套式PCR检测WSSV出现假阳性的原因分析及控制措施

正对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV)是1992-1993年全国范围内对虾暴发性流行病的主要病原,到现在仍然没有能有效控制WSSV疫情的技术措施。WSSV每年给我国对虾养殖业带来巨大经济损失,成为对虾养殖业可持续发展的主要障碍。目前检测WSSV病原的方法有很多种,主要有目视观察法、组织学方法、电子显微技术、生化检验法、免疫学方法和分子生物     

聚合酶链反应（PCR）检测养殖对虾的白斑症病毒（WSSV）感染

对虾WSSV病是亚洲对虾养殖业中的一个棘手问题。本研究采用Kimura引物 ,用PCR技术对不同生长期的中国对虾 (Penaeuschinensis)进行了WSSV的检测 ,同时也检测了对虾发病时养殖池中多见的野生厚蟹 (Helicesp .)和矛尾刺虎鱼 (Acanthogobiushasta)。检测结果表明 :分别在检测的 5尾亲虾中的 1尾 ,6尾仔虾中的 1尾 ,5尾稚虾中的 3尾及所检测的 5尾病虾和 2只厚蟹中获得到 982bp的PCR扩增产物 ,说明为WSSV感染阳性。在检测的 2尾矛尾刺虎鱼中均未获得PCR扩增产物 ,说明为WSSV感染阴性。在亲虾、虾苗以及虾池内的野生厚蟹中检测到WSSV感染的阳性结果表明 :WSSV感染的亲虾有可能是病毒的储主 ,WSSV感染的野生厚蟹有可能是病毒中间宿主或病毒的携带者 ,它们在对虾WSSV病的感染、传播中起了重要的作用     

凡纳对虾SPF种苗工程与集约化防病养殖模式

对虾养殖业的可持续发展依赖于健康种苗的供给和虾病的预防。池塘培育凡纳对虾全人工繁育和连续传代技术的发展增加了我国人工养殖对虾种苗的可持续供给，减少对我国斑节对虾、中国对虾和日本对虾等土对虾种类野生亲虾的捕捞。目前，我国每年生产30万吨以上的凡纳对虾，约占全国总产量的80％。但是，病害仍是我国对虾养殖业的主要威胁，尤其是病毒病原引起疾病的大规模暴发流行。我国凡纳对虾养殖业中最重要的病毒性病原是白斑综合症病毒(WSSV)桃拉病毒(TSV)和传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)。本报道了我国凡纳对虾SPF种苗工程和集约化防病养殖模式的最新进展。SPF种苗工程技术可以使繁育系统排除WSSV、TSV和IHHNV等严重病毒病原的侵害，提高凡纳对虾亲本和种苗的质量。改进的集约化防病养虾系统则是一种生物安全性更高防病更有效果和环境更友好的集约化养殖系统。     

中国对虾几个产卵场群体携带白斑综合征病毒状况调查

白斑综合征可以导致养殖对虾短时间内大面积死亡,是迄今为止对虾养殖业面临的最大挑战。本试验采用巢式PCR法对2001年采自黄渤海的中国对虾几个产卵场群体进行白斑综合征病毒检测,旨在较全面地了解黄渤海野生中国对虾携带病毒状况。各群体的阳性检出率分别为：朝鲜半岛南海岸群体55％;渤海湾群体35％;辽东湾群体94．7％;海州湾群体47．4％。结果显示,中国对虾几个产卵场群体均不同程度地携带白斑综合征病毒。辽东湾产卵场群体阳性检出率明显高于其他群体,推测人工孵化苗种放流、海湾的地理和水质条件与中国对虾的WSSV感染率相关。而中国对虾野生群体携带病毒对于对虾养殖业的影响是不容忽视的,笔者认为,只有从无特异病原(SPF)及抗特异病原(SPR)对虾养殖群体的建立着手才能从根本上避免由于对虾携带病毒而可能导致的病毒性疾病的暴发。同时,应该重视海区污染的治理,减少病毒病暴发的诱因。本试验建立了快速检测WSSV的PCR方法,1pg病毒核酸仍可检测到,为白斑综合征病毒病的防治及早期诊断提供了有效的手段。     

