鸡传染性法氏囊病超强毒Gx及其致弱株基因组B节段的克隆和序列分析

用蛋白酶K法分离提取了鸡传染性法氏囊病病毒强毒株Gx及其致弱株Gt的病毒核酸dsRNA,应用随机引物将RNA反转录成cDNA,以此为模板用长距离一步法扩增出全长基因B节段,将其克隆入PMD18-T载体,进行了测序,并用DNAStar软件进行序列分析.测序结果表明,克隆的Gx株B节段全长为2 827bp,与超强毒参考株UK661的同源性为88.2%,与强毒参考株Harbin-1株的同源性达96.3%;克隆的Gt株B节段全长为2827bp,与弱毒参考株P2的同源性达99.5%.而Gx株与Gt株B节段的核苷酸的同源性只有89.8%;vvIBDV-Gx、IBDV-Gt株B节段全长的获得将为进一步构建感染性分子克隆奠定必要的基础.     

传染性法氏囊病病毒中间株有关特性的研究

CEF－9是传染性法氏囊病病毒超强毒株vvIBDV-Gx在鸡胚成纤维细胞上传代致弱过程中的第9代毒。我们对其分子生物学及生物学特性进行了研究，结果表明其VP2基因序列即具有超强毒的特性，又兼有部分致弱毒的特征；其致病性介于超强毒株和致弱株之间；在体内外均不稳定的，体外继续传代可继续致弱，回归体内可迅速返强。这说明CEF－9是vvIBDV驯化时，毒力强弱转化的中间过渡形式。     

鸡传染性法氏囊病超强毒Gx与疫苗毒Gt在鸡体内的复制研究

本试验利用鸡传染性法氏囊病超强毒Gx及其致弱疫苗毒Gt为对象,研究超强毒与弱毒株在鸡体主要免疫器官内的复制情况,以探讨两类毒株表现不同生物特性的原因。分别利用鸡胚半数致死量和鸡胚成纤维细胞半数感染量对超强毒Gx和疫苗株Gt进行病毒滴度的测定;再利用荧光定量RT-PCR对两类毒株进行病毒量的校准。以相同量的病毒对2周龄SPF鸡进行攻毒。攻毒试验表明超强毒Gx能造成47.5%的死亡,法氏囊、脾脏、胸腺等免疫器官均严重损伤;而疫苗毒Gt无致死,且未能造成任何病理可见的损伤。病毒的体内复制情况表明超强毒相对于疫苗毒复制更为迅速,病毒载量更高。     

1株基因3型鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒株的培育

为研发基因3型鸭甲肝病毒(Duckhepatitis virustype3,DHAV-3)的弱毒活疫苗,用SPF鸡胚对DHAV-3Y株进行了连续传代致弱,由此获得第80代鸡胚适应毒。致病性试验结果显示,第80代毒株对1日龄雏鸭已无致病性。免疫攻毒保护试验显示,雏鸭在1日龄时经肌肉注射途径免疫第80代鸡胚适应毒,能有效抵抗7日龄时的强毒感染,保护指数为100%。表明第80代鸡胚适应毒是一株具有良好免疫原性的鸡胚化弱毒疫苗候选株。     

甲型H1N1流感病毒株的分离鉴定以及PR8株的相关基因对重组病毒增殖能力的影响

为分离流感病毒,本研究将疑似甲型流感患者的咽喉拭子接种SPF鸡胚尿囊腔,经检测收获的鸡胚尿囊液具有血凝活性.采用流感病毒通用引物进行PCR扩增出8个基因节段,经测序与GenBank中登录的序列比对后确定该病毒株为2009年爆发的甲型H1N1流感病毒,并命名为A/Harbin/LM/2009 (H1N1),简称LM株.由于LM分离株在鸡胚中增殖能力比较弱,为提高其在鸡胚中的增殖能力,我们利用反向遗传技术将LM株的HA和NA基因与高增殖特性的人流感病毒细胞高产株PR8的另外6个节段进行“6+2”重配,获得拯救病毒,但该重配病毒血凝价并未显著提高.为进一步鉴定影响病毒增殖能力的基因,本研究将LM株所有节段以“7+1”的方式逐一与PR8的7个片段搭配构成完整的流感病毒基因组,分别得到8个重配病毒.结果显示分离株的PB1、PA、HA基因显著降低了重配病毒在鸡胚细胞中的增殖能力.     

