诱导玉米抗弯孢菌叶斑病促生细菌的鉴定及生防效果评价

玉米弯孢菌叶斑病是玉米生产上的重要病害之一。［目的］为获得一株有效的抗玉米弯孢菌叶斑病的生防细菌,［方法］本研究采用生防细菌包衣处理玉米种子的方法,将前期田间初筛得到的4株生防促生细菌进行室内和田间防效评估,获得一株防效最好的菌株。进一步通过室内和田间试验验证该菌株对玉米的促生和增产作用,并采用形态学、生理生化和分子生物学分析方法对其进行鉴定。［结果］结果表明,4株生防细菌中,菌株Sneb2249对玉米弯孢菌叶斑病的防效最好,盆栽防效为55.04%,田间防效为39.36%。室内促生和田间测产试验结果显示,菌株Sneb2249能够显著促进玉米植株生长,其株高、地上部干重和千粒重分别比对照提高24.89%、49.15%和 7.9%。经鉴定菌株Sneb2249为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。［结论］恶臭假单胞菌Sneb2249是一株优良的植物根际促生菌,既可抗弯孢叶斑病菌,又对玉米具有促生增产作用。利用有益微生物处理种子防控病害将是一种新型的植保措施,具有重要的研究意义。     

非培养方法解析烟草根部内生细菌的群落结构

为了解烟草根部内生细菌多样性,采用改进的CTAB法提取烟草根部总DNA,利用细菌16 S rDNA基因通用引物对烟草根总DNA进行16 S rDNA扩增,构建烟草根部内生细菌16 S rDNA克隆文库;挑取具有不同酶切谱型的克隆进行测序、比对并构建16 S rDNA基因系统发育树。构建的烟草根部内生细菌16 S rDNA克隆文库中,155个克隆分属于36个不同的分类单元,Blast结果表明,大部分克隆与已知细菌的16 S rDNA序列相似性较高,分别属于变形菌门(Proteobacteria)的Alpha、Gamma、Beta亚群,放线菌门(Actinobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes),厚壁菌门(Fir-micutes)中的肠杆菌属(Enterobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、寡养食单胞菌属(Stenotrophomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylobacillus)、食酸菌属(Acidovorax)、芽孢杆菌属(Bacillus)等16个属,其中13.5%的克隆序列与非可培养细菌(Uncultured bacteria)的相似性在93%～99%之间,假单胞菌属细菌是烟草根部内生细菌的优势种群。这些研究结果说明烟草根部存在较为丰富的内生细菌系统发育多样性,并且潜藏着未知的内生细菌资源。     

酵母耐铜基因CUP1改良荧光假单胞菌耐铜性研究初报

利用根际促生菌（PGPR）荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）等微生物的生物修复作用可治理土壤重金属污染。酿酒酵母耐铜基因CUP1编码铜金属硫蛋白（Cu-MT）,对铜有很高的亲和性,可拮抗重金属铜毒性。为提高荧光假单胞菌的生物修复能力,将酿酒酵母耐铜基因CUP1克隆至荧光假单胞菌。通过引物设计,将SD序列添加至酵母耐铜基因CUP1编码序列前端,PCR扩增得到约200bp的CUP1片段,克隆至测序载体pUC19,经测序证明正确后,胶回收CUP1片段连接到具有广泛宿主范围的柯斯质粒pLAFR3上,经三亲接合转移至荧光假单胞菌AS1.1381,得到重组菌株AS1.1381/pL3CUP1。铜实验表明,重组菌株AS1.1381/pL3CUP1的抗铜能力（6mM Cu2+）显著高于AS1.1381/pLAFR3（4.5mM Cu2+）,重组菌株抗铜性得到提高     

