量逐渐增加,随着接种时间的延长,其相对表达量随之增加,推测其在陆地棉抗黄萎病防卫反应中可能起重要作用。在嫁接棉株中,利用VIGS技术成功地沉默Gh SAMS基因,然后对沉默棉株接种黄萎病菌VD07,鉴定其病情指数为62.5,抗性级别为感病;而转化空载体和未接种载体处理的嫁接棉株病情指数分别为30.0和31.2,抗性级别为耐病,表明Gh SAMS基因沉默后嫁接棉对黄萎病的抗性丧失。推测Gh SAMS基因在陆地棉抗黄萎病的过程中可能起重要作用。     

陆地棉COR基因在低温胁迫下的表达分析及功能鉴定

【目的】分析低温胁迫条件下陆地棉中COR家族成员的表达特性,研究参与低温胁迫信号途径的COR基因。【方法】通过Real-time PCR分析低温胁迫条件下,陆地棉COR基因家族成员的表达情况,利用VIGS技术鉴定响应低温胁迫的COR基因功能。【结果】对8个COR基因家族成员在低温条件下的表达分析显示,基因序列号为Gh_D12G0215的COR基因受低温诱导表达水平不断上调,并在处理48 h后表达量较对照上调了近9倍;与之相反,基因序列号为Gh_D06G0147的COR基因在低温诱导3 h左右表达水平出现短暂的上调,但随后其表达受到显著抑制。其余COR基因家族成员的表达受低温胁迫表达水平发生改变,但是随着胁迫时间的增加,转录水平与对照无明显差异。利用VIGS技术在棉花中沉默候选COR基因Gh_D12G0215,并将基因沉默后的棉苗与对照共同进行低温胁迫处理,在相同的处理条件下,Gh_D12G0215基因沉默后的植株与对照相比,对低温胁迫更为敏感,基因序列号为Gh_D12G0215的COR基因可能参与棉花耐低温的调控。【结论】在低温胁迫条件下,陆地棉中部分COR基因的表达受低温胁迫诱导,在陆地棉受到低温胁迫时发挥功能。     

一个棉花雄性不育突变体的遗传分析

12-20A是在新陆早33号优系中发现的一个雄性不育突变材料,为了明确其雄性不育性状的遗传规律,对该突变体进行了初步遗传分析。用12-20A做母本,分别与其它正常可育材料构建了8个F2群体和5个BC1群体。结果表明,8个群体的F1表现为完全可育,F2群体可育与不育性状表现为3:1的分离;BC1群体表现为完全可育,无不育性状的分离表现。初步分析表明:12-20A不育性状表现为由单基因控制的隐性细胞核不育。     

陆地棉Ghuhrf1基因及其启动子的克隆与功能分析

在分子育种过程中,优良基因和组织特异表达启动子的缺乏是制约棉花纤维品质改良的重要因素之一。分析转录组数据库中差异基因表达谱发现,Ghuhrf1为开花当天胚珠优势表达基因,推测该基因可能参与或调控棉纤维的合成。根据其EST序列设计引物,通过RACE技术获得Ghuhrf1基因的全长cDNA序列。荧光定量PCR分析表明,Ghuhrf1在开花当天的胚珠中显著表达。通过同源序列分析获得Ghuhrf1的上游启动子Ghuhrf1 Pro。Ghuhrf1 Pro全长为1 417 bp,含有GC box、CAAT box、CAT box、CCGTCC box和ACGT motif等顺式作用元件和组织特异性调控元件。根据组织特异性调控元件的分布位置构建了4个不同程度的缺失体转化烟草和拟南芥进行分析。GUS组织化学染色结果表明,全长启动子Pro和缺失体Pro1（-1 180～+226 bp）、Pro2(-867～+226 bp)、Pro3(-726～+226 bp)都能特异地驱动Gus基因在转基因拟南芥的叶片边缘尖部和莲座叶基部等分化生长旺盛部位表达,说明与分生组织表达相关的CAT box元件和CCGTCC box元件在启动子种子特异表达中起到重要的作用。同时,通过启动子缺失分析也表明,Ghuhrf1基因可能不是直接参与棉纤维的合成,而是间接的参与棉纤维原始细胞分化起始的调控。该结果为棉花纤维品质基因Ghuhrf1的功能研究提供了参考,并为棉花分子育种工程提供了新的调控元件。