一例日本囊对虾暴发性死亡的病原分析

为了阐明山东省潍坊市一对虾养殖场发生日本囊对虾暴发性死亡的原因,采用分子生物学检测方法,对发病对虾进行了白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus,TSV)、黄头病毒(yellow head virus,YHV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)、传染性肌肉坏死病毒(infectious myonecrosis virus,IMNV)、偷死野田村病毒(covert mortality nodavirus,CMNV)及急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)7种病原的检测,且对发病对虾进行了常规组织病理学观察。同时采用16S r DNA细菌鉴定方法及浸泡回接感染实验对分离自发病对虾体内的可疑病原菌进行了分子鉴定及毒力测试。结果显示,发病对虾样品核酸检测呈现WSSV强阳性,IHHNV和CMNV为弱阳性,其他4种病原为阴性。组织病理学观察发现,在对虾的胃、鳃等上皮组织中存在WSSV包涵体,头部肌肉纤维出现离散。对分离编号为2901、2902、2903的3株优势可疑病原菌鉴定结果显示,3株菌分别与印度格里蒙菌、交替单胞菌及溶藻弧菌相似,相似度分别为99%、99%及100%。攻毒结果显示,3株可疑病原菌的LC50分别为9.8×107、1.1×108与2.3×108 CFU/m L,各细菌毒力均较弱,非导致对虾出现暴发性死亡的病原。研究表明,导致本次日本囊对虾暴发性死亡的病因与混合感染病原WSSV、IHHNV、CMNV有关,其中WSSV感染是造成日本囊对虾暴发性死亡的主因,研究结果可为解析当前养殖日本囊对虾疾病暴发及其成因提供参考。     

对虾黑鳃病、红体病的诊断及防治

对虾是我国水产经济动物的一大品种,随着人工养殖时间的延长,对虾自身抗病力减弱,环境污染,病原体较多,对虾病害已成为威胁对虾养殖业的一个严重问题。多年来,我们对养殖对虾主要疾病的病原及防治方法进行了深入的研究,在养殖过程中建立了严格的消毒措施,控制病毒的传播途径，建立了实用、灵敏、准确的病原监测程序，推广使用快速、灵敏的对虾病毒检测技术（PCR检测方法及核酸探针检测方法），     

对虾白斑综合症病毒的形态分析和致病机理研究

WSSV在1992首次发现以来已成为对虾养殖业中最危险的传染源.在过去20年中,该病原已经曼延至整个对虾养殖区域并且造成了70多亿美元的损失.目前,生物防治方法主要是池塘和水体的消毒,避免带病原动物的进入和放养不带特定病原的虾苗,这些措施的结合使用提高了对虾养殖设施中的生物安全、有助于降低WSSV爆发的风险.虽然这些方法在试验条件下表现出一定的抗WSSV效果,但是养殖生产中却没有有效的治疗产品或策略来控制WSSV.人们通过测定不同株WSSV的序列和特征来确定其生物学,毒力和致病机理,对寻找有效控制WSSV的方法具有关键的作用.     

对虾WSSV和IHHNV多重PCR检测试剂盒的研究与应用

在对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)二温式PCR检测技术前期研究的基础上,将这2种病原的特异性引物与PCR基础反应液一起组装成快速检测试剂盒。通过对试剂盒敏感性、稳定性和保存期等技术指标的测定以及对临床样品的检测试验,该试剂盒对同一样品中的WSSV和IHHNV DNA模板均能特异性地扩增出2条与实验设计相符的593 bp(WSSV)和356 bp(IHHNV)的DNA片段,而对其它对虾病原的扩增结果均为阴性;该试剂盒最低能检测到102pg的WSSV DNA和10 pg的IHHNV DNA。对WSSV和IHHNV DNA的检出量分别为102~103pg和10~102pg。     

对虾白斑综合症病毒的分子生物学研究进展

对虾白斑综合症病毒(wkite spot syndrome virus,WSSV)又称对虾白斑杆状病毒(white spot bacilliform virus WSBV),是对全球对虾养殖业危害最大的病原之一。该病毒分子量较大、结构特异,是已知动物病毒中最大的病毒。自1992年以来,各国学者对WSSV进行研究。由于他们研究的方法及研究的侧重点不同,对该病毒命名各异。陈秀男(1993)称之为白斑综合症杆状病毒(WSBV);荷兰Wongteerasupaya(1995)称其为系统外胚层和中胚层杆状病毒(SEMBV);     

对虾的主要疾病及其诊断方法

诊断对虾病原的方法有传统的形态病理学（光镜和电镜直接观察和组织病理学等）、扩增和生物测定、微生物学和血清学方法，对皮下及造血组织坏死病毒病（IHHNV）、肝胰脏细小病毒病（HPV）、拖拉症（Taura syndrome,TS）、白斑综合症（WSSV）、斑节对虾型杆状病毒病（MBV）和杆状对虾病毒病（BP）等病原均采用非放射性的基因组探针目前已研制出了NHP、某些弧菌（Vibrio spp）和微孢子虫的传统基因探针，根据聚合酶链式反应（PCR），采用DNA扩增方法确立的检测某些病原的高敏感性方法也应用在对虾病原诊断上。     

