苦荞叶总黄酮提取纯化工艺研究

[目的]合理开发利用苦荞麦生物资源,延伸苦荞产业链,提高其经济效益;探索适合苦荞叶黄酮工业化生产的工艺方法。[方法]以盛花期的苦荞叶为原料,采用超声波辅助法提取总黄酮,并通过大孔树脂吸附法进行纯化,对提取、纯化工艺进行了优化。[结果]总黄酮最佳提取工艺为:以60%的乙醇为提取剂,提取温度为72℃,料液比为1∶32g·mL~(-1),超声波处理时间为31min,超声波功率为101 W,此工艺条件下苦荞叶总黄酮得率为10.2523%;AB-8树脂对苦荞叶总黄酮纯化效果最好,最佳纯化工艺为:上样液pH为5,浓度为1.50g·L~(-1),流速为1.00mL·min~(-1),上样量为33mL·g~(-1)树脂,洗脱液为75%乙醇,洗脱液pH为5,流速为1.50mL·min~(-1),洗脱液用量为10mL·g~(-1)树脂,测得苦荞叶黄酮的回收率为77.01%,黄酮纯度为90.6%,是纯化前的3.02倍。[结论]苦荞叶中总黄酮的含量高,且易纯化;该提取、纯化工艺可满足工业化生产高效益、低成本、简单易操作的需求,为其工业化生产提供理论依据。     

苦荞查尔酮合成酶多克隆抗体制备及组织表达分析

苦荞查尔酮合成酶(FtCHS)是黄酮类化合物合成过程中的限速酶之一,在苦荞黄酮类次生代谢物合成中起到重要作用。以苦荞种子灌浆期cDNA为模板,采用RT-PCR方法克隆获得FtCHS基因,通过生物信息学分析确定FtCHS的截短抗原基因序列(TrCHS)。再通过原核表达、亲和层析等方法制备并纯化TrCHS抗原,以纯化的抗原免疫大白兔获得TrCHS的多克隆抗体,利用半定量RT-PCR、Western blotting方法分析苦荞不同器官FtCHS的表达情况。结果表明,成功克隆FtCHS基因开放阅读框(ORF)大小为1 182 bp,共编码393个氨基酸,通过原核表达获得TrCHS抗原的分子质量约34.71 ku,所制备的多克隆抗体具有较高的特异性,FtCHS基因在苦荞叶子、种子的表达量明显最高。     

大孔吸附树脂纯化苦荞多肽工艺研究

【目的】研究苦荞多肽纯化工艺和抗氧化活性。【方法】以大孔吸附树脂吸附率和解吸率为考察指标,对5种大孔吸附树脂(AB-8、D101、HPD600、ZCX-11和S-8)进行筛选,通过动态吸附-解吸单因素试验和正交试验优化大孔吸附树脂最佳纯化工艺,并测定大孔吸附树脂纯化前后苦荞多肽的超氧化物歧化酶活力、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐和1,1-二苯基-2-苦基肼清除能力。【结果】从5种大孔吸附树脂中筛选出S-8为最佳大孔吸附树脂,其吸附率和解吸率分别为71.25%、89.00%;在上样质量浓度为5 mg/mL,洗脱流速为1.5 mL/min,乙醇体积分数为55%的条件下,苦荞多肽纯度由粗提液的22.18%提高到70.00%;纯化后苦荞多肽超氧化物歧化酶酶活力显著增加,从原来的26.20 U/mL升高到40.37 U/mL,对2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐和1,1-二苯基-2-苦基肼抑制率显著升高,分别是粗提液的2倍与1.4倍。【结论】优化后的工艺条件可使苦荞多肽的纯度显著提高,且纯化后苦荞多肽抗氧化活性显著增强。     

