中国栗AC/GT微卫星的提取和多态性及对安徽省板栗品种的分析

运用富集技术构建富集中国栗微卫星的基因组文库,从富集(AC)。微卫星的基因组文库中筛选出的10个微卫星中设计出5对引物。使用安徽省的14个板栗品种分析5个SSR位点的多态性,从5个微卫星位点得到29个等位基因,每个位点的等位基因数量在4～7个之间,微卫星位点的平均PIC为0．63。利用微卫星数据进行聚类分析,14个品种分为2个类群,聚类结果与品种来源基本一致。(AC)a微卫星的高多态性表明其在板栗遗传图构建和品种指纹分析方面具有优越性。     

福建黄兔的遗传多态性及分类

用8个微卫星标记对福建黄兔的等位基因频率、多态信息含量、杂合度和有效等位基因数等指标进行统计分析,并在此基础上对其进行聚类分析和分类研究。结果表明：（1）8个微卫星标记在所检测的福建黄兔群体中都表现出较丰富的多态性,在6个群体微卫星标记的平均多态信息含量（PIC）为0.6622(0.5723~0.7222),各群体的PIC差异不显著;全部群体平均杂合度为0.6857(0.5904~0.7267)。这显示黄兔群体的多态信息含量、杂合度等指标有较好的一致性,说明福建黄兔品种内在微卫星位点上均具有丰富的遗传多样性。（2）根据奈氏标准遗传距离,并进行UPGMA聚类分析,结果显示6个群体间的遗传变异不大。福建黄兔地方品种在微卫星位点上具有丰富的遗传多样性;从遗传距离及聚类分析结果表明这些群体黄兔属于同一个地方品种。     

甜叶菊微卫星富集文库的构建与多态性标记的筛选

甜叶菊是我国一种重要特种经济作物, 其分子标记相关遗传背景研究甚少。本研究基于生物素与链霉亲和素的强亲和性原理, 用链霉亲和素顺磁颗粒捕捉人工合成的标记有生物素的寡核苷酸探针(AG)₁₅, 间接筛选出含有甜叶菊基因组微卫星序列的DNA酶切片段, 将筛选得到的片段连接到pUC-T载体中, 构建甜叶菊微卫星序列的富集文库。挑取354个克隆进行菌落PCR检验, 从中筛选出158个阳性克隆进行测序。结果表明, 134个(84.81%)克隆中含有微卫星序列, 其中完美型85个(63.43%)、非完美型15个(11.19%)、复合型34个(25.38%)。根据微卫星序列共设计出71对微卫星引物, 其中62对能扩增出稳定的条带。利用24个甜叶菊品系对这62对引物的遗传多样性的分析表明, 有16个位点表现出多态性, 等位基因数为2~8个, 平均每个位点扩增得到4.5个等位基因, 多态性信息含量在0.3163~0.7595之间, 观测杂合度(H_o)与期望杂合度(H_e)的范围分别为0.2174~0.9167与0.3555~0.8076。通过聚类分析, 将甜叶菊分为大小叶两大类。本研究开发出的微卫星标记可为甜叶菊的分子遗传育种提供有效的遗传标记。     

观赏樱属植物基因组SSR分子标记开发及鉴定

为了开发樱属植物的基因组SSR(简单重复序列)分子标记,本研究在IlluminaNovaSeq PE平台上进行喜马拉雅樱花(Cerasus cerasoides)基因组序列勘测。利用Perl脚本MISA识别微卫星序列,并随机合成100对引物进行引物多态性筛选。选择易扩增、多态性高的引物,采用荧光标记毛细管电泳法在45种樱属植物中进行检测和遗传多样性分析。结果表明,喜马拉雅樱花基因组共存在113 571个SSR位点(≥5个重复),其中包含53.31%单核苷酸基序,36.64%二核苷酸基序,其余基序类型占比10%。在此基础上共筛选出21个SSR标记,并将其用于观赏樱属植物的遗传多态性评估,结果共检测到215个等位基因,平均每个位点10.24个等位基因,平均杂合度为0.38。采用SSR标记构建的进化树较好地反映了45种供试樱属植物之间的亲缘关系。本研究开发了全新的樱花基因组SSR分子标记,可用于樱属植物的遗传多样性分析和分子标记辅助育种。     

