本生烟瞬时表达系统快速检测RNAi载体沉默效果

RNA干扰(RNAi)技术是研究基因功能的一种常用方法。为快速检测RNAi载体的沉默效果,通过构建木薯eIF4E3基因的过量表达载体pAI-Ca4E3以及靶标木薯eIF4E3基因的RNAi表达载体p1300-Ca4E3,利用农杆菌注射法将表达载体在本生烟叶片中进行瞬时表达。半定量RT-PCR检测结果显示单独注射过量表达载体pAI-Ca4E3或与表达载体pCAMBIA1300共同注射的样品,农杆菌注射后第4天、第5天和第6天都能检测到木薯eIF4E3基因的高效表达,并且二者木薯eIF4E3基因表达量基本相同,说明木薯eIF4E3基因能在本生烟中高效瞬时表达,但是过量表达载体pAI-Ca4E3与干扰载体p1300-Ca4E3共同注射的样品,农杆菌注射后第4天、第5天还是第6天后都几乎检测不到木薯eIF4E3基因的表达,说明过量表达载体表达的木薯eIF4E3基因已被干扰载体有效沉默。研究结果表明,已建立同时表达靶标基因和干扰靶标基因的干扰载体的本生烟瞬时表达系统,并结合半定量RT-PCR进行RNAi载体沉默效果检测的方法。该方法在农杆菌注射4 d后就能有效的检测RNAi载体的沉默效果,具有快捷、操作简便等特点,为RNAi技术应用于基因功能研究提供简单、快捷、有效的证据。     

GFLVCP 基因 RNAi 载体构建及其在转基因烟草中的干涉效果

为探讨RNAi策略在抗GFLV基因工程中的效果,通过RT-PCR克隆获得了310 bp的GFLV外壳蛋白基因保守片段,采用Gateway技术将该基因片段连入目标载体pHELLSGATE12构建了RNAi植物表达载体,并通过农杆菌介导法转入烟草中,RT-PCR检测表明目的基因片段已整合到烟草基因组中并在RNA 水平上得到表达,病毒接种结果显示阳性植株的发病率明显低于对照,说明在转基因植株中dsRNA表达可干涉GFLV侵染过程。     

蚜虫基因RNAi载体的构建及其在转基因烟草中dsRNA的表达分析

RNAi机制可以通过dsRNA诱导同源mRNA的降解,从而导致该基因转录后沉默。RNA干扰作用从发现以来就具有了利用转录后基因沉默（PTGS）来进行抗虫的一种潜在可能性。针对dsRNA的这种作用,研究中提取蚜虫RNA,克隆出蚜虫Cathepsin B基因的干扰片段并构建出RNAi载体,转入本氏烟草中,在转基因烟草体内表达dsRNA。成功构建RNAi载体后,通过农杆菌转化和叶盘法将RNAi载体导入烟草中并采用组织培养方法培养出转基因烟草,通过PCR鉴定显示15株生根的转基因烟草中14株显示阳性。提取转基因烟草的RNA进行RT-PCR和Northern表达分析显示转基因烟草植株中dsRNA表达的存在。实验结果说明了在转基因植物体内表达RNAi载体可以产生dsRNA,从而在蚜虫进食植物时达到利用dsRNA抗蚜虫的作用。     

烟草orf25基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

杂种优势的利用可以有效地实现烟草高产、高抗、优质的育种目标,目前,培育雄性不育系是获取杂种烟草最有效的途径。研究发现orf25基因位于线粒体基因组中,与烟草雄性不育密切相关。本研究以烟草雄性不育相关基因orf25为研究对象,根据RNA干扰载体构建原则,将长度为606 bp的orf25基因干扰片段分别以正向、反向连接到大小为190 bp的linker连接片段的两侧,构成发夹结构的RNA干扰载体片段。将RNA干扰载体片段插入到中间载体pET30a上,最后克隆到植物表达载体pCAMBIA1301中,成功构建orf25基因的RNAi表达载体。利用农杆菌介导法将pCAMBIA1301-orf25-RNAi转入到烟草保持系中烟90中,经抗性筛选以及分子检测最终获得35株转pCAMBIA1301-orf25-RNAi烟草植株,其中阳性烟草有18株,转化率为51.4%。结果表明pCAMBIA1301-orf25-RNAi干扰载体已成功转入到烟草中烟90中。     