传染性法氏囊病病毒自然重配株全基因组序列分析

从具有新的流行病学特征的传染性法氏囊病（IBD）发病鸡群中分离到2株传染性法氏囊病病毒（IBDV）,分别命名为QL和ZZ—ll,对4周龄SPF鸡的致死率分别为94％和86％。为分析该毒株的分子生物学特征,对其全基因组序列进行了测定,2个病毒株基因组A节段长度为3260bp、B节段长度2827bp。病毒演化分析结果显示2个病毒基因组A节段的核苷酸序列与已发表的强毒株序列的同源性分别为96．8％～98．1％和96．9％～98．4％,处在IB—DV超强毒株分支上;而B节段与已发表的弱毒株序列的同源性分别为89．7％～90．4％和90．0％～90．7％,位于弱毒株分支上。IBDV超强毒株和弱毒株序列特征氨基酸残基与基序分析表明,QL和ZZ—11两个病毒株的A节段VP2基因的氨基酸残基为222A、249Q、253Q、254G、256I、294I和299S,七肽基序为SWSASGS,均符合超强毒株的分子特征;而B节段777～782位核苷酸序列为GGTGCC,没有KpnI酶切位点,具有弱毒株的序列特点。以上分析结果表明,QL和ZZ—11为IBDV自然重配株,A节段源于超强毒株,而B节段源于弱毒株。     

鸽源传染性法氏囊病病毒的分离鉴定及其A、B节段序列扩增

目的:分离鉴定鸽源传染性法氏囊病病毒(IBDV),扩增其基因组A、B节段cDNA.方法:采用SPF鸡胚尿囊腔接种分离IBDV,RT-PCR鉴定并扩增A、B节段全基因组DNA,进行同源性比较,初步分析分离株序列特征.结果:该分离株经RT-PCR特异性鉴定引物鉴定为强毒株,与强毒株相比,核苷酸序列同源性达97%,氨基酸序列同源性99%.     

一株新城疫病毒弱毒株的分离鉴定

于１９９６年８月从长春地区－－养鸡场分离到一株新城疫病毒,该毒株经过鸡胚传代培养,病毒形态学观察,血凝谱测定、鸡胚平均致死时间试验、鸡脑内致病指数试验、脉致病指数试验及１入毒试验等生物学特性结果表明该新城商株为弱毒株。     

鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株感染性分子克隆的构建

本研究以鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株(野毒株)基因组为模板,用蛋白酶K法提取病毒基因组核酸dsRNA,在cDNA克隆的5'端上游引入了T7启动子序列,采用Long-accurateRT-PCR(LA-PCR)一步法扩增并克隆了病毒基因组A节段与B节段全长cDNA。序列测定结果表明,基因组A节段全长共3267个核苷酸,包括5'及3'端的非编码区和两个部分重叠的开放阅读框,基因组B节段全长共2843个核苷酸,包括5'及3'端的非编码区和一个开放阅读框。将IBDV-Gx株的A节段全长基因组及B节段全长基因组分别克隆入pMD18-T载体,构建成pMD-A、pMD-B两个带有T7启动子的重组质粒。两个重组质粒线性化后,进行体外转录,然后共电转染于鸡胚成纤维细胞37℃培养72h并传代。收获的细胞传代培养物分别用RT-PCR、间接免疫荧光、蚀斑试验等方法进行鉴定,结果用RT-PCR扩增出了VP3及VP5基因片段,间接免疫荧光检测到了特异性的荧光抗体,蚀斑试验结果表明蚀斑形成单位为3×103PFU/mL。     