陕北苦荞麦炒制前后不同部位黄酮含量的测定及分离

目的:分离陕北产苦荞麦中的黄酮,并测定比较苦荞麦在经炒制前后植株不同部位的芦丁含量。方法:采用酸碱法提取分离纯化苦荞黄酮,采用分光光度法测定苦荞炒制前后植株不同部位黄酮含量及苦荞黄酮提取物的纯度。结果:测得生苦荞中苦荞黄酮含量为17.19 mg·g~(-1),熟苦荞为17.29 mg·g~(-1),生苦荞仁为25.19mg·g~(-1),熟苦荞仁为28.96 mg·g~(-1);测得所分离的苦荞黄酮纯度为84%。结论:陕北苦荞含有丰富的苦荞黄酮,其中熟苦荞仁苦荞黄酮含量最高,熟苦荞仁适宜作为苦荞降糖服用时的有效部位和炮制制品。     

牡蛎糖蛋白的纯化分离研究

用DEAE-52阴离子交换柱提取、纯化牡蛎糖蛋白,分离纯化的牡蛎糖蛋白命名为糖蛋白GⅠ,糖蛋白GⅡ。用葡聚糖凝胶柱层析分别分析纯化糖蛋白GⅠ,糖蛋白GⅡ,结果表明:牡蛎糖蛋白GⅠ中分离出1种糖蛋白组分GⅠ-1;牡蛎糖蛋白GⅡ纯化出4种糖蛋白组分(GⅡ-1,GⅡ-2,GⅡ-3,GⅡ-4),GⅠ-1为未经洗脱的透过峰,该组分可能是糖蛋白凝聚体,由凝胶电泳分析估算得知GⅠ-1,GⅡ-1,GⅡ-2,GⅡ-3的分子量分别为42.5kDa,100.0kDa,55.3kDa,41.4kDa。     

干旱胁迫与复水对苦荞生长及叶片内源激素含量的影响

以耐旱型苦荞(迪庆苦荞)和旱敏感型苦荞(黑丰一号)为试验材料,采用盆栽人工控水试验,研究了干旱胁迫与复水对不同耐旱型苦荞品种的生理及形态指标的影响,为苦荞的抗旱稳产栽培提供理论依据。结果表明:干旱胁迫显著影响了苦荞生长,表现为株高、茎粗、叶面积、茎叶干重、根系体积、根系表面积、根系平均直径、根系干重、根系活力、根系可溶性蛋白含量均显著低于对照;花期复水后影响得到缓解,表现为各项指标均有所恢复。其中,茎叶干重恢复最佳,干旱胁迫下的迪庆苦荞与黑丰一号相比,茎叶干重增加了54.81%,复水处理与干旱处理相比,迪庆苦荞和黑丰一号分别显著增加了83.78%、47.28%。根系超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、丙二醛含量、迪庆苦荞的根系可溶性糖含量和游离脯氨酸含量均显著高于对照处理。干旱胁迫下苦荞叶片生长素(indole-3-acetic acid,IAA)含量显著降低,脱落酸(abscisic acid,ABA)含量显著升高,复水处理与干旱胁迫相比,迪庆苦荞和黑丰一号的IAA含量分别显著增加了25.50%、21.19%,ABA含量分别降低了20.15%、18.18%,表明复水有效地缓解了干旱对内源激素的影响。干旱抑制了苦荞的生长,但复水使两个品种的苦荞均产生了等量补偿效应和部分补偿效应,且耐旱品种(迪庆苦荞)的恢复程度比旱敏感品种(黑丰一号)更好。     

苦荞二倍体及其同源四倍体减数分裂过程的稳定性与花粉育性

【目的】探明苦荞二倍体及其同源四倍体苦荞花粉母细胞减数分裂过程的稳定性与花粉育性，为苦荞多倍体育种提供参考。【方法】观察和统计八宿苦荞、WN047、WN090、武岗苦荞、WN065、川荞1号、二季早、黔威1号、晋苦2号、六荞1号、KP9920和黔威2号12个苦荞二倍体和苦荞四倍体花粉母细胞减数分裂过程中期I(MI时期)染色体配对构型、末期Ⅱ(TⅡ时期)的细胞异常程度及花粉粒败育性指标，分析比较二倍体和苦荞四倍体差异性。【结果】12个苦荞二倍体染色体配对构型主要为2n=2x=8II,占比95.42%,无双核仁；同源四倍体染色体构型多数为2n=4x=8IV,占比79.05%,有双核仁(占比18.6%)。12个苦荞二倍体在TⅡ期异常细胞频率平均为4.34%,细胞平均微核数为0.043 4个，不同材料间差异不显著；同源四倍体异常细胞频率平均为24.09%,细胞平均微核数平均0.494 9,不同材料间存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)差异。12个苦荞二倍体花粉败育率平均9.54%,不同材料间存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)差异；同源四倍体花粉...     

