冰核细菌的研究方法

 简单回顾了冰核细菌研究的历史,根据我们多年来的研究工作经验,详细介绍了冰核细菌研究的基本方法和简单实用的试验研究经验,包括样品的采集、分离及冰核活性的测定等。     

影响冰核细菌成冰活性的因素研究

 采用Vail小滴冻结法，定量定性测定了8种因素对INA细菌成冰活性的影响，结果表明：INA细菌浓度为5×10#+2—5×10#+8个/ml细菌，温度为-2℃-7℃范围内，当温度一定时，菌液浓度越高成冰活性越强；当菌液浓度一定时，温度越低成冰活性越强。冰核细菌最佳培养温度为20℃左右，25℃以上成冰活性逐渐降低。冰核细菌在4℃下保存20天成冰活性稳定不变，25℃以上时，温度越高成冰活性丧失越快。培养基组分不同，其成冰活性亦不同，若含有甘油或蔗糖组分，可增加成冰活性。用波长254nm紫外线照射INA细菌菌液1-30分钟时，对其成冰活性和杀灭作用的影响大小，与照射时间长短成正相关，若照射30分钟时，不仅INA细菌全部丧失成冰活性，而且也全被杀死。1%的胃蛋白酶能极显著地破坏成冰活性。pH2.0或pH4.0的酸性溶液和pH10的碱性溶液，都能破坏成冰活性。3种抗菌素都能杀死INA细菌，但不一定能破坏成冰活性，如对丁香假单胞菌(P.S)的成冰活性几乎毫无影响。凡是含有 铜类、硫类和脲类的杀菌剂以及重金属盐类、氯仿和乙醚都具有破坏INA细菌成冰活性的作用。     

冰核细菌冰核基因多态性的研究

 根据冰核细菌基因中的多拷贝重复编码区设计并合成简并引物inaZI[5'-GCCGGTTATGGCAGC(T)ACGCTGACC-3'],通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增20株不同种属的INA⁺和INA^-细菌菌株.结果表明:所有供试的冰核活性菌株均获得扩增产物,而非冰核活性菌株则无扩增产物.冰核基因的扩增产物呈多态性.     

小春作物上冰核细菌种群动态研究

 采用平板稀释分离计数法,在小春作物蚕豆、小麦和油菜生长期间,连续两年定点定期对冰核细菌种群数量动态变化进行检测。结果表明,在云南省昆明地区自然条件下,冰核细菌的数量最大密度出现在2月中旬至3月中旬,可达9.2×10⁹ CFU／g。     

冰核细菌对棉铃虫结冰温度影响的研究

 以棉铃虫为对象，采取喷雾和喂食两种接种方法，研究了冰核细菌对昆虫的结冰温度的影响。结果表明：两种方法接种的冰核细菌均能明显提高棉铃虫的结冰温度，但不同接种方法间存在差异。喷雾接种的虫体结冰温度比对照高5.14-10.79℃,接种1天后就将结冰温度提高5.90℃，在棉铃虫化蛹后还能将结冰温度提高7.71℃。喂食接种虫体接种两天后才与对照的结冰温度之间出现明显的差异，能将结冰温度提高2.25-4.56℃,化蛹后仅能将结冰温度提高0.93℃。试验证明，冰核细菌能在昆虫体上起到异源冰核的作用，从而提高虫体的结冰温度。为探索一条利用生物冰核降低越冬害虫的过冷却能力，诱发虫体在较高温度下发生结冰，破坏细胞组织，造成虫体死亡，以此来提高越冬害虫的死亡率，压低来年虫源，减轻危害的促冻杀虫新途径提供了科学依据。     

冰核活性细菌拮抗菌株的筛选

 从多种植物根际土壤中分离到300个细菌分离物,通过含菌平板培养筛选出F015,F023,F046等近20株对冰核细菌具有较强的拮抗力,室内测定对冰核细菌病原物抑菌圈达0.8～3.0 cm. 挑选出F015,F023,F046进一步进行室内抗菌机理、菌株鉴定和室外田间小区实验。实验结果表明,菌株初步鉴定为芽孢杆菌（Bacillus spp.）和假单胞杆菌（Pseudomonas spp.）。其代谢产物蛋白质粗提物对冰核细菌的生长有明显的抑制作用。室外防霜效果在19.5％～36.9％,可有效地控制霜冻害的发生与危害,具有广阔的应用前景。     

我国冰核活性细菌种类及其分布的初步研究

70年代以来,国外研究证明,在植物体上广泛存在的一些细菌种类如丁香假单胞菌(P·S)、草生欧文氏菌(E·h)和荧光假单胞菌(P·f)等,均具有诱发植物细胞水结冰的作用,这类细菌被称为冰核活性细菌(简称INA)。它们可以诱发许多植物在-2-- 5℃条件下发生霜冻害。我们的研究也证明,玉米和大豆幼苗接种INA的     

冰核活性细菌的研究进展

 从冰核活性细菌与作物霜冻的关系,冰核活性细菌的分子生物学基础,防霜技术3个方面阐述了冰核活性细菌的研究进展。     

茶树上冰核活性细菌的分离、鉴定及防治

霜冻发生时从茶树上分离到1株冰核活性细菌,该菌株在﹣5℃下在2 min内冻滴率达到85%,一个冰核产生需要的细胞数约为5.4×103个,该菌株具有明显冰核活性。对该菌株进行16S rDNA序列对比分析,判断该菌株为萎蔫短小杆菌(Curtobacterium flaccumfaciens)。在-5℃条件下,药剂防治效率顺序为:次氯酸钙>Tween80>藏红>亚甲蓝。在同一生态条件下的土壤中分离出1株拮抗菌,经鉴定该菌株为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。     