鸡传染性法氏囊病病毒地方流行毒株的免疫原性

从河北省一些发病鸡场分离到JD1～JD10共10株鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)毒株,用IBD标准阳性血清以琼扩试验进行了初步鉴定.并进行了IBDV分离物及其鸡胚适应毒免疫原对标准强毒IBDV-BC6/85株免疫保护试验,D78弱毒疫苗对IBDV各分离毒株的免疫保护试验以及分离毒株间交互免疫保护试验.结果表明,D78疫苗对JD2,JD5和JD10 IBDV分离株的保护率较低,分别为40%、50%和60%.分离毒株JD5、JD2及其鸡胚传代物E-JD2对强毒株的免疫保护率可达100%.交互免疫保护试验表明,JD2对其余各分离株的免疫保护指数达到80%以上,对标准强毒株和地方分离株均可产生有效免疫保护.     

鸭肝炎病毒A66弱毒株在鸡胚成纤维细胞上的培养

将鸡胚致弱的鸭肝炎病毒 ( DH V) A6 6 株接种于鸡胚成纤维细胞 ( CEF)进行细胞培养 ,通过对细胞培养物进行病毒滴度测定、鸡胚中和试验和电镜检查 ,证明了 DHV A6 6 毒株能够在 CEF上增殖。试验还表明 ,犊牛血清对 DH V增殖具有明显的抑制作用。此外 ,还根据细胞培养物病毒滴度测定结果绘制出了病毒在 CEF上的生长曲线。     

禽成髓性白血病病毒p27和gag基因的克隆

禽成髓性白血病是由禽成髓性白血病病毒引起的一种禽白血病（Avian Leukosis)。禽成髓性白血病病毒的gag基因具有高度保守性，其编码的群特异性抗原p27是禽白血病病毒所共有的主要核心蛋白，可做为禽白血病的诊断抗原。本实验采用AMV感染鸡胚成纤维细胞（CEF），提取感染细胞总RNA，用随机引物反转录成cDNA，根据已经发表的AMV BAI－A株序列设计两对针对p27基因和gag基因的特异性引物，分别进行PCR，成功地扩出p27基因和gag基因，其片段分别为793bp和2．1Kb。以gag基因的PCR产物为模板，采用p27的特异性引物也成功扩出p27片段。分别将p27,gag基因与pGEM－TEasy载体进行连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，提取质粒，进行酶切鉴定。对含有p27基因的质粒进行测序，结果证明成功克隆了p27基因，间接证明了2．1Kb的片段是gag基因。p27和gag基因的成功克隆为该病的探针诊断和gag基因的表达提供了基础。     

Changes in VP2 gene during the attenuation of very virulent infectious bursal disease virus strain Gx isolated in China

Very virulent (vv) infectious bursal disease virus (IBDV) Gx strain with high pathogenicity was attenuated through replication in specific-pathogen-free (SPF) chicken embryos and in chicken embryo fibroblast (CEF) cell cultures. The changes in VP2 nucleotide and the deduced amino acid sequences were obtained during attenuation of vvIBDV in CEF culture. Sequence analysis of selected passages from numbers 0 to 20 in CEFs (designated here Gx to CEF-20) showed that no changes were detectable in the VP2 gene before CEF-7. There were a few changes in the nucleotide sequence of the VP2 gene but no amino acid substitutions at CEF-8. The virus of CEF-9 was an intermediate with some amino acid changes that possibly were related to virulence. CEF-10 virus had become similar to CU-1 strain. The VP2 gene sequence remained the same from CEF-10 to CEF-20. The results of pathogenicity tests showed that the mortalities of Gx, CEF-5, CEF-8, and CEF-9 in 4-wk-old SPF chickens were 64%, 60%, 60%, and 32%, respectively; whereas CEF-10, CEF-15, and CEF-20 were nonpathogenic. Virus neutralization tests with Gx strain showed that the antigenicities are similar from Gx to CEF-20.     

