琯溪蜜柚黄龙病病原的克隆及序列分析

Guan溪蜜油是中国大陆柚类中的优质品种。近年来，在福建省的产地发现Guan溪蜜油叶片表现斑驳的病树，其叶片斑驳与柑桔黄龙病的叶片病状十分相似。据实验结果证明：该病能通过病梢嫁接传染到柚和柑桔的健苗；在电镜下观察到病株韧皮部寄生着大量BLOs，其形态和构造均与柑桔黄龙病病原（Liberobacter asiaticum)相似，经PCR扩增与Southern Blot分子杂交测定，表明该病原DNA PCR产物与柑桔黄龙病病原PCR产物之间具有很高的同源性。初步认为该病很可能是柑桔黄龙病引起的。为了进一步明确该病与柑桔黄龙病的关系，对病原DNA片段进行扩增、克隆和序列分析，并与柑桔黄龙病病基因相应序列进行比较，结果表明该病原与亚洲柑桔黄龙病病原（Lasiaticum）相应基因序列的同源率达94．2％，而与非洲柑桔黄龙病病原（L.africa num)的同源率仅为75．0％。进一步证明Guan溪蜜油叶片斑驳是柑桔黄龙病引起的，其病原是L.asiaticum中的一个成员。     

南方5省区柑橘黄龙病病原16S rDNA片段的克隆与序列分析

采集了广东、广西、贵州、福建、云南5省区的8个柑橘黄龙病样品,利用黄龙病病原的特异引物对其16S rD-NA片段进行PCR扩增,将其扩增产物纯化、回收,并与 pMD18-T Vector 连接,转化大肠杆菌(Esherichia coli)DH5α,筛选含有黄龙病病原16S rDNA片段的阳性克隆,进行序列测定.利用生物信息学软件对所克隆的序列进行同源性分析和聚类分析.结果表明:来自我国南方5省区的柑橘黄龙病病原16S rDNA的序列与亚洲种(L22532)的同源性为96.9%～98.6%,与非洲种(L22533)的同源性为94.5%～97.1%,与美洲种(AY742824)的同源性为92.5%～94.2%.表明我国南方5省区柑橘黄龙病均属于亚洲种,但在亚洲种内部不同地区的黄龙病病原也发生了微小的变异,其中福建厦门和云南个旧的2个菌株变异较大.     

南方5省区柑橘黄龙病病原16αSrDNA片段的克隆与序列分析

采集了广东、广西、贵州、福建、云南5省区的8个柑橘黄龙病样品,利用黄龙病病原的特异引物对其16SrD—NA片段进行PCR扩增,将其扩增产物纯化、回收,并与pMD18-TVector连接,转化大肠杆菌（Esherichia coli）DH5α,筛选含有黄龙病病原16SrDNA片段的阳性克隆,进行序列测定。利用生物信息学软件对所克隆的序列进行同源性分析和聚类分析．结果表明：来自我国南方5省区的柑橘黄龙病病原16SrDNA的序列与亚洲种（L22532）的同源性为96．9％～98．6％,与非洲种（L22533）的同源性为94．5％～97．1％,与美洲种（AY742824）的同源性为92．5％-94．2％．表明我国南方5省区柑橘黄龙病均属于亚洲种,但在亚洲种内部不同地区的黄龙病病原也发生了微小的变异,其中福建厦门和云南个旧的2个菌株变异较大．     

柑桔黄龙病诊断法的研究进展

研究柑桔黄龙病的困难,在于它的病原无法人工培养。因此,长期以来对黄龙病的诊断,主要依据典型的黄梢和叶斑驳症状。在柑桔园管理不良,缺乏营养或其它病虫混合为害时,便难依据症状作出正确的诊断。这是造成对黄龙病认识上病的重要手段。但因病原在病树体我较低,分布又不均匀,致电镜的检出率偏低。８０年年代,应用兔丝子将黄龙病ＢＬＯ转到长春花上增殖、提纯、作为抗原、制备了多抗和单抗的血甭,由于多因清的效价很低和单抗     