苦荞C4H基因的cDNA克隆及生物信息学分析

[目的]为了解植物苯丙烷类代谢途径中关键酶——肉桂酸-4-羟基化酶基因结构特征及系统进化,拟克隆苦荞肉桂酸-4-羟基化酶(Cinnamate-4-hydroxylase,C4H)基因并进行生物信息学分析。[方法 ]本研究通过RT-PCR技术,克隆2个苦荞C4H基因cDNA和DNA序列,并通过生物信息学分析其基因结构及蛋白理化性质,最大似然树法构建系统进化树。[结果]2个基因cDNA序列长度分别为1 812bp和1 476bp,各编码504和491个氨基酸残基。其DNA序列分别为2 774bp和2 364bp,均包含3个外显子和2个内含子,第1个外显子和2个内含子序列长度存在明显差异。蛋白分子量分别为58.002kDa和56.401kDa,等电点分别为9.18和9.09。2个基因编码氨基酸与苦荞肉桂酸-4-羟基化酶同源性分别为99%和86%,故暂且命名为FtC4H1和FtC4H2。FtC4H1和FtC4H2与其他物种直系同源蛋白聚为两类,FtC4H1和FtC4H2与莴苣和丹参同源蛋白亲缘关系较近,氨基酸序列同源性分别为88%和84%。[结论]本研究通过对苦荞2个C4H基因的核酸、氨基酸序列、蛋白结构及系统进化树进行分析,为后续苯丙烷代谢途径及荞麦基因挖掘利用提供理论基础。     

膜分离技术纯化番茄皮色素提取液的研究

从截留分子量为30 kDa的再生纤维素膜,孔径为0.2μm的聚偏氟乙烯膜、聚四氟乙烯膜、聚醚砜膜中筛选耐乙酸乙酯腐蚀的膜材料及提取液膜纯化的工艺条件。结果表明,截留分子量为30 kDa的再生纤维素膜是番茄皮色素提取液纯化的最适膜材料,纯化过滤最优条件为:压力0.10 MPa、温度35℃。应用膜分离技术纯化番茄皮色素提取液可使杂质截留率平均达到60%以上,而色素损失率在10%以内。     

叶面喷施硼肥对苦荞根际土壤养分、植株生长及产量的影响

[目的]探讨叶面喷施硼肥对苦荞植株形态及产量的影响,为制定苦荞合理施肥技术措施提供参考依据.[方法]以苦荞品种晋荞2号为试验材料,在现蕾期喷施不同浓度(12、24和48 mg/L)的硼肥水溶液,以喷施等量清水为对照,测定并分析苦荞根际土壤养分含量、成熟期苦荞根系形态和农艺性状指标及产量.[结果]随施硼量的增加,成熟期苦荞根际土壤的速效氮含量先升高后降低再升高,速效磷含量先降低后升高再降低,速效钾含量和pH整体上呈降低趋势,有机质含量整体上呈升高趋势.叶面喷施一定浓度的硼肥溶液有助于苦荞根系的伸长,增加苦荞的株高、子叶节高度、主茎节数和主茎分枝数,进而提高其产量.当硼肥喷施浓度为12 mg/L时,苦荞的根长(137.06 cm)、株高(124.50 cm)、主茎分枝数(8.33个)和产量(1416.042 kg/ha)达最大值.相关性分析结果表明,苦荞的株高与产量呈极显著正相关(P<0.01).[结论]叶面喷施不同浓度的硼肥水溶液对苦荞植株形态及产量均有一定影响,现蕾期喷施12 mg/L浓度硼肥有利于苦荞的生长,可显著提高产量.     