苎麻雄性不育相关基因atp6和atp9 RNA干扰载体的构建

植物线粒体基因缺陷是细胞质雄性不育的主要原因。为了获得苎麻atp6和atp9基因RNA干扰(RNAi)表达载体,根据已报道的苎麻atp6和atp9基因序列设计引物,利用RT-PCR克隆了atp6和atp9基因的部分cDNA片段,将目的基因正反向片段连接入RNAi载体pHANNIBAL,再将其表达框连入表达载体pCAMBIA 1300。结果表明,所克隆的cDNA片段经序列比对后确认为目的基因片段,经酶切和测序验证确认完成了atp6和atp9基因RNAi载体pCAM-6SR和pCAM-9SR的构建。atp6和atp9基因RNAi载体是验证苎麻雄性不育的基础,也为苎麻遗传工程改良奠定了技术基础。     

苎麻雄性不育相关atp6和atp9基因RNA干扰载体的构建

植物线粒体基因缺陷是细胞质雄性不育的主要原因。为了获得苎麻atp6和atp9基因RNA干扰(RNAi)表达载体,根据已报道的苎麻atp6和atp9基因序列设计引物,利用RT-PCR克隆了atp6和atp9基因的部分cDNA片段,将目的基因正反向片段连接入RNAi载体pHANNIBAL,再将其表达框连入表达载体pCAMBIA 1300。结果表明,所克隆的cDNA片段经序列比对后确认为目的基因片段,经酶切和测序验证确认完成了atp6和atp9基因RNAi载体pCAM-6SR和pCAM-9SR的构建。atp6和atp9基因RNAi载体是验证苎麻雄性不育的基础,也为苎麻遗传工程改良奠定了技术基础。     

花生△12-脂肪酸去饱和酶基因RNAi表达载体的构建

利用RNAi原理构建花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因的hpRNA表达载体,以抑制该基因的表达,获得高油酸/亚油酸比值的花生种质。根据花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因序列(GenBank:AF248739)设计引物,以豫花4号花生品种DNA为模板,克隆了该基因的启动子及长度约500 bp的外显子片段,在此基础上构建完成由自身启动子引导的花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因的反向重复片段RNAi载体pCAMBIA1301-Afad12Ri。     

紫花苜蓿LEA蛋白基因ihpRNA表达载体构建及烟草转化

根据紫花苜蓿LEA蛋白MsLEA3-1基因(GenBank登录号： EU665182)序列,设计两对含有酶切位点的特异性引物LEAf1/ LEAf2和LEAr1/ LEAr2,以构建好的PMD-LEA质粒为模板,分别合成用于构建干扰载体的正反义片段pMD-F和pMD-R,将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置,构建成含有发夹结构的RNAi载体pART-F-R,经过Not I酶切鉴定,证明载体构建成功。通过农杆菌介导的方法,以干扰表达载体pART-F-R转化烟草,经过PCR检测,得到16株阳性转基因植株,为MsLEA3-1基因的功能研究奠定基础。     

烟草(Nicotiana tabacum)生长素响应基因NtIAA27的克隆及功能分析

为了研究内源生长素信号路径对烟草烟碱合成的调控,本研究根据烟草基因组数据和PCR扩增获得烟草生长素响应蛋白NtIAA27基因RNAi干扰片段180 bp,将该基因180 bp的片段克隆至RNAi载体pHellsgate12中,并通过叶盘法将该基因转入烟草K326中。经过实时定量PCR检测获得两株敲除效率较高的转基因植株,对这两株转基因株系及非转基因材料进行烟碱含量测定,结果表明与非转基因植株相比,RNAi转基因植株的烟碱含量升高,表明内源生长素信号路径可以负调控烟草烟碱含量,本研究将为培育不同烟碱含量的烟草品种提供有价值的信息。     

采用一种新型RNAi载体培育转基因高直链淀粉马铃薯

采用PCR技术分别克隆nos终止子、烟草axi1内含子和烟草ubi.u4启动子,亚克隆部分与马铃薯Sbe1同源、部分与Sbe2同源的融合基因SIII,构建具有“ubi.u4启动子—反向SIII—反向nos终止子—axi1内含子—正向nos终止子”结构的异源3¢端UTR反向重复序列型RNAi载体pCUSNI,采用农杆菌介导法转化马铃薯品种陇薯3号、甘农薯2号和大西洋,获得了16个转基因植株,其中14个的块茎直链淀粉含量大幅度增加,表观直链淀粉含量介于53.80%~85.33%;但随着直链淀粉含量的升高,转基因马铃薯淀粉含量下降。半定量RT-PCR分析表明,在直链淀粉含量超过80%的转基因株系中检测不到Sbe1和Sbe2基因mRNA的积累。结果表明,异源3¢端UTR反向重复序列型RNAi载体pCUSNI能够高频、高效地同时抑制马铃薯Sbe1和Sbe2基因的表达,是一个优良的RNAi载体。以载体pCUSNI为基础,再以植物的其他基因为靶,只需在pCUSNI的BamH I和Sac I位点之间插入干涉片段替换SIII即可完成载体构建,而不必构建靶标基因的反向重复序列,使载体制备迅速便捷。     