黑曲霉木聚糖酶和β-葡聚糖酶cDNA片段克隆和序列分析

木聚糖酶（1,4-β-xylanase, EC 3.2.1.8)以内切方式水解木聚糖分子中β-1,4-木糖苷键，其水解产物主要为木二糖及木二糖以上的寡聚木糖，也有少量的木糖和阿拉伯糖。该酶不仅对于降解自然界大量存在的半纤维素起着重要作用，而且也具有潜在的应用前景，如在造纸工业中用它作为纸浆的漂白剂,饲料工业中可提高纤维类饲料的消化利用率。β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)能分解大麦中以β-1,3和β-1,4混合键连接的结构性非淀粉多糖β-D-葡聚糖，属于半纤维素物质。在啤酒工业中应用β-1,3-1,4-葡聚糖酶，可提高麦汁分离速度，减少啤酒混浊度和胶状沉淀物，从而改善啤酒质量；在大麦日粮中，可改善谷物营养价值，提高畜禽生长速度和饲料转化率。因而木聚糖酶和β-1,3-1,4-葡聚糖酶作为重要经济价值酶，对于生物资源的开发利用具有重要作用。研究结果表明，微生物的木聚糖酶存在着多态性，有关黑曲霉木聚糖酶基因在国内尚未见报道。β-1,3-1,4-葡聚糖酶及其基因方面的报道主要为芽孢杆菌，在真菌中仅报道厌氧菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因。我们克隆了黑曲霉FS6的木聚糖酶和β-1,3-1,4-葡聚糖酶的cDNA片段并分析了序列。……     

湘南地区柑橘黄龙病的PCR检测

针对近年湘南部分柑橘产区出现叶片黄化、果实畸形及全株矮化、橘树枯死等柑橘黄龙病疑似症状,应用多聚酶链式反应(PCR)技术对湘南8个柑橘产区的柑橘进行了检测,结果发现6个柑橘产区有柑橘黄龙病为害.同时建立了一套快速、准确的柑橘黄龙病PCR检测技术体系.     

根结线虫rDNA-ITS片段的克隆与序列分析

用PCR方法扩增了16个不同地区和不同作物上根结线虫群体的ITS片段,并进行了克隆、序列测定分析和比对。结果表明:采自北京密云苦瓜和豇豆、北京通州月季以及山东胶州、烟台、潍坊花生上的6个根结线虫群体为北方根结线虫(Meloidogyne hapla),其ITS片段大小为772 bp;来自云南番茄、成都黄瓜和海南石榴上的3个根结线虫群体为爪哇根结线虫(M.javanica),其ITS片段大小为767 bp;来自河北廊坊番茄、北京海淀番茄和浙江黄瓜上的3个根结线虫则属于花生根结线虫(M.arenaria),其ITS片段大小为768 bp;而安徽和县、宿州的番茄以及太和桔梗上的3个根结线虫则属于南方根结线虫(M.incognita),其ITS片段大小为766 bp;海南胡椒上的根结线虫群体为番禺根结线虫(M.panyuensis),ITS片段大小为869 bp。     

鸡IL—1βcDNA片段的克隆及序列分析

本文以鸡外周血单个核细胞总ＲＮＡ为模板,据已报道的８种哺乳动物ＩＬ－１β核酸序列保守区设计合成１对引物,反转录合成ｃＤＮＡ链,经ＰＣＲ扩增,回收扩增后ＤＮＡ片段,用ｋｌｅｏｎｏｗ酶处理,与Ｐ＾ｕｃ１９／ＳｍａＩ连接构成重组质粒,转化宿主菌大肠杆菌ＪＭ１０９,筛选出含有插入片段的重组质粒,用ＰＣＲ及酶切分析鉴定,结果表明获得了带有鸡了ＩＬ－１β片段的ｃＤＮＡ克隆,再经序列分析测定,得知此片段长为２７     

广东株家蚕微孢子虫特异DNA片段的克隆与序列分析

利用碱裂解方法抽提广东株家蚕微孢子虫(Nosema bombycis Naeegeli，N．b．)基因组DNA，通过PCR技术扩增得到了N．b．的一段特异DNA片段。对该目的片段的序列分析发现，该特异DNA片段大小为317bp，与Malone等报道的日本株N.b．特异DNA片段大小一致，但核苷酸序列同源性仅为92．1％。     