比较免疫磁珠法与A蛋白亲和层析法纯化兔抗血清中的IgG

优化了免疫磁珠分离法纯化抗血清的实验条件,并与A蛋白亲和层析法比较纯化效果,以求得到一种简便、快速、高效的纯化IgG方法.结果表明：从5只新西兰兔获得210 mL试管凝集效价高达1∶5 120的兔抗鳗弧菌抗血清,磁珠与IgG结合10 min达到平衡,其最大结合量为0.227 mg/mL;免疫磁珠分离法与A蛋白亲和层析法得到的IgG纯度都很高,经过SDS-PAGE电泳都只得到25 ku和55 ku左右的两条带;免疫磁珠分离法得到的抗体ELISA效价高于A蛋白亲和层析法;免疫磁珠分离法反应所需时间（10 min）小于A蛋白亲和层析法所需的20 min,其得率（11.5 mg/mL）也高于A蛋白亲和层析法的10.25 mg/mL.     

大蒜超氧化物歧化酶的分离纯化及其性质的研究

以壳聚糖为基质的金属螯合亲和层析法纯化大蒜SOD ,得到比活为 1191U/mg的酶蛋白 ,回收率为 71% ,纯化倍数为7.2 9。实验表明 ,经 8mol/L的尿素处理后大蒜SOD活性不发生变化 ,并且可耐 6 0℃高温 1h而活性不下降     

蓖麻毒蛋白的分离纯化和毒理作用研究

经(NH4)2SO4沉淀,分子筛层析和亲和层析等处理,从去壳蓖麻籽中分离纯化得到蓖麻毒蛋白,在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈32kDa和34kDa两条蛋白带,证明该蓖麻毒蛋白已被纯化至均一。用等电聚焦法测出该蓖麻毒蛋白的等电点为pI6.1和pI6.7。高效液相色谱测出该蓖麻毒蛋白在非变性条件下有五个峰,表明蓖麻毒蛋白可能存在五个不同的多聚态。动物实验表明该蓖麻毒蛋白对小白鼠有较强的毒性,但对斜纹夜蛾幼虫无毒杀作用。     

用Protein A亲和层析法快速分离纯化鲫血清IgM方法的建立和应用

采用Protein A亲和层析法对鲫Carassius auratus血清中的IgM进行快速分离纯化,所得产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blotting）进行分析检测。结果表明：采用Protein A亲和层析法可以很好地分离到高纯度的鲫血清IgM,电泳条带中重链和轻链清晰可辨,重链、轻链的相对分子质量分别为85 000、25 000左右,无明显杂带;利用纯化的鲫血清IgM免疫小鼠,获得了高效价抗IgM抗血清,可以特异性识别鲫血清和黏液中IgM重链。应用间接ELISA方法对浸泡免疫后的鲫血清和皮肤黏液中抗体的动态进行检测,结果显示：鲫皮肤黏液中的抗体滴度在免疫后第6天达到峰值,血清中抗体滴度在免疫后第15天达到峰值,前者高峰期出现较早,但持续时间短,后者高峰期出现较晚,但持续时间较长。本试验中所建立的Protien A亲和层析法为鱼类抗体制备、病原检测及免疫学相关研究提供了一种便捷的方法。     

海栖热袍菌极端耐热木聚糖酶B的提纯

克隆并在大肠杆菌中表达的海栖热袍菌的 xyn B基因 ,其表达产物木聚糖酶 B的 C 末端带有 6×His标签 ,研究了这种基因重组酶的提纯方法。通过对粗酶提取液的热变性处理 ,Ni NTA亲和柱层析和离子柱层析 ,最终得到了电泳纯的木聚糖酶 B,提纯倍数 4 4.4 ,得率 11。SDS PAGE法测定木聚糖酶 B的相对分子质量为 4 2 ku,与理论推算值 4 2 333u相吻合     

