弓形虫P3O基因及其功能

弓形虫P30基因所编码的蛋白为弓形虫主要表面抗原SAG1,其约占速殖子总蛋白量的5%,SAG1对虫体侵入宿主细胞及其毒力具重要性,并有高度免疫原性和免疫保护性,被用于弓形虫疫苗的研制和弓形虫感染的 分子诊断.     

弓形虫SAG1重组抗体制备及抗原表位鉴定

重组抗体相较于多克隆抗体和杂交瘤单克隆抗体具有更好的稳定性和特异性,本研究以弓形虫表面抗原1(surface antigen 1,SAG1)为靶标制备了重组抗体.将弓形虫SAG1(45～198 aa)的基因序列被克隆到pET-32a原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21感受态细胞后获得弓形虫SAG1(45～198 aa)重...     

弓形虫SAG1基因在蜥蜴利什曼原虫中的表达

利用PCR扩增技术从弓形虫RH株全基因组中扩增出弓形虫抗原基因SAG1,将其克隆入真核表达载体质粒pLEXSY-neo2,构建真核表达穿梭质粒pLEXSY-neo2-SAG1。利用电穿孔转染技术将外源基因表达盒转入蜥蜴利什曼原虫,经G418筛选阳性克隆。表达的外源重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,证明SAG1重组蛋白在蜥蜴利什曼原虫中得到表达。     

应用加端PCR克隆弓形虫P30基因

为了采用基因工程方法大量生产高效抗原提供技术,根据已发表的弓形虫RH株P30的核苷酸序列,设计了一对加端引物,运用PCR方法,从弓形虫NT株中扩增出约800bp的片段。产物经EcoRI和XbaI酶切后,克隆进PUC19载体,经酶切和PCR鉴定,插入片段为P30基因。     

刚地弓形虫SRS29C核酸疫苗的构建及SRS29C与SAG1联合免疫保护性的比较研究

为了探究刚地弓形虫表面蛋白(surface antigen, SAG)SRS29C基因和SRS29C、SAG1联合基因的核酸疫苗对小鼠急性感染弓形虫的免疫保护效果,试验利用PCR方法扩增了SRS29C基因片段并将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-SRS29C,并对该质粒进行酶切鉴定,同时用该质粒对HEK293T细胞进行转染,再用Western-blot方法检测目标蛋白在细胞中的表达情况;用重组质粒pEGFP-SRS29C和pEGFP-SAG1单独免疫或联合免疫小鼠,用ELISA法测定血清IgG水平,CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖能力,流式细胞仪测定CD₄⁺和CD₈⁺T淋巴细胞百分比,ELISA试剂盒检测脾脏细胞因子的表达情况;进行小鼠体内攻虫试验,记录小鼠存活时间。结果表明：成功构建了重组质粒pEGFP-SRS29C,表达的蛋白质大小为66 ku; pEGFP-SRS29C组和联合免疫组与PBS组和空载体组相比血清IgG含量、脾淋巴细胞增殖率、CD4⁺     

弓形虫病疫苗研究进展

综述了弓形虫病减毒和灭活疫苗、基因工程亚单位疫苗、核酸疫苗及活载体疫苗的研究进展。弓形虫是专性细胞内寄生原虫,全球分布,能引起人兽共患的弓形虫病。弓形虫病疫苗的研制对于弓形虫病的防治工作有着极其重要的意义。     

弓形虫主要表面抗原P30基因克隆与表达

将液氮保存的弓形虫 Ｎ Ｔ 株经小鼠复壮后,取腹腔液提取弓形虫基因组 Ｄ Ｎ Ａ,采用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法从弓形虫 Ｎ Ｔ 株中扩增出约 ８００ ｂｐ 的片段。产物经 Ｅｃｏ Ｒ Ｉ和 Ｘｂａ Ｉ酶切后,克隆到 ｐ Ｕ Ｃ１９ 载体中,构建了 ｐ Ｂ Ｖ Ｐ３０ 非融合表达质粒和 ｐ Ｅ Ｔ Ｐ３０ 融合表达质粒。ｐ Ｂ Ｖ Ｐ３０ 转化到宿主菌 Ｄ Ｈ５α、ｐ Ｅ Ｔ Ｐ３０ 转化到宿主菌 Ｂ Ｌ２１ （ Ｄ Ｅ３）后,分别经温控诱导和 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导,产物经 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 分析,ｐ Ｂ Ｖ Ｐ３０ 未发现表达产物,ｐ Ｅ Ｔ Ｐ３０ 出现约 ３０ ０００ 的产物。 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 显示,该蛋白与兔抗弓形虫血清发生特异性反应;薄层扫描显示,该蛋白占菌体总蛋白的 ２０％ 以上。     