菊花DgLsL基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

培育少侧枝的标准切花菊品种具有重要的实际意义。本研究利用RNAi的方法抑制菊花侧枝发育相关基因DgLsL基因的表达,以期得到侧枝生长受抑制的转基因植株。从切花菊‘神马’基因组DNA中克隆侧枝发育相关基因DgLsL基因,经过测序分析,将一个413bp长的保守片段连接到植物表达载体pBI121和pFGC5941,构建植物RNAi载体pBI121-R2,并运用农杆菌介导法将其导入切花菊‘神马’。结果:PCR得到的DgLsL基因片段测序后与GenBank上的DgLsL基因比对,DNA序列一致性为99.4%;构建的RNAi表达载体经过PCR和酶切证实外源基因的正确插入;转化后得到了18株抗性植株,PCR结果显示,12株抗性植株为阳性。本试验通过将DgLsL基因干扰片段导入切花菊,获得了转基因植株,以此为基础可进一步选育少侧枝的切花菊品种。     

亚麻MS2-F基因的RNAi表达载体构建

亚麻雄性不育相关基因MS2-F在亚麻花粉发育过程中起重要的作用。为了研究其功能,构建了2个RNAi载体。选定该基因的2个不同的片段,分别以正向和反向插入到pHANNIBAL载体中PDK intron的两侧,以形成hpR-NA表达盒。然后将hpRNA表达盒插入到pART27的NotⅠ酶切位点上,成功构建了2个亚麻MS2-F基因的RNAi载体。最后将载体导入到农杆菌LBA4404中。RNAi载体成功构建,为验证MS2-F基因在亚麻花粉发育过程中的生物学功能奠定基础。     

SPF鸡胚St3galⅠ基因的克隆及其在MDCK细胞中的表达

为了提高MDCK细胞表面禽流感病毒(AIV)受体的水平,以12日龄的SPF鸡胚为试材,通过反转录PCR扩增唾液酸转移酶Ⅰ基因(St3galⅠ),并将回收的片段插入到pMD18-T载体中。酶切pMD18-T-St3galⅠ和pCI-neo质粒,将目的片段进行连接,构建含有St3galⅠ基因的真核表达载体。利用脂质体介导法转染MDCK细胞,在G418的筛选下,获得具有抗性的转基因细胞系。通过细胞克隆化培养和PCR检测,筛选可稳定表达St3galⅠ基因的细胞株。结果表明,从鸡胚中克隆的St3galⅠ基因成功的插入到pCI-neo质粒,从而实现真核表达载体pCI-neo-St3galⅠ的构建。在G418选择压力下,初步获得了稳转目的基因的MDCK细胞系。将抗性细胞混合克隆进行稀释,经选择后挑选出30个单克隆抗性细胞株。分别以转染细胞基因组DNA和总RNA为模板,经PCR检测显示,目的基因已整合入MDCK细胞的基因组中并可稳定的进行表达。     

玉米特异启动子驱动下结核Hsp65与Esat-6融合基因表达载体的构建及鉴定

利用转基因玉米研制新型结核口服疫苗.构建植物双元表达质粒pCAMBIA1300GHLE,并转化农杆菌LBA4404.以本实验室构建的pEGHLE为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65-Esat6基因,连接到含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上;将globulin1-HLE联合片断切下连到含有抗除草剂基因bar的pCAMBIA1300载体中;电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中.成功构建了pC1300GHLE质粒,酶切鉴定得到3.3 kb和8.6Kb2条带,测序分析表明克隆的H8p65和Esat6序列与NCBI上公布序列一致;成功转化到农杆菌中,酶切从农杆菌中所提的质粒,条带大小与预期结果相符合.成功构建和转化了pCl300GHLE表达载体,为成功研制利用转基因植物生产抗结核口服疫苗奠定了基础.     

乙醇酸氧化酶基因植物表达载体构建及转化苹果的研究

为了研究GO基因在植物中的功能,获得转基因植株,用限制性内切酶将乙醇酸氧化酶(GO)基因从克隆载体pBSSP5上切下,连接到植物双元表达载体pBin117的CaMV 35S启动子和NOS 终止子之间,成功构建了GO基因植物表达载体pBinGO.在此基础上以嘎拉苹果叶片为受体,通过根癌农杆菌介导法将GO基因导入苹果,获得了2个抗性芽,PCR检测初步表明GO基因已整合到嘎拉苹果基因组中.     