刺五加ATP合酶β亚基基因的克隆与序列分析

[目的]克隆刺五加叶绿体的ATP合酶β亚基cDNA并对其进行生物信息学分析。[方法]根据已知物种叶绿体ATP合酶β亚基基因的序列,设计1对同源引物,通过RT-PCR扩增得到刺五加ATP合酶β亚基cDNA,并对其进行序列比对及结构预测分析。[结果]RT-PCR扩增获得了长1 099 bp的刺五加ATP合酶β亚基cDNA,该基因编码366个氨基酸。序列比对及结构预测分析表明,刺五加ATP合酶β亚基基因编码的氨基酸与水稻的同源性最高,达96.41%。其二级结构中含有171个α螺旋(alpha helix),占46.72%;53个延伸链(extended strand),占14.48%;27个β折叠(beta turn),占7.38%;115个无规则蜷曲(random coil),占31.42%。第262～271位氨基酸为ATP合酶β亚基的标志性位点。整个多肽链无明显的疏水区域,初步认定为亲水性蛋白。[结论]该试验克隆得到的ATP合酶β亚基基因为叶绿体ATP合酶β亚基基因,为研究刺五加能量代谢对植物次生代谢的影响及了解植物ATP合酶的结构与功能提供了必要的信息。     

柚类果树叶片斑驳病的病原鉴定与检测

柚类是柑桔中的一类重要品种,在我国有广泛的分布、近年来,在福建等产区发现柚类病树日趋２增多、基病状为叶片斑驳、小果、植株矮化、暂称为叶片斑驳病。本有通过组织嫁接从病柚树传染到柚健苗和芦柑健苗。在电下观察,其病原功体的形态和细胞壁构造与柑桔黄龙病的病原十分要似。应用柑桔黄龙病病原ＤＮＡ的特异性引物进行ＰＣＲ试验产生的ＰＣＲ产物,其分子量与柑桔黄龙病病原ＤＮＡＰＣＲ产物的基本相同,为５６３ｂｐ;以及应     

北京鸭血管活性肠肽基因cDNA片断的克隆及序列分析

为从北京鸭胃肠道中扩增血管活性肠肽(VIP)基因,根据鸡VIP基因(GenBank登录号X80906),设计了一对简并引物,从北京鸭腺胃、十二指肠和空肠提取总RNA,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,将从腺胃、十二指肠和空肠中扩增出的产物克隆到pGEM-Teasy载体上,导入大肠杆菌JM109,阳性克隆经双酶切鉴定后测序,将测序结果与鸡和鹅(GenBank登录号为DQ023161)的VIP基因进行同源性比较。本试验扩增到的VIP基因与已知的鸡和鹅核苷酸序列比较,同源性分别为94.61%和94.42%,氨基酸序列同源性分别为93.75%和95.71%。本试验首次成功从北京鸭腺胃、十二指肠和空肠扩增到长度为240 bp、编码VIP的基因片断(已提交GenBank,登录号DQ200173)。     

甘蔗乙烯受体基因Sc-ERS的克隆与序列分析

根据已知乙烯受体基因的序列信息,设计1对简并引物和1对特异引物,对甘蔗叶片基因组DNA进行PCR扩增,获得1个甘蔗乙烯受体基因（Sc-ERS）的片段,其大小为4310 bp,包含1个由5个外显子和4个内含子组成的4219 bp大小的完整编码区。Sc-ERS编码区与玉米乙烯受体ERS1基因（AY359578）、水稻乙烯受体ERS1基因（AY043031）编码区的同源性分别为91.4%、61.6%;推导Sc-ERS编码的蛋白包含636个氨基酸残基,与玉米、水稻乙烯受体基因所编码蛋白的氨基酸同源性分别为94.1%、89.4%。其推导蛋白结构分析结果显示,Sc-ERS编码的蛋白和玉米、水稻ERS1所编码的蛋白相同,在N段保守区含有3个跨膜结构,并由3个跨膜结构、GAF结构、HisKA和HATPase_c组成功能域。核苷酸序列分析和蛋白质结构分析结果表明,Sc-ERS基因属于ERS1基因。     

中国实验小型猪朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已发表的猪朊蛋白基因（PRNP）序列设计特异性引物，进行PCR直接扩增，得到了中国实验小型猪（CEMP）的朊蛋白基因（PRNP），将其克隆到pGEM-TEasy载体中。序列分析表明上述CEMP的PRNP基因ORF区全长为774bp，编码257个氨基酸的前体蛋白，分子质量约为28．3ku，其PRNP序列与已发表的猪PRNP序列（L07623）差异微小，仅在第4位氨基酸残基处有变异（Ser→Asn）；绘制CEMP与其他15种属动物朊蛋白的氨基酸序列进化树发现，CEMP与多种哺乳动物朊蛋白的氨基酸序列遗传距离比较接近，与水貂最近。而与禽类朊蛋白氨基酸的遗传距离较远。     