弓形虫疫苗研究进展

弓形虫病是一种分布广泛、危害严重的人兽共患病,不但在公共卫生上有极大的危害,而且对畜牧业也造成巨大经济损失。该病的控制以疫苗为首,本文对弓形虫疫苗的研究现状进行了综述。     

弓形虫疫苗研究进展

弓形虫病是一种分布广泛、危害严重的人兽共患病,不但在公共卫生上有极大的危害,而且对畜牧业也造成巨大经济损失。该病的控制以疫苗为首,本文对弓形虫疫苗的研究现状进行了综述。     

刚地弓形虫棒状体蛋白18及其作为基因工程疫苗候选分子研究进展

刚地弓形虫棒状体蛋白18(rhoptry protein18,ROP18)是由棒状体分泌的、属于棒状体蛋白2家族的一员,具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性,在虫体入侵和毒力的发挥方面起着重要作用。论文就ROP18蛋白的结构、毒力和作用机制及其作为基因疫苗候选分子的研究现状进行综述。     

弓形虫保种与转种的简易方法

采用小鼠传代与体外4℃冰箱保存相结合的方法，对弓形虫虫株进行保种，转种成功率达100％，为虫株的保存提供了又一种简便可靠的方法。     

弓形虫两种保种方法的试验

目的寻求一个简便、适宜的弓形虫保种方法。方法采用不同温度的冷冻保存法和细胞培养保存法对弓形虫保存进行了试验研究,为深入研究弓形虫提供保证。结果弓形虫在液氮(-196℃)、-70℃能长期保存,4℃能保存14 d。通过细胞培养能获得大量的弓形虫滋养体,对培养细胞的选择性不强。结论两种保种方法保存后弓形虫毒力不变。     

纯化弓形虫速殖子的两种物理法探讨

采用纤维素粉过滤法和多聚磷酸纤维薄膜过滤法，对人工感染的小鼠腹腔液中的弓形虫速殖子进行细胞清除率和回收率比较。前者白细胞平均清除率９５．４％，红细胞平均清除率９０．１％，虫体回收率３３．１％；后者白细胞清除率８１．６％，红细胞清除率８０．５％，虫体回收率４８．６％。在红、白细胞清除率上，纤维素粉过滤法优于薄膜过滤法，在虫体回收率上后者略优于前者。     

弓形虫,泰氏锥虫和伊氏锥虫超低温冷冻保存的试验研究

根据液氮(-196℃)超低温冷冻保存组织细胞的原理,本文选用Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ号保护剂分别对来自体外培养的弓形虫和泰氏锥虫、小鼠血液内的伊氏锥虫以及小鼠腹腔液内的弓形虫进行超低温冷冻保存试验。试验表明,在没有特殊逐步降温设备的情况下,直接冻存法比间接冻存法更方便,效果更为确实。截至报道之日止,弓形虫保存已达954天,泰氏锥虫达1189天,伊氏锥虫达1089天,虫体形态、活力、增殖力和致病性均无明显改变,为虫体的长期保存提供了一较为简便可靠的方法。     