重组猪干扰素α的纯化工艺研究

[目的]研究重组猪干扰素α的纯化工艺,为进一步研究该蛋白的分子结构及rPoIFN-α标准品的制备奠定基础。[方法]将含重组菌E.coliBL21诱导表达后得到的粗制rPoIFN-α,分别用2种方案进行纯化。方案1,依次用GST亲和层析法、DEAE阴离子交换法及分子筛法层析三步法进行纯化;方案2,依次用GST亲和层析和分子筛法层析两步法进行纯化。纯化结果用SDS-PAGE及Western-blot进行纯度检测及鉴定。[结果]诱导表达后的表达产物经SDS-PAGE检测,发现在45Kd分子量处有目的条带,Western-blot检测有特异性条带。通过两步法纯化后的rPoIFN-α纯度达96%,蛋白得率为42.8%,三步纯化纯度为98.8%。[结论]两步法得到的蛋白纯度非常接近三步法,但与三步法相比工艺更为简单方便。     

冬小麦中玉米赤霉烯酮结合蛋白的分离纯化

玉米赤霉烯酮是植物体内源产生的一类小分子生理活性物质，已证明它与冬性植物的春化作用密切相关。本研究应用亲和层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对春化的冬小麦幼苗中的玉米赤霉烯酮结合蛋白进行了分离纯化。供试材料为冬小冬品种燕大1817，种子萌发后在4℃一春化4周，提取幼苗的水溶性总蛋白进行亲和层析。层析基质为琼脂糖凝胶Sepharose4B，配体为玉米赤霉烯酮多聚赖氨酸复合物。总蛋白溶液先经过Sepharose4B结合后，再与连有配体的亲和胶进行反应，然后洗去非结合蛋白；改变洗脱条件，进一步洗涤得到的为玉米赤霉烯酮结合蛋白（ZBP）溶液。研究结果表明，在春化的冬小麦幼苗中存在两种玉米赤霉烯酮结合蛋白，它们的分子量分别为25.4kD和22.9kD。     

微生物蛋白激发子PeaT1的获得及诱导水稻抗旱性的初步研究

PeaT1是来源于极细链格胞菌（Alternaria tenuissima）的一种蛋白激发子,具有促进植物生长和提高抗逆性的功能。为了进一步研究该激发子的功能,构建了表达该蛋白质的原核表达载体pET28a-peaT1,诱导表达获得大量目的蛋白质。利用AKTA蛋白质纯化系统,通过亲和层析、离子交换层析和分子筛等纯化技术,获得高纯度的PeaT1蛋白。用不同浓度的纯化蛋白处理水稻,进行抗旱性检测,结果表明PeaT1可明显提高水稻的抗旱性。     

胸腺肽α1的温度诱导原核可溶性表达与简易纯化

 将人工合成的人胸腺肽α1（Tα1）基因插入到载体pBV222,转化大肠杆菌DH5α菌株并置42℃诱导表达可溶性融合蛋白。融合蛋白经镍亲和层析柱纯化,加入肠激酶切割,再将酶切反应体系回到镍亲和层析柱。所获穿过液中的重组胸腺肽α1（rTα1）,经十二烷基硫酸钠-聚苯烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE）和反相高效液相色谱（RP HPLC）分离及分析,纯度分别为94.5%和72%。以癌症患者外周血淋巴细胞开展玫瑰花环试验,所获rTα1纯品显示出与化学合成Tα1（sTα1）相同的生物学活性。     

猪链球菌2型epf基因的原核表达及其蛋白纯化

为了克隆、表达SS2菌株轲基因片段,分析蛋白活性,根据GenBank SS2 epf基因序列设计引物,克隆epf基因片段并进行序列分析,构建原核表达质粒pGEX4T-2-epf,在大肠杆菌中诱导带有GST标签的融合蛋白rEF-GST的表达;亲和层析法纯化融合蛋白rEF-GST,用凝血酶切除重组蛋白中的GST,获得纯化的EF抗原。经Westernblot鉴定,EF可与SS2多克隆抗血清发生特异性反应。