扁吻鱼微卫星分子标记的筛选及特征分析

通过磁珠富集法筛选扁吻鱼的微卫星分子标记。利用限制性内切酶Sau3AI对扁吻鱼的基因组DNA进行酶切,并选取片段大小在250～750 bp间的片段,利用PCR技术进行全基因组扩增,采用生物素标记的(CA)8探针对微卫星片段进行富集。富集后的片段与T载体连接后利用DH5α大肠杆菌进行转化,然后以Sau3AI为引物对菌落进行PCR扩增,扩增后选片段大小符合条件的菌落挑取至测序板,进行测序。结果表明:PCR筛选共获得563个阳性克隆,其中测序192个阳性克隆后发现有53个微卫星序列;序列分析表明,完美型占67.92%,非完美型为22.64%;混合性标记占9.43%。根据测序结果设计微卫星引物24对,经PCR扩增筛选,琼脂糖凝胶电泳结果显示,其中22对引物可扩增出清晰的条带,其中具有多态性的13对。利用13对多态性引物对扁吻鱼野生群体进行扩增,PCR扩增结果显示,等位基因数为3～6,多态信息含量(PIC)为0.625 3,12个位点处于高度多态水平(PIC>0.5)。     

乐清湾养殖缢蛏群体遗传结构的微卫星标记分析

为筛选出多态性EST-SSR位点,来评价乐清湾缢蛏养殖群体遗传的样性变化。采用40对EST-SSR引物对浙江省乐清湾缢蛏养殖群体进行全基因扫描,结果显示,有29对引物能获得稳定的特异性条带（占总数的72.5%）,其中14个微卫星位点具有多态性（占总数35%)。14个位点共检测到等位基因数（Na）61个,每个位点的等位基因数变化从2~12个。各引物观测杂合度（HO）、期望杂合度（HE）和多态信息含量(PIC)变化范围分别为0.025~0.868、0.258~0.850、0.242~0.834;位点YC-1、YC-11、YC-1２、YC-16、YC-27、YC-35（p<0.05）显著偏离哈代-温伯格平衡。说明缢蛏EST序列中有较丰富的SSR位点;乐清湾缢蛏养殖群体遗传多样性较丰富,但有所下降,需加强资源保护。     

黄花柳基因组微卫星分离及多态性位点检测

以生物素标记的(CT)15和(GT)15为探针进行杂交,借助磁珠筛选出含微卫星的Sau3A I酶切片段,构建了黄花柳微卫星富集文库,获得960个阳性克隆.随机挑选360个阳性克隆进行测序,发现含有微卫星的克隆比例达45%,最后获得的44条非同源性克隆中共含有53个微卫星位点,其中(TC/AG)n,(GA/CT)n,(CA/GT)n比例最高,占74%.随机选取其中的18个微卫星位点设计引物,用5个种个体混合DNA组成模板池,检测引物种间的多态性信息,初步筛选出5对引物在柳属种间有很好的通用性.说明微卫星富集法开发SSR标记不失为一种有效的方法.     

筛选普氏原羚粪便DNA中微卫星引物 并应用于个体识别

为了更好地保护极度濒危的普氏原羚物种,选择非损伤性样品-粪便作为研究材料,选用10对非洲糜羚微卫星引物和10对绵羊微卫星引物作为筛选普氏原羚基因组DNA微卫星位点的引物。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测微卫星PCR的扩增产物,结果发现20对引物中有8对引物在普氏原羚基因组DNA中扩增出了多态性位点。通过等位基因数目和等位基因频率对这8个位点的基因杂合度、多态性信息含量、有效等位基因数进行了计算,结果发现这8个位点在39个普氏原羚粪便样品中的基因杂合度介于0.71~0.84,平均杂合度为0.78;多态性信息含量介于0.79~0.66,平均多态信息含量为0.73;有效等位基因数介于3.40~6.08,平均有效等位基因为5.98,这表明所筛选到的8个微卫星基因座在研究普氏原羚粪便样品中均为中高度多态性基因座,具有比较明显的遗传变异,完全适合普氏原羚各种分子遗传分析。因此试验应用这8对多态性引物对39个粪便样品的个体进行识别,发现这39个粪便样品来自35个不同的个体。     