刚地弓形虫抗原基因SAG2的克隆、表达和纯化

目的克隆刚地弓形虫抗原基因SAG2,并在大肠杆菌中进行高效表达及纯化。方法设计引物从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列,构建pGEX-4T-SAG2重组质粒,双酶切鉴定后,在大肠杆菌中进行表达,并对其表达条件进行优化,所表达蛋白用GST亲和层析柱进行纯化。结果经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白约为41KD。Western-blotting表明该蛋白能与兔抗弓形虫血清特异性结合。培养基2×YTA,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时间3 h,培养温度30℃,摇瓶转速220 r/min是GST-SAG2融合蛋白表达的最佳条件,且得到的是可溶性融合蛋白GST-SAG2。结论得到高效表达的SAG2抗原蛋白,为建立弓形虫病快速免疫诊断试剂盒打下基础。     

检测实验动物弓形虫感染的两种PCR方法的建立和比较

为了建立敏感、稳定、特异的PCR检测体系，用于实验动物弓形虫感染的检测。采用B1基因设计引物，建立常规PCR，用P30基因设计引物，建立巢式PCR；用两种PCR方法检测实验感染弓形虫小鼠血液和腹腔波中的DNA动态变化；用巢式PCR检测自然状态下的普通级豚鼠、教学和科研用兔的弓形虫感染率，并和常规PCR检到结果比较。结果，巢式PCR可检测到1fgDNA含量，比常规PCR敏感lOO倍；对其他微生物DNA无交叉现象，特异性强；对同一样品重复检测3次，阴、阳性结果一致，稳定性好。小鼠感染弓形虫2d后，巢式PCR对小民腹腔液的阳性检出率为83．3％，对血液的阳性检出率为33．3％；感染3d后，腹腔液阳性检出率为100％；而常规PCR在小鼠感染3d和4d后才能在腹腔液和血液中检测到，检出率各为16．7％。受检普通级豚鼠没有感染弓形虫，教学和科研用兔的弓形虫总感染率为14．3％。结论认为，巢式PCR方法可用于实验动物弓形虫早期感染的检测，具有敏感性高、特务性强、稳定性好的特点。     

地鼠肾细胞弓形虫培养的实验研究

本文报道用正常地鼠肾细胞进行弓形虫培养的实验研究。接种虫体２×１０￣６个时，第２天细胞出现病变，第４天及第６天虫体繁殖逐渐增多，第７天虫体比原增殖达２６倍，到第９天以后虫体增殖逐渐减少。我们还对不同稀释度（１：２０，１：４０，１：８０，１：１６０）的弓形虫抗原量接种细胞进行观察，结果显示接种１：２０抗原液的一组，第５天观察到细胞严重受损，而接种１：１６０抗原液的一组则细胞变化不明显，展示抗原的接种量与虫体增殖有关。本研粉虽然比小白鼠传代腹水培养工作量大，但可获得足够量的抗原，而且地鼠肾细胞培养，取材方便。此法既可作制备抗原和分离用，又可传代、保种，是一种较好的方法。     

磺胺氯吡嗪处理弓形虫速殖子抑制消减文库的构建和初步分析

为了研究和探索磺胺氯吡嗪抗弓形虫的作用机理,构建磺胺氯吡嗪处理弓形虫的抑制性消减文库.将刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株速殖子腹腔注射(10000个/只鼠)感染昆明系小鼠,大量收集并纯化速殖子.用250 mg/mL磺胺氯吡嗪PBS溶液和PBS分别浸泡速殖子,37℃恒温箱孵育2h,分别提取虫体的总RNA和mRNA,以PBS处理的正常虫体cDNA为驱动组,以药物处理虫体cDNA为实验组,构建药物处理前后弓形虫速殖子的抑制性消减文库,对部分阳性克隆进行测序和序列分析.结果显示,提取的虫体总RNA纯度高,合成的双链cDNA经RsaⅠ酶切反应较完全;从消减文库中随机选择100个阳性克隆进行PCR扩增,其插入片段长度在200～750 bp之间,文库的重组率达93％以上;随机挑取30个阳性克隆进行测序,获得11个单一序列,Blast分析显示有7个单一有效EST序列与已知蛋白质相似性较高.结果表明,已成功构建磺胺氯吡嗪处理弓形虫速殖子的抑制性消减cDNA文库,并对部分阳性克隆进行了初步分析,为深入研究磺胺氯吡嗪的抗弓形虫机制和寻找药物作用的关键靶分子奠定了基础.