棉花GhEPSPS基因的原核表达载体的构建及诱导表达

目的在于构建棉花GhEPSPS基因的原核表达载体,并在宿主大肠杆菌中成功诱导表达。利用RT-PCR技术从陆地棉苏棉18中克隆获得GhEPSPS基因的开放阅读框序列,连接到p EASY-Blunt平端载体,构建获得重组载体p EASY-Blunt-GhEPSPS;以该重组载体为模板,PCR获得两端含有Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点的GhEPSPS基因CDS序列,通过这2个酶切位点插入到p ET32a载体,构建获得原核表达重组载体p ET32a-GhEPSPS,转化到宿主菌株BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测目的基因的表达情况。研究结果表明,成功克隆获得了棉花GhEPSPS基因的CDS序列,并成功构建了该基因的原核表达载体,目的基因能够在宿主菌中被诱导大量表达。该研究结果将为深入研究棉花EPSPS酶的结构、功能以及酶学特性提供重要的研究基础。     

携带结核杆菌Ag85B基因的植物表达载体的构建及鉴定

构建包含结核杆菌Ag85B基因的植物表达载体,并转化农杆菌LBA4404。以pcDNA3-Ag85B为模板,通过常规PCR克隆出Ag85B基因,定向克隆至含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上,然后将globulin-1-Ag85B的融合片段酶切下来,并连接到经过加工修饰的含有抗除草剂基因bar的双元表达载体pCAMBIA1300上,将重组质粒转化至农杆菌LBA4404中。重组质粒双酶切可见0.8bp和10kb的两条特异性条带,与预期大小相一致。重组质粒测序表明克隆的Ag85B基因序列与Genbank上相一致,酶切从农杆菌中所抽提的质粒,片段大小与预期相一致。成功构建与转化了携带结核Ag85B基因的植物双元表达载体,为利用植物反应器生产口服结核疫苗奠定基础。     

TMV、CMV双价抗性RNA沉默表达载体的构建

本研究以在植物体内转录出RNA沉默的高效诱导因子双链RNA（dsRNA）为目标,根据已报道的TMV ΔMP和CMV ΔRep的核苷酸序列设计特异性引物,分别从质粒pBIN-TMV ΔMP(i/r)、pBIN-CMV ΔRep(i/r)扩增MP基因、Rep基因,并在pGEM-T Easy 载体上将2片段串联起来,再用PCR扩增串联好的正反向MP-Rep基因。正向MP-Rep基因用BamHI和Kpn I切下,将所得基因片段与用同样酶切开的含内含子的pKAN-In相连,取名+pKAN;用同样的方法,将反向MP-Rep基因用Xba I切下,将所得基因片段与用同样酶切开的+pKAN相连,取名pKAN-In-MP-Rep,再用Not I将包括Intron和正反向MP-Rep基因在内的片段切下,将其定向插入同样酶切开的pART27上,获得重组质粒pART27-In-MP-Rep。获得的载体可以应用于植物转基因抗病毒育种工程中。     

Loss-of-function of Nicotiana tabacum L. eukaryotic translation initiation factors eIF4E1-S and eIF(iso)4E-T synergistically confers high-level resistance to both Potato virus Y (PVY) and resistance-breaking PVY

The plant eukaryotic translation-initiation factors eIF4E and eIF(iso)4E play key roles in infection by plant RNA viruses, especially potyviruses. Mutations in the genes that encode these factors reduce susceptibility to the viruses. In the amphidiploid plant tobacco (Nicotiana tabacum L.), eIF4E1-S deletion mutants resist Potato virus Y (PVY), but resistance-breaking strains (RB-PVY) have appeared. In an earlier study, we demonstrated that the loss-of-function of eIF(iso)4E-T reduces susceptibility to RB-PVY. Here, we show that simultaneous inhibition of eIF4E1-S and eIF(iso)4E-T synergistically confers enhanced resistance to both PVY and RB-PVY without host growth or development defects. PVY symptoms and accumulation in a tobacco line lacking eIF4E1-S were detected at 14 days post-inoculation (dpi) and RB-PVY symptoms in lines without functional eIF(iso)4E-T were observed at 24 dpi. RB-PVY emerged in a PVY-infected tobacco line lacking eIF4E1-S. In contrast, lines without functional eIF4E1-S and eIF(iso)4E-T were nearly immune to PVY and RB-PVY, and little accumulation of either virus was detected even at 56 dpi. Thus, the lines will be promising for PVY-resistance breeding. This study provides a novel strategy to develop tobacco highly resistant to PVY and RB-PVY, and insights into the mechanisms responsible for high-level resistance.