并应用于个体识别

 为了更好地保护极度濒危的普氏原羚物种,选择非损伤性样品-粪便作为研究材料,选用10对非洲糜羚微卫星引物和10对绵羊微卫星引物作为筛选普氏原羚基因组DNA微卫星位点的引物。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测微卫星PCR的扩增产物,结果发现20对引物中有8对引物在普氏原羚基因组DNA中扩增出了多态性位点。通过等位基因数目和等位基因频率对这8个位点的基因杂合度、多态性信息含量、有效等位基因数进行了计算,结果发现这8个位点在39个普氏原羚粪便样品中的基因杂合度介于0.71~0.84,平均杂合度为0.78;多态性信息含量介于0.79~0.66,平均多态信息含量为0.73;有效等位基因数介于3.40~6.08,平均有效等位基因为5.98,这表明所筛选到的8个微卫星基因座在研究普氏原羚粪便样品中均为中高度多态性基因座,具有比较明显的遗传变异,完全适合普氏原羚各种分子遗传分析。因此试验应用这8对多态性引物对39个粪便样品的个体进行识别,发现这39个粪便样品来自35个不同的个体。     

用磁珠富集法分离亚麻基因组微卫星分子标记

应用Dynal磁珠-生物素标记的微卫星探针(CT)₁₅与亚麻基因组DNA酶切片段杂交,捕获300~1 500 bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pMD18-T载体中,构建富集微卫星序列的小片段插入文库。利用接头引物和根据微卫星核心序列设计的引物VRV(CT)₁₅使用PCR方法直接对文库筛选,从422个转化子中获得了104个阳性克隆,对其进行测序分析,获得了97个微卫星序列,微卫星序列的富集效率达到22.99%,PCR扩增筛选效率93.27%。对97个微卫星序列进行比对分析,其中51个重复序列的两端序列高度相似,据其设计的特异引物对阳性克隆进行2次筛选,能淘汰相似度高的同类序列,提高筛选亚麻微卫星标记的效率。     

基于ISSR和AFLP标记开发甜菜 SSR 引物的研究

本研究以ISSR-PCR和AFLP标记原理为基础,介绍一种新的分离甜菜基因组微卫星引物的方法。首先对甜菜基因组DNA进行酶切并连接已知序列的接头,构建基因组DNA酶切文库,同时用一个或两个ISSR引物,扩增文库中两端含微卫星序列片段并进行克隆测序,根据测序结果设计微卫星序列间的IP1引物和IP1与微卫星序列间IP2 引物;再根据侧翼序列克隆原理,采用巢式PCR进行基因组步移,扩增IP2引物下游序列,根据巢式PCR产物测序结果,设计微卫星序列另一侧的引物IP3 ,IP2和IP3即为SSR标记引物,对获得的SSR引物进行PCR验证,结果表明SSR引物产率为16%,本研究获得的SSR引物具有较高的多态性,对于后续的遗传多样性检测和遗传连锁图构建具有重要意义。     

用于区别不同棉花品种基因组特征的微卫星位点筛选

保守性强、重复性好、多态性高的微卫星位点可被有效用于构建作物DNA条形码。选取目前生产上主要推广种植、代表不同来源系统的12个棉花品种作为微卫星位点筛选材料,参考我室构建的四倍体栽培棉种种间高密度遗传图谱信息,从376对覆盖全基因组的SSR引物中,筛选出51对引物可扩增出带型清晰且多态性高的微卫星位点。这些引物在12个供试品种中共产生155个等位位点,每对引物揭示的等位基因位点在2~7之间,平均值为3.04。参照微卫星位点的染色体定位和多态信息,在每条染色体上选择一个多态性相对高的SSR位点,其相应的26对SSR引物被推荐为构建棉花品种DNA条形码的一套首选引物,并初步应用于12个品种的DNA条形码编制。其余25对引物作为候选引物。使用该套引物扩增出的微卫星位点可用于大量棉花品种DNA条形码构建,为棉花品种真实性和纯度的分子鉴定奠定基础。     