冰核细菌的研究、应用现状和前景

冰核细菌是诱发和加重植物霜冻的重要因子,通过减少和控制冰核细菌,在进行霜冻防治研究方面,取得了一定效果.目前世界上已发现4个属23个种或变种的细菌具有成冰活性.细菌冰核是一类蛋白质,称冰蛋白,由细菌冰核基因编码,报道已有11种冰核细菌的冰核基因被克隆并在大肠杆菌中得到表达.综述了冰核细菌生物学及分子生物学特性,以及冰核细菌在霜冻防除、人工降雨、食品冷藏保鲜、高敏检测和促冻杀虫等方面的研究进展和应用前景.     

云南诱发霜冻害冰核活性细菌的鉴定

 1990年冬,从云南省宾川、大理、昆明、陆良等地采集受霜冻危害小麦、蚕豆、蕃茄上的33个标样,分离出12个冰核活性的细菌菌株.鉴定结果是Erwinia herbicola waranaanas及Pseudomonas syrindae.首次证明云南有冰核活性细菌.     

云南植物上冰核细菌的种类与分布

 1990～1997年,从云南省24个县市的54种植物上分离到了197株冰核细菌,并进行了鉴定.其中菠萝欧文氏菌83株,占42.1%,草生欧文氏菌9株,占4.6%,流黑欧文氏菌3株,占1.5%,边缘假单胞菌10株,占5.0%,丁香假单胞菌71株,占36.0%,菜豆荚斑假单胞菌19株,占9.6%,草莓黄单胞菌1株,占0.5%,野油菜黄单胞菌1株,占0.5%.冰核细菌的种群和生态学在云南省植物上呈丰富的多样性.云南省植物上冰核活性细菌的优势种类是菠萝欧文氏菌,其次是丁香假单胞菌类.     

利用转座子Tn5诱变冰核细菌获得无冰核活性菌株

 以云南省冰核细菌的优势种类丁香假单胞菌Pseudomonas syringae和菠萝泛菌Pantoea ananas为重组基因工程菌的受体菌,采用Tn5转座子诱变技术,以大肠杆菌Escherichia coli S17／pZJ25∶∶Tn5作为转座子诱变的供体菌,使Tn5插入并整合到冰核细菌基因组中,使冰核基因的线性连续性被破坏,失去冰核活性。大量筛选接合子,获得157株丧失冰核活性的菌株。     

诱发枇杷霜冻害的冰核细菌拮抗菌分离与筛选

[目的]筛选出具有防除枇杷INA细菌的拮抗菌.[方法]从枇杷根际土壤中分离冰核细菌拮抗菌,对其进行抑菌圈、杀菌能力、破坏冰核活性蛋白能力测定.[结果]从不同海拔地区的根际土壤中共分离得到128个菌株,其中有拮抗效果的有55株,平皿拮抗效果强的有15株,再经拮抗系数比较得到9株强拮抗菌菌株,最后筛选出l株杀菌率达98％、破坏冰核蛋白能力达100％的拮抗菌BL-36.[结论] BL-36既有杀菌效果又有破坏冰核蛋白能力,是具有较好利用前景的防除诱发枇杷霜冻害冰核细菌、减轻枇杷霜冻害的生物防治材料.     

冰核细菌Erwinia ananas 110 冰核基因iceA的原核表达及冰核活性分析

为获得具有高冰核活性的基因工程菌,从冰核细菌Erwinia ananas 110扩增冰核基因iceA,将其克隆到pMD19–T载体上,转化大肠杆菌DH5α,单、双酶切鉴定并测序;阳性克隆目的片段亚克隆到表达载体pET–23a(+)上,转化大肠杆菌DH5α,单、双酶切鉴定重组质粒;阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,并经IPTG诱导表达。SDS–PAGE电泳检测表明,冰核基因iceA能够并以包涵体形式表达,相对分子质量约为180 000。冰核活性测定结果表明,重组菌BL21(DE3)pLysS/pET–ice的冰核活性与野生冰核细菌Erwinia ananas 110在–5、–4、–3、–2 ℃下无明显差别。     

冰核活性细菌的分子生物学及防霜技术的研究进展

 从冰核活性细菌的分子生物学基础上,研究冰核细菌的基因遗传背景。并提出了冰核细菌的研究方法,防霜新技术的开发应用及冰核细菌在不同领域的应用等方面阐述冰核活性细菌的研究进展。     

运用冰核活性细菌降低害虫的抗寒能力

 昆虫体重的60%～80%由水分组成,由于水的过冷却特性,使得昆虫在一定的低温条件下不会因体内结冰而死亡。这也是昆虫具备抗寒能力,越冬后仍能生存的主要原因。昆虫应付冬季低温的策略因种类而异。冰核活性细菌能提高昆虫的过冷却点,使其在较高的亚零下温度下体内结冰,从而提高避免结冰类型昆虫的越冬死亡率。因此,利用INA细菌控制害虫的种群数量,广泛引起了各国科学家的关注。