LA-PCR快速克隆传染性法氏囊病病毒基因组A节段全长cDNA方法的建立

从浙江省某鸡场暴发疑似传染性法氏囊病 (IBD)的法氏囊病料中分离到 1株致死率高达 70 %的强毒株 (IBDV-ZJ2 0 0 0 )。通过筛选 ,采用效果最理想的蛋白酶 K法从法氏囊中提取病毒基因组 RNA,经 L i Cl纯化后 ,优化各种反应参数和条件 ,建立了 L ong- accurate PCR(L A- PCR)一步直接扩增 IBDV A节段全长 c DNA的方法 ,得到一约 3.2 6 kb的片段。L A- PCR法能快速从病鸡法氏囊和细胞适应毒中扩增 A节段全长 c DNA,为研究各 IBDV毒株 A节段的结构和功能打下了基础。     

一株分离自外观正常鸡胚的禽呼肠孤病毒的鉴定

从外观正常的鸡胚体内分离到一株病毒,其在鸡胚原代成纤维细胞上繁殖产生稳定的以合胞体为特征的CPE;病毒呈二十面体对称,无囊膜,有双层衣壳,直径为50～60nm;SDS-PAGE显示病毒基因组分为10个片段,呈3—3—1—3分布,与禽呼肠孤病毒(ARVS)FDO株基本相同。以上资料说明,鸡胚所带病毒为一株ARVS,其在CEF-2代上的TCID_(50)为10~(-6.16)/0.1ml。     

传染性法氏囊病超强毒Gx株的致弱研究

本研究成功将鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDVGx株通过SPF鸡胚的快速培育及鸡胚成纤维细胞传代致弱，揭示了vvIBDV从超强毒力向弱毒力转化过程中，其主要结构蛋白VP2基因核苷酸及推导的氨基酸序列的变化规律。对不同代次细胞毒进行了序列分析。发现细胞毒在第7代以前，VP2基因序列没有改变。与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达100%；细胞毒第8代，有个别核苷酸发生了改变。但没有影响氨基酸序列；细胞毒第9代是变化复杂的过渡代；10代毒VP2基因与欧洲标准弱毒Cu-1氨基酸序列同源性达97%；以后的细胞适应毒至20代。其VP2基因序列不再改变。致病性实验表明原代毒对4周龄SPF鸡致死率为64%。细胞毒第5代的致死率为60%，而20代毒对鸡无致病性。在鸡体内连续传代6代不返强。     

传染性法氏囊病超强毒Gx株VP5基因在病毒致弱过程中的变异研究

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒(vvIBDV)Gx株进行培育,通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱,对其非结构蛋白VP5基因核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析,从而揭示vvIBDV Gx从超强毒力向弱毒力转化过程中基因的序列变化规律.对不同代次细胞毒序列分析的结果表明,细胞毒在第8代以前,VP5基因序列没有改变,与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达98%以上;细胞毒第9代核苷酸和氨基酸序列发生了改变;10代毒VP5基因与欧洲标准弱毒Cu-1氨基酸序列同源性达99%;细胞适应毒传至20代,其VP5基因序列不再改变.从而说明,vvIBDV Gx株VP5基因在致弱过程中存在变化规律.     

鸡传染性法氏囊病病毒X-28弱毒株的致病性试验

在Vero细胞上适应且连续传17代的传染性法氏囊病病毒X毒株IBDVX,再经鸡胚成纤维细胞CEF连续传代后,得到了适应CEF细胞生长且毒力相对稳定的的弱毒株(IBDVX-28)。IBDVX-28~IBDVX-43代毒均能在72h~96h内产生明显的细胞病变效应(CPE),半数细胞感染量(TCID50)在10-8.47/0.1mL~10-9.26/0.1mL之间,半数鸡胚感染量(EID50)在10-4.71/0.2mL~10-5.80/0.2mL之间。致病性试验表明,各代次毒能引起10日龄鸡胚40%~50%的感染或死亡,对30日龄SPF小鸡基本无致病性,所有试验鸡均未见法氏囊明显的眼观病变,囊指数(b/B)平均为0.35±0.040;IBDVX-28代毒在雏鸡体内回归6代,均未见法氏囊明显的眼观病变,囊指数保持稳定。