海南辣椒尖孢镰刀菌拮抗内生细菌的分离与鉴定

为了获得对辣椒尖孢镰刀菌具有较好防治效果的内生细菌,课题组于2022年1～3月份在海口、定安、澄迈、临高和陵水等海南辣椒主产区采样,并从健康辣椒样品中分离获得内生细菌192株,其中39株对辣椒尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) CMTT4-1有拮抗作用,分别来源于根系(23株)、茎秆(2株)、叶片(8株)和果实(6株),有拮抗作用菌株占比20.31%,抑菌率为10.68%～59.02%。通过形态学和16S rDNA序列测定及同源性分析,初步鉴定芽孢杆菌属(Bacillus spp.)细菌36株、短杆菌属(Brevibacterium spp.) 1株、农杆菌属(Agrobacterium spp.) 1株和假单胞菌属(Pseudomonas spp.) 1株。研究结果为辣椒枯萎病的生物防治提供了菌株来源。     

辣椒内生固氮菌的分离鉴定与多样性分析

通过分离湖南省不同地区辣椒的内生固氮菌,探索其多样性,为内生固氮菌资源应用于现实生产提供理论依据。利用改良无氮培养基对辣椒的根、茎、叶中内生固氮菌进行分离和纯化,并进行菌落计数比较其菌群密度,再对分离出的菌株进行16S rDNA序列扩增,分析其多样性,最后通过乙炔还原法结合气相色谱法测其固氮酶活性。结果筛选到内生固氮细菌30株,经16S rDNA序列刚定和分析,结果显示土壤杆菌属(Agrobacteriumsp.)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、泛菌属(Pantoeasp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)相对频率较高,是辣椒内生固氮菌的优势种。经乙炔还原法测定固氮酶活性表明,该30株菌株均具有较弱固氮酶活性,范围为4~183nmol/(mL.h),且不同地区同种菌的固氮酶活性存在一定差异。     

地黄连作障碍机制分析

本研究采用土壤微生物平板分离技术和16S rRNA基因序列分析技术,旨在研究化感细菌与地黄生长的关系,阐明引起地黄连作障碍的原因。从地黄连作1年的土壤中分离到19株细菌,其中2株细菌为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida DH03)和河生肠杆菌(Enterobacter amnigenus DH05);DH03菌株和DH05菌株不侵染地黄叶片,但其代谢产物对地黄叶片及块根有毒害作用,为典型的化感细菌;而地黄块成分对DH03菌株和DH05菌株的生长有促进作用。根据化感细菌与地黄的相互作用,提出了引起地黄连作障碍的化感细菌作用假说,化感细菌的化感作用是引起地黄连作障碍的重要原因之一。     

荧光假单胞菌工程菌株的构建及对黄瓜枯萎病的防治效果

采用基因工程的方法,将含有2,4-DAPG基因的质粒pMON5122导入到野生型荧光假单胞菌株中,探索了不同热激时间、不同CaCl2浓度和荧光假单胞菌的不同生长时期对转化子形成的影响;研究了荧光假单胞菌工程菌株对黄瓜枯萎病的防治效果。结果表明,荧光假单胞菌生长到OD约0．53时,用0．025mol／L CaCl2处理细胞,热激3～4min,转化频率最高;荧光假单胞工程菌株对黄瓜枯萎病的盆栽防治效果达到75．0％,并且能够提高黄瓜出苗率。     

含苏云金芽孢杆菌aiiA基因的重组荧光假单胞菌的构建及对软腐病的抗病活性

aiiA基因编码的AiiA蛋白能降解细菌群体感应系统中的信号分子N_酰基高丝氨酸内酯AHLs,从而减弱致病菌对植物的危害。本文将aiiA基因转入到植物根际促生细菌荧光假单胞菌P303中,构建成防治植物细菌和真菌病害的工程菌P303-ss10。通过PCR和RT-PCR鉴定,均获得0.8 kb的目的片断,表明aiiA基因已经导入P303中。室内平板抑菌试验表明,该工程菌保留了出发菌株对多种植物病原真菌的抑制作用;室内离体试验表明该工程菌对马铃薯软腐病和大白菜软腐病都有一定的抑制作用。     