苎麻基因组微卫星的分离与鉴定

以苎麻[Boehmeria nivea (L.) Gaud.]栽培品种芦竹青为材料,经MseⅠ酶切并与相应接头连接,然后与生物素标记的探针(CT)15杂交,再用链亲和素包被磁珠(Dynabeads M-280)捕捉杂交产物,以21碱基接头寡核苷酸为引物经PCR扩增获得了双链目的片段,回收300~1 000 bp DNA片段,然后克隆到pMD18-T载体上,转化至DH5α中,这样就构建了苎麻富含(GA)n微卫星的部分基因组文库。随机挑取36个克隆,以锚定简单重复序列为引物对其进行PCR筛选。测序分析了22个阳性克隆,每个克隆都含有微卫星DNA,阳性克隆率为61.1%,微卫星种类以与探针互补的（GA/CT）_n为主,占83.3%,同时还存在（TG/AC）_n和三碱基、六碱基为单元构成的苎麻微卫星,如(GAC)_n、(ACG)_n、(TCT)_n、(TCG)_n、(GAA)_n、(CCGACG) _n、(GAGAAA)_n等。最后以18个微卫星位点设计了18对苎麻微卫星特异引物。GA/CT重复单元的长度从7到40范围内变化,平均为19.2,显示了它们将产生良好多态性,为一种强有力的遗传标记。苎麻微卫星DNA标记可广泛应用于苎麻基因型鉴定,基因和QTL分析,分子标记辅助育种,系谱分析等。     

不同遗传背景下陆地棉衣分和子指性状QTL定位

为陆地棉产量性状有关的分子标记辅助育种奠定理论基础,以高品质中长绒棉品种‘新陆早24号’为父本,转基因抗虫棉常规品种‘鲁棉研28号’和高产、优质棉花新品种‘冀棉516’为母本,构建F2和F2:3分离群体;利用7638对SSR引物对‘鲁棉研28号’和‘新陆早24号’进行多态性进行筛选,共获得225对多态性引物,对238个F2单株DNA扩增获得238个多态性标记位点,其中185个构建了包括44个连锁群,总长为1509.38 cM的遗传连锁图谱,标记间的平均距离为8.16 cM,覆盖棉花总基因组的33.91%。根据已有图谱的定位结果,40个连锁群与染色体建立联系。利用复合区间作图法定位‘鲁棉研28号’与‘新陆早24号’分离群体F2单株和F2:3家系的衣分和子指性状QTL,其中得到3个衣分和5个子指的QTL;根据定位结果,选择了14对SSR引物,分析‘冀棉516’与‘新陆早24号’的多态性,其中6个标记构建了两个连锁群。1个衣分和1个子指的QTL在两个群体中均检测到,这些共同QTLs为分子标记辅助育种奠定了基础。     

利用微卫星标记鉴定扁蓿豆种质资源

对扁蓿豆种质资源进行遗传多样性和亲缘关系分析,为育种者选择亲本和种质资源的开发提供理论依据。采用微卫星分子标记对来自内蒙古野生扁蓿豆种质资源50份材料进行鉴定。用8份扁蓿豆基因组DNA从89对截形苜蓿SSR引物中鉴定筛选出扩增带单一、稳定清晰且多态性强的18对引物。用这18对引物,对扁蓿豆材料的DNA进行SSR扩增,以研究其遗传多态性。结果共检测到109个等位位点,平均每对引物扩增出6.1个等位位点。6对SSR引物BI4BO3,MTIC272,MAL369471,MTIC237,MTIC188和MTIC27对于检测扁蓿豆遗传变异最有效。供试材料间遗传距离介于0.023 6~0.807 5,平均遗传距离为0.177 8。聚类分析构建了亲缘关系树状图,大致分为9大类。     

一粒系小麦的微卫星分析

利用普通小麦A基因组含有微卫星位点的引物对在3种一粒系小麦的部分同源微卫星位点进行了检测。结果发现,59％的小麦A基因组微卫星位点的引物对可在3种一粒系小麦的多个种质中检测到部分同源微卫星位点,表明A基因组含有的微卫星位点在普通小麦和一粒系小麦间并不完全保守。一粒系小麦的微卫星位点之间在扩增条带数目以及扩增条带长度上均存在广泛差异。同一微卫星位点在不同一粒系小麦种质中的扩增条带数目以及扩增条带长度上也表现明显差异。     