WSSV结构、功能及基因组学研究概况

对虾白斑综合征病毒WSSV(White Spot Syndrome Virus WSSV)已成为养殖对虾一主要病原，给对虾养殖业造成了巨大损失。弄清其侵染机理是有效防治的基础，而对其侵染机理的阐释则主要是搞清各基因在侵染中的作用及表达调控的特点，这些恰恰是WSSV基因组学的研究内容。本文对WSSV基因组序列、结构蛋白及非结构蛋白方面的研究成果做了综述，同时介绍了基因组学研究中的一些常用的方法。     

同时检测两种对虾病毒和4种弧菌的同步PCR方法的建立

通过检索、多重比对、分析和筛选GenBank中对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、副溶血孤菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌的基因序列,设计了10对特异性引物,以已知毒株和菌株的DNA为模板进行PCR,均能扩增出与实验设计相符合的DNA片段,对PCR扩增条件进行优化,建立了可同时检测鉴别WSSV、IHHNV、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌,并且能同时区分WSSV不同地理毒株的同步PCR方法.研究结果表明,该方法检测特异性好,检测通量大,适合于对虾多种病原的同时检测.     

2022年滨州地区养殖对虾和海水鱼苗流行病学调查和风险评估

为了解滨州地区养殖对虾与海水鱼苗流行病学现状,掌握潜在风险,为水产养殖业健康有序发展提供科学依据,2022年,开展滨州市(无棣县、沾化区、博兴县)养殖对虾和海水鱼苗种主要病害监测,对虾苗种检测白斑综合征(WSD)、传染性皮下及造血组织坏死病毒病(IHHN)、虾肝肠胞虫病(EHP)、急性肝胰腺坏死病(AHPND)、对虾虹彩病毒病(DIV-1)、桃拉综合征(TS)、传染性肌肉坏死病(IMN);海水鱼苗种检测病毒性神经坏死病(VNN)等。本次监测了65份南美白对虾样品,分别都检测8种对虾病原,共检出5份病原阳性样品,并存在有2种甚至3种病原共感染情况。建议在对虾苗种引进、繁育、养殖过程中应进行全面的多病原监测,从源头上把好苗种质量关,保障对虾健康,促进对虾养殖业发展。     

凡纳滨对虾RAS与WSSV-VP26的相互作用

白斑综合征病毒(WSSV)是对虾养殖中主要的病原之一,病原与宿主作用是介导病毒感染的重要过程。RAS蛋白是Ras基因分泌的保守蛋白,为小G蛋白家族的一员,普遍存在于从酵母菌到哺乳动物的真核细胞中,具有偶联受体和效应系统传递跨膜信号的功能,在细胞增殖和分化中起双重调节的作用,但关于RAS与WSSV的作用尚不明确。本研究将凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) Ras基因克隆至pBAD/gⅢA表达载体上,以E. coli Top10为宿主菌,在L-阿拉伯糖的诱导下获得RAS重组蛋白。以Co~(2+)亲和层析方法,获得纯化的RAS蛋白,质谱分析显示,该蛋白为凡纳滨对虾RAS。采用Far-western和ELISA检测方法分析RAS与WSSV结构蛋白VP26、VP28N和VP37的相互作用。Far-western结果显示,RAS与VP26有明显的结合作用,ELISA实验结果显示,RAS与VP26蛋白的相互作用随RAS量的增加而增强。本研究表明,RAS参与WSSV侵染过程,为进一步研究WSSV侵染机制提供了理论基础。     

凡纳滨对虾商业苗种抗WSSV性能比较

白斑综合征病毒(WSSV)一直是甲壳类生物的高致病性病原。为了解市场上不同凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)商业苗种病原携带情况及其抗WSSV性能,本研究收集了6个品牌的凡纳滨对虾商业苗种(分别简称为海南Z、海南S、广州P、广州Z、黄骅R和东营M),先进行包括WSSV在内的8种病原的检测,然后,采用单尾定量口饲感染方式进行抗WSSV性能测试,并比较各组苗种感染WSSV后的平均存活时间、存活率以及累积死亡率的差异。结果显示,6个商业苗种都不携带WSSV,部分苗种检测有潜在虾肝肠胞虫(EHP)和偷死野田村病毒(CMNV)。各苗种感染WSSV后,平均存活时间从长到短依次为海南Z、广州P、黄骅R、海南S、广州Z、东营M。东营M感染WSSV后第4天达到死亡高峰,而海南Z在第6~7天到达死亡高峰,比东营M晚了2~3d。感染实验结束后,海南Z和广州P存活率最高,同为72.5%,而东营M和黄骅R的存活率最低。本研究表明,海南Z和广州P抗WSSV性能最强,研究结果可为凡纳滨对虾抗病新品种的选育提供基础数据。     