基于ipaH基因的志贺菌LAMP检测方法的建立及应用

为建立一种快速、特异、敏感的志贺菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法,试验针对志贺菌属侵袭性质粒抗原H基因(invasive plasmid, ipaH)设计一套特异性引物,条件优化及特异性和敏感性验证后建立了该菌的LAMP检测方法,并应用于临床样本的检测。结果显示,62℃恒温扩增1 h能得到明显的扩增产物,除志贺菌标准菌株扩增结果为阳性外,沙门菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和阴性对照均为阴性,检测限值达到120 fg/μL。利用建立的方法检测了20株疑似菌株和38份粪样样品,结果显示20株疑似菌和27份粪样样品为阳性,阳性率分别为100%和71.05%,说明建立的LAMP检测法具有良好的特异性和敏感性,在粪便等临床样本中志贺菌的检测与鉴定方面具有优势和应用前景。     

猪2型链球菌河北株的分离及PCR鉴定

对河北省某规模化猪场病死猪进行临床诊断和实验室诊断,通过采取病料直接涂片染色镜检,病原分离培养,初步怀疑为链球菌。对纯化的分离细菌进行动物试验、生化试验,确定该病原菌为链球菌。分离菌经过液体增菌后,提取细菌基因组DNA,用荚膜多糖基因的特异性引物分别扩增出与设计大小相符条带,将PCR产物送至上海生物工程有限公司进行序列测定,并进行序列分析,确定为该菌株为猪链球菌2型。     

ALA对低温胁迫下西葫芦幼苗光合特性的影响

为深入了解5-氨基乙酰丙酸（ALA）对西葫芦生长影响的光合生理机理,以‘早青一代’西葫芦为材料,研究ALA对低温胁迫下西葫芦幼苗光合特性的影响。结果表明,低温胁迫下,西葫芦幼苗叶绿素含量显著降低,净光合速率显著降低,单株叶面积和物质积累极显著减少;60 mg/L的ALA可以减缓低温胁迫对西葫芦幼苗的影响,使总叶绿素含量增加29.96%,净光合速率（Pn）增加52.96%,叶面积增加39.80%,单株物质积累增加43.75%。60 mg/L的ALA缓解低温胁迫对西葫芦幼苗的影响主要是通过叶绿素的增加和非气孔因素实现的。     

5-氨基乙酰丙酸对绿豆碳代谢及产量的影响

以绿豆品种绿丰2号和绿丰5号为材料,设置5-氨基乙酰丙酸（ALA）拌种处理,未用ALA拌种为对照,研究ALA对始花期绿豆碳代谢及产量的影响。结果表明,ALA提高了2个绿豆品种叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素含量,同时显著增强了2个绿豆品种叶片净光合速率、气孔导度以及蒸腾速率,提高了胞间CO₂浓度与外界CO₂浓度比值,降低了气孔限制值。ALA能有效提高2个品种光合系统潜在活性（F_v/F_o）,分别较对照增加11.98%和5.49%,显著提高了实际光化学量子效率,提高了功能叶片蔗糖含量,降低淀粉含量,并提高了蔗糖合成酶活性,降低了酸性转化酶活性。ALA可有效促进V1–V5期绿豆叶面积指数增加。拌种处理通过改善绿豆百粒重、单株粒数、单株粒重及单株荚数等产量构成因素来提升产量。综上,ALA能够有效改善不同绿豆品种的光合特性和碳代谢途径。     