Monitoring and controlling measures of Huanglongbin disease in Guanxi pomelo plant

通过对采集的琯溪蜜柚的各种典型黄花症状样品进行黄龙病病原PCR测定,在分析病害症状并进行实时监测的基础上,提出及时铲除病株和防治木虱、严格控制外来种苗的进入等防控措施。     

A型肉毒毒素重链C片段基因的克隆及序列分析

成功克隆了A型肉毒毒素重链C片段部分基因．以肉毒梭菌(62A)基因组DNA为模板，以此基因特异性引物为介导，采用Touchdown PCR方法，从肉毒梭菌基因组中扩增出目的基因片段后，将其克隆入T载体，进行酶切鉴定和序列分析．结果表明，此基因片段与(Genbank中的BoNTa基因(收录号：M30196)核苷酸序列的同源性为100％，说明目的基因得到了成功地克隆，为后续研究奠定了基础．     

豚鼠ESR2基因新的可变剪接体克隆及序列分析

[目的]对豚鼠雌激素受体2(ESR2)基因进行克隆及序列分析,并预测分析其编码的蛋白序列,为提高豚鼠产仔性能及其育种打下基础.[方法]根据GenBank已公布的豚鼠ESR2基因序列(登录号XM003472337)设计引物,以豚鼠卵巢组织总RNA为模板,RT-PCR扩增ESR2基因编码区序列(CDS),利用生物信息学分析其编码蛋白氨基酸的组成及理化性质、二级结构及与相关物种的同源性.[结果]克隆获得的豚鼠ESR2基因CDS长度为1650bp,编码549个氨基酸,比参照序列(XM 003472337)少54个碱基,是ESR基因新的可变剪接体,且第7外显子缺失;蛋白质二级结构预测结果表明,豚鼠ESR2成熟肽包含α螺旋、β折叠和无规卷曲3种二级结构元件,由于缺失18个氨基酸导致蛋白质结构发生变异;同源性分析结果显示,豚鼠与长尾龙猫、奥氏更格卢鼠、马、达马拉鼹鼠、裸鼢鼠、鼠狐猴、八齿鼠、猪和人的ESR2基因序列同源性分别为91%、87%、86%、91%、92%、86%、88%、92%和86%.[结论]克隆获得的豚鼠ESR2基因为新的可变剪接体,可作为研究豚鼠产仔性能及豚鼠育种重要的候选基因之一.     

猪源新城疫病毒SP13株的F基因克隆及序列分析

采用RT-PCR方法对猪源新城疫病毒(NDV)SP13株的F基因进行了扩增与克隆,并测定出F基因的核苷酸全序列,推导出氨基酸序列.F基因全长为1662 bp,单一的开放阅读框,编码553个氨基酸的长肽,裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,与弱毒株在这一区域的序列(112G-R/K-Q-G/S-R-L117)相符;F蛋白有6个潜在的糖基化位点和13个Cys残基位点,其疏水构型有3个强疏水区.通过同源率、系统发育、致病性、疏水性和抗原性等比较分析的结果表明,SP13与LaSota、Clone 30株不但同源性达到99.9%,而且在致病性、疏水性和抗原性等方面也极为相似.     

Cloning and Sequence Analysis of a Novel Cold-Adapted Lipase Gene from Strain Iip35 (Pseudomonas sp.)

A combination method of the usual-PCR and reverse-PCR for the cloning of a novel lipase gene directly from the total genomic DNA of strain lip35 (Pseudomonas sp.) is described, whereby a lipase gene (lip) was cloned directly from genomic DNA. The sequence data have been deposited in the GenBank and EMBL data bank with the accession number EU414288. The nucleotide sequence showed a major open reading frame encoding a 59-kDa protein of 566 amino acid residues, which contained a lipase consensus sequence GXSXG. The lipase lip had 74 and 70% homologies with the Upases of an uncultured bacterium and P.fluorescens PfO-1, respectively, but it did not show any overall homology with lipases from other origins. The functional lipase was obtained when the lip gene was expressed in Pichia pastoris GS115.