中草药作为免疫增强剂在虾类养殖上的应用

对虾养殖业是我国海水养殖业的支柱产业，自1993年全国养殖对虾因感染对虾白斑病毒（WSSV）而发生大规模暴发性流行病以来，对虾养殖业蒙受了毁灭性的打击。到目前为止，已发现有20多种病毒可以感染虾类，而对付这些病毒至今还没有有效的方法。抗生素的使用一定程度缓解了疾病的发生，但由于它在动物体内残留，     

对虾白斑综合征病毒免疫防治研究进展

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是一种引起养殖对虾爆发性死亡的病毒,由于它宿主范围广、蔓延速度快以及致死率高,已经成为对虾养殖中的第一杀手,因此有效防治WSSV爆发在水产养殖中具有重要意义并极具挑战性。本文主要介绍WSSV基因组以及结构蛋白、对虾WSSV免疫机制、对虾WSSV疫苗研究进展,以及我国对虾养殖中WSSV防治措施,认为对虾WSSV疫苗将是今后对虾大规模养殖中病害防治的一种重要手段。     

对虾白斑综合症的综合防治

目前对虾暴发性流行病主要是对虾白斑综合症（WSSV）,该病传染性强,危害最大,它的病原体是一种无包涵体杆状病毒,在已报道的所有对虾病毒中,该病毒的毒力最强,且其地域分布及宿主范围广泛。严重制约着我国对虾养殖业的发展,因此,在养殖过程中采取积极的预防措施具有重要的意义。     

一对虾养殖场的多病原跟踪

本研究通过对一对虾养殖场定期采样,采用分子生物学鉴定方法,分别对对虾体内及水环境中弧菌(Vibrio sp.)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)及主要病毒性病原进行了跟踪检测,同时,检测了水环境中的氨氮及亚硝基氮含量的变化趋势。结果显示,该对虾养殖场中存在的主要病原为多种致病弧菌和EHP,未检测出对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)、偷死野田村病毒(CMNV)及传染性皮下和造血组织坏死病毒(IHHNV);该养殖场中弧菌检出种类达到16种,其中,主要的弧菌种类有副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌 (V. alginolyticus)、欧文氏弧菌(V. owensii)、创伤弧菌(V. vulnificus)、哈维氏弧菌(V. harveyi),且存在导致急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌(VPAHPND);养殖中期大棚养殖池水体氨氮及亚硝氮浓度分别达到(3.5±2.0)、(8.2±0.7) mg/L,显著高于室外养殖池水体氨氮及亚硝基氮浓度(P<0.05)。养殖期跟踪的7个虾池中,出现严重对虾病害的大棚养殖池比例达到100%,而室外养殖池仅出现轻度对虾病害,发病池比例为25%。根据研究结果推测,造成大棚养殖池对虾发病死亡的主要原因为养殖对虾感染弧菌及虾肝肠胞虫,同时,养殖密度大、水体氨氮及亚硝基氮浓度过高等在对虾病害发生中起到了协同作用。本研究结果可为当前对虾养殖病害防控技术提供理论支持和科学依据。     

中国明对虾WSSV携带量、生长和抗WSSV育种值的相关性分析

为评估中国明对虾生长及抗WSSV能力与中国明对虾WSSV携带量之间的相关性,实验对130个中国明对虾家系进行生长及抗WSSV性能测试,对收集到的中国明对虾生长和抗病数据,输入“水产动物育种分析与管理系统”数据库,利用综合选择指数法估计中国明对虾各个家系的育种值。根据分析结果,选择出生长育种值最大的5个家系和最小的5个家系、抗WSSV育种值最大的5个家系和最小的5个家系,分别检测上述20个家系的亲虾、养殖50 d及170 d中国明对虾的WSSV携带量。结果显示,亲虾、50 d中国明对虾及170 d中国明对虾的WSSV携带量分别为0.190 8、0.286 6和0.232 9 copies/ng DNA,三者之间差异均不显著。亲虾、50 d中国明对虾和170 d中国明对虾的WSSV携带量与中国明对虾的生长育种值相关系数分别为 0.021、0.363和0.185,亲虾、50 d中国明对虾和170 d中国明对虾的WSSV携带量与抗WSSV育种值相关系数分别为0.033、0.048和0.019。研究表明,中国明对虾的生长育种值和抗WSSV育种值与中国明对虾体内的WSSV携带量均无显著的相关性。