干旱对不同品种小麦幼苗的生理生化胁迫以及外源5-氨基乙酰丙酸的缓解作用

黄淮主产区冬小麦生育期干旱灾害发生频繁,造成小麦苗期严重光合生理伤害。为探讨不同小麦品种光合特性对干旱胁迫的响应,以百农207,周麦18以及小麦新品种郑麦1860为材料,研究了干旱胁迫对不同品种小麦幼苗光合生理、抗氧化物酶、相关基因表达水平的影响以及外源ALA的干旱缓解作用。研究结果表明,干旱胁迫下郑麦1860具有较高的根干重和根冠比,与周麦18相比,抗旱能力较强的郑麦1860和百农207叶绿素含量的下降幅度、MDA含量的增加幅度、叶绿素荧光参数和光合作用参数的下降幅度相对较低,但SOD和CAT酶活性的增加幅度相对较大。同时,干旱胁迫显著增加了CAT、SOD-Cu/Zn、MnSOD和FeSOD抗氧化酶相关基因的转录表达水平,且增加程度与小麦的抗旱能力密切相关。外源ALA预处理能够通过对CAT、SOD-Cu/Zn和MnSOD的转录诱导,进一步提高干旱胁迫下SOD和CAT酶的活性,降低膜脂过氧化损伤程度,同时提高ATP酶的活性,缓解干旱对小麦光合生理的伤害。此外,本研究首次发现,小麦叶绿体光合机构相关psb28基因转录表达的维持也与不同品种的抗旱能力有一定联系,且受外源ALA预处理的显著诱...     

5-ALA对干旱胁迫下小麦幼苗光合作用及D1蛋白的调节作用

为了探究5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid,5-ALA）对干旱胁迫下小麦幼苗光合作用损伤的缓解机制,选用矮抗58小麦品种为试验材料,在两叶一心期对叶片喷施浓度为100mg/L的5-ALA,处理3d后对根部施加20%聚乙二醇6000（PEG-6000）模拟干旱环境,2d后取样进行光合以及psbA基因表达分析和D1蛋白含量测定。结果表明,干旱胁迫明显降低了小麦叶片的相对含水量以及叶绿素含量,而喷施外源5-ALA能够明显缓解干旱造成的伤害,同时也减缓了干旱胁迫下小麦幼苗净光合速率（P_n）、实际光化学效率（Φ_PSⅡ）、原初光化学效率（F_v/F_m）和光化学猝灭系数（q_P）值的降低,以及非光化学猝灭系数（q_N）值的升高,并且提高了psbA基因表达水平和D1蛋白的含量。以上结果显示,喷施外源5-ALA可缓解干旱胁迫下小麦幼苗的光合性能,同时诱导psbA基因表达水平提高,加快新D1蛋白的合成与受损D1蛋白的降解,从而提高小麦幼苗的干旱胁迫耐受性。     

叶面喷施5-氨基乙酰丙酸对不同密度春玉米生长特性和产量的影响

为探讨5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid,ALA）对不同密度春玉米生长发育和产量的影响,以中单909为材料,在玉米9展叶时期叶面喷施100mg/L ALA,以喷施等量清水为对照,在大田条件下研究ALA对不同密度春玉米群体（45 000、75 000、105 000株/hm ²）的作用效果。结果表明：ALA处理下,玉米45 000和75 000株/hm ²密度群体产量分别比对照增加9.7%和4.9%,75 000株/hm ²密度群体千粒重和收获期单株干物质积累量分别增加3.7%和4.3%,花后叶面积指数平均增加6.8%,SPAD值比对照分别平均增加2.5%,净光合速率平均比对照高15.7%。综上所述,ALA处理改善了大田玉米的群体结构,延缓了叶片衰老进程,提高了地上部分干物质积累量,进而提高了玉米单产水平,因此可作为东北春玉米高产稳产的技术措施。     

紫苏酪氨酸氨基转移酶基因片段的克隆及表达分析

为获得紫苏迷迭香酸合成途径中的酪氨酸氨基转移酶基因,本研究采用同源克隆的方法,根据已报道的其他物种的TAT基因序列设计并合成简并引物,成功克隆得到了紫苏TAT基因片段（GenBank登录号：JN032113.1）,该片段长为579 bp,共编码193个氨基酸残基,并命名为PfTAT。氨基酸序列比对分析发现其与彩叶草、丹参、拟南芥和罂粟的一致性分别为97%、94%、69%和58%,系统进化树分析表明PfTAT与唇形科植物的亲缘关系最近。采用半定量RT-PCR法分析PfTAT在紫苏的根、茎、叶中均有表达,且叶中的表达量较高,内源性植物激素信号分子对PfTAT表达量影响的实验表明,脱落酸、水杨酸处理均能够不同程度得上调PfTAT转录水平的表达。     