梨ISSR-PCR反应体系的优化及在SRAP、SSR标记中的通用性研究

为获得最佳的梨ISSR-PCR反应体系,以及验证在其他标记上具有通用型,以‘新世纪梨’ב崇化大梨’杂交F1代为试验材料,采用L₂₅(5⁶)试验正交设计法及单因素方法,对反应体系中的模板DNA量、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶这4个单因素进行优化。结果表明,梨ISSR-PCR最优的20μL体积的反应体系中,含模板DNA 3 ng/μL,dNTPs 0.20 mmol/L,引物0.5μmol/L,TaqDNA聚合酶0.03 U/μL。采用优化后的反应体系对试验材料进行了SRAP、SSR标记方法的扩增,结果显示该反应体系也适用于梨属的SRAP、SSR分析。为梨属在以后的多标记的遗传多样性分析、种质资源评价和遗传图谱的构建等提供理论基础,并在试验中减少费用和提高效率。     

新疆彩色棉23个品种指纹图谱的构建及遗传多样性分析

以新疆截止2012年审定的23份新彩棉品种为材料,利用SSR标记进行DNA指纹图谱的构建和遗传多样性分析。从5000对SSR引物中,挑选出多态性高、稳定性好、均匀分布在棉花26条染色体上的52对引物,在23份新彩棉品种中筛选出核心引物47对,SSR扩增检测到多态性基因型位点数共计162个,每个标记检测到的基因型位点数在2~7之间,平均为3.45个;引物多态信息量(PIC)值介于0.4537~0.8686之间,平均值为0.7096。结果显示:在23份新彩棉品种中,14份品种采用特异或特征引物可以一次性区分开,其余9份品种需要采用引物组合来实现区别该品种与其他品种。最少选用18对特异引物及组合引物就可以完全区分开新彩棉1~23号品种。利用18对SSR标记构建了新彩棉1号至23号品种的指纹图谱。利用NTSYS-pcV2.10软件聚类分析表明:23个新彩棉品种遗传相似系数变化范围是0.3781~0.9298,平均为0.5511,表明新彩棉品种之间存在着丰富的遗传多样性。     

New SSR markers of Phaseolus vulgaris from sequence databases

To enlarge the number of microsatellite loci of Phaseolus vulgaris (L.) (common bean), a set of primer pairs has been obtained from public databases, to amplify DNA regions including simple sequence repeats (SSR), and they have been assayed in several P. vulgaris genotypes. Publically available DNA sequence data of P. vulgaris were searched for SSR motifs. Twenty sequences containing microsatellites were identified and primer pairs were designed to amplify those microsatellites. Primers were evaluated for their ability to detect polymorphisms within a set of P. vulgaris accessions, local landraces and hybrids and in addition, two accessions of the closely related species P. coccineus. Eighteen polymorphic SSR loci were identified. Polymorphisms were found at both levels of accessions and Phaseolus species.     

牙鲆亲本间遗传距离与其后代生长速度的相关性分析

分子标记技术为直接从DNA水平上认识生物个体遗传差异提供了强有力的工具,用其分析亲本间遗传距离与后代生长性状之间的关系是水产育种研究的重要方向之一。选用21个多态性微卫星分子标记,以8个日本牙鲆（JS）个体和24个抗病牙鲆（RS）个体为亲本产生的28个杂交组合为材料,分析了该32个牙鲆亲本的遗传多样性,同时对牙鲆亲本间遗传距离与其后代生长速度的相关性进行了研究。结果表明：（1）21个微卫星标记共扩增出123个等位基因,32个牙鲆亲本中的等位基因数(A),有效等位基因数(Ae),观测杂合度(Ho),期望杂合度(He),多态信息含量（PIC）分别在2~15,1.3423~7.8168,0.2333~1.000,0.2593~0.8859,0.2225~0.8613之间变动,相应的平均值分别为5.86,3.7951,0.6931,0.6784,0.6237。（2）进行亲本间遗传距离（GD）与其后代生长速度（AGRw）的相关性分析发现,亲本间最小遗传距离为0.2578,最大遗传距离为0.9773,不同遗传距离范围内,亲本间遗传距离与后代生长速度之间呈现不同的相关性：在0.2578~0.5958范围内,亲本间遗传距离与后代生长速度呈显著的正相关（P<0.05）;在0.6099~0.6604范围内,亲本间遗传距离与后代生长速度之间没有表现出显著的相关性;在0.6640~0.9773范围内,亲本间遗传距离与后代生长速度呈显著的负相关（P<0.05）。