反相高效液相色谱检测低浓度5-氨基乙酰丙酸

建立了一种柱前衍生反相高效液相色谱检测溶液中低浓度5-氨基乙酰丙酸的方法,填补了低浓度ALA的HPLC法检测的空白。使用Agilent SB-C18型色谱柱(250 mm×4.6 mm i.d.,5 μm),以50 mM甲醇-醋酸钠缓冲溶液(pH 4.0)洗脱,流速为1 mL/min,柱温30℃,254 nm波长下检测10 min。在此条件下,5-氨基乙酰丙酸在浓度为1~1000 mg/L范围内与色谱峰面积值之间线性关系良好,回归系数均在0.9999以上。发酵液产物的加标回收率平均值为101.7%。将检测结果与分光光度法相比,符合较好。测试数据表明,此方法简单、可靠,对于低浓度的ALA测定效果良好。     

玫瑰RdGASA4-like基因启动子的分离及其在甘蓝中的瞬时表达分析

在前期的研究中,一个玫瑰RdGASA4-like基因的cDNA和DNA序列全长利用同源克隆结合RACE的方法首次得到克隆。为深入了解该基因在赤霉素调控植物发育过程中的作用,通过TAIL-PCR的方法首次克隆该基因起始密码子ATG上游685bp的5’-UTR和部分启动子序列,在启动子序列分析的基础上,构建其与GUS基因融合表达载体,命名为pBI-GP685。通过农杆菌介导的方法对甘蓝外植体子叶-子叶柄进行启动子瞬时表达研究,结果表明分离得到的启动子具有启动报告基因GUS表达的活性。     

紫苏羟苯基丙酮酸还原酶基因片段的克隆及表达分析

为了克隆紫苏迷迭香酸生物合成途径中的羟苯基丙酮酸还原酶基因(Hydroxyphenylpyruvate reductase gene, HPPR),通过已报道的其他物种的HPPR基因序列设计特异性引物,采用同源克隆的方法成功克隆得到了紫苏HPPR基因片段,并命名为PfHPPR（GenBank登录号：HM152567.1）,该片段长为426 bp,共编码142个氨基酸残基。根据蛋白比对结果,PfHPPR基因编码的氨基酸序列与彩叶草、鼠尾草和丹参的一致性分别为92%、93%和92%。采用半定量RT-PCR法分析该基因在紫苏叶中的表达最高,茎次之,根中相对较弱。内源性植物激素信号分子及外界刺激对PfHPPR表达量影响的实验表明PfHPPR的表达受脱落酸、水杨酸和UV-B信号调控途经的影响。     

SH-110菌海藻糖合成酶基因克隆、表达及酶学性质研究

为找到理想的工业化生产海藻糖合成酶基因工程菌,以长白山温泉SH-110基因组DNA为模板,PCR扩增编码Tres基因片段,克隆至pET-30a(+)原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3),实验中采用IPTG和乳糖同时进行对比诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和酶学性质研究。成功克隆了2912 bp的Tres基因,实验中发现加入IPTG和乳糖后,融合蛋白在胞内都得到了表达,而且添加乳糖诱导的蛋白表达量偏高。表达重组酶Tres相对分子量约为110 kDa,最适作用温度60℃,最适pH7.0。金属离子Ca2+、K+、Zn2+对重组酶有明显激活作用,Ba2+、Cu2+、Mn2+有明显抑制酶活作用。重组酶的动力学常数Km为8.823 mmol/L和Vmax为235.29 mmol/L。已成功在大肠杆菌表达重组Tres,为进一步研究利用基因工程菌生产大量海藻糖合成酶,进行大规模生产海藻糖提供理论依据。