绿盲蝽膜结合型海藻糖酶ALTre-2基因表达、纯化及酶学特性

以绿盲蝽为材料,在前期获得绿盲蝽膜结合型海藻糖酶(ALTre-2)基因的基础上,构建了ALTre-2原核表达载体(pET28a-ALTre-2),经IPTG诱导表达、变性、复性和蛋白纯化后,获得具海藻糖酶活力的重组蛋白,最后在以海藻糖为底物及重组蛋白浓度为1.1 mg·mL-1的条件下,对纯化得到的重组ALTre-2蛋白进行活性检测,确定了其酶促反应的最佳pH和最适温度.试验结果表明:ALTre-2基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够高效表达一个约60 kD大小的蛋白,SDS-PAGE显示该蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性及蛋白纯化获得了具海藻糖酶活力的重组蛋白;该重组ALTre-2蛋白在pH为7.0时活性最高,同时重组ALTre-2蛋白酶活性最适温度是50℃.研究结果为深入探讨绿盲蝽膜结合型海藻糖酶分子调控机制奠定基础.     

木薯MeCREB基因的分子克隆及其在原核细胞中的表达和优化

本研究以木薯为材料,通过RT-PCR克隆出了MeCREB基因,核酸序列分析表明,所克隆的基因与phytozome数据库收录的MeCREB基因(Manes.04G058300.1)序列基本一致。MeCREB基因全长968 bp,其中开放性阅读框(ORF)为747 bp,编码248个氨基酸,预测得出MeCREB蛋白是一个不稳定的亲水性蛋白,编码蛋白质的分子量为26.26 kD,理论等电点为5.99,GRAVY为-0.667。构建MeCREB-pGEX-6p-1表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,并对影响重组蛋白表达的4个主要因素(诱导温度,诱导起始菌量,IPTG浓度及诱导时间)进行优化,确定GST-MeCREB融合蛋白的最适表达条件。结果表明:重组工程菌生长至OD600=0.8时加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG,在28℃下诱导6 h,最适合GST-MeCREB融合蛋白的表达。本研究为高效诱导获得GST-MeCREB融合蛋白用于下游实验提供了最优方案,并为进一步研究MeCREB基因的生物学功能奠定了基础。     

木薯中肌醇半乳糖苷合成酶基因在大肠杆菌中的表达

本研究利用从木薯中克隆到的肌醇半乳糖苷合成酶基因构建到高效表达载体pGEX-6p-1上,构建重组载体MeGolS5-p GEX,并对GST-MeGolS5融合表达的IPTG诱导浓度、诱导不同温度、不同菌液浓度和诱导时间等条件进行优化。研究结果表明:随诱导时间增长GST-MeGolS5融合蛋白表达量提高,在37℃时,OD600为0.4左右,诱导4 h MeGolS5-GST融合蛋白的表达量达到最大,在0.2 mmol/L IPTG浓度下,可以有效诱导MeGolS5-GST融合蛋白的表达;MeGolS5重组菌株可以耐受5%的PEG6000模拟的干旱胁迫。本研究结果可为解析MeGolS5基因的功能以及在木薯抗旱过程中的作用机理提供参考。     

小麦TaNADP-ME1基因在大肠杆菌中的融合表达及可溶蛋白纯化

NADP依赖的苹果酸酶(NADP-ME)是C4光合途径关键酶。为了确定TaNADP-ME1基因的功能,利用重组技术将前期克隆到的TaNADP-ME1基因构建到原核表达载体pET32a,双酶切和PCR鉴定阳性克隆,CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白。成功获得了重组原核表达载体pETE1,TaNADP-ME1基因在BL21(DE3)pLysS中得到了融合表达,SDS-PAGE表明,融合蛋白分子量为80 kDa,并成功纯化到融合蛋白。     

肥城桃果实乙烯受体ETR1蛋白重组条件优化及NO对ETR1基因表达的影响

克隆与肥城桃成熟有关的乙烯受体ETR1基因片段,优化ETR1的表达条件,获得ETR1重组蛋白,为进一步研究ETR1功能并改善肥城桃贮运性能奠定基础。以肥城桃成熟果实总RNA反转录cDNA为模板,经PCR扩增得到特异片段,将该片段连接到质粒,经双酶切后,连接至质粒并转染至表达载体,IPTG诱导,优化表达条件。并以cD-NA为模板,进行实时荧光定量PCR,测定外源NO对ETR1相对表达量的影响。序列分析结果表明,该序列与Gen-Bank中的AF124527的cDNA序列同源性为99%,氨基酸序列同源性为99%。优化蛋白表达条件为:IPTG最佳浓度为0.5 mmol/L,最适温度为30℃,最适诱导时间为8 h。经优化后,ETR1重组蛋白成功表达,为TETR1的重组生产和对ETR1功能的体外研究提供了条件。此外,外源NO对体外表达的ETR1基因有抑制作用。     

橡胶树中碱性转化酶HbNIN9表达及酶学特性分析

转化酶作为蔗糖分解代谢的关键酶,在植物生长发育、生物与非生物胁迫响应等生理过程中发挥重要作用。基于对橡胶树不同组织转录组数据库的分析,本研究克隆了一个在橡胶树种子中有较高丰度表达的中碱性转化酶基因HbNIN9;系统进化分析和在线软件预测均显示其亚细胞定位为线粒体,属于中碱性转化酶α亚族成员;利用原核表达体系成功获得Hb NIN9优化表达的重组蛋白,优化表达的诱导条件为0.5 mmol/L IPTG,25℃培养6 h;酶学特性分析表明,HbNIN9蛋白酶活反应的最适温度为45℃,最适pH值为7.5,米氏常数Km值为18.09 mmol/L。本研究从蛋白水平证实了Hb NIN9为典型的中碱性转化酶,有助于深入揭示线粒体型转化酶在橡胶树种子糖代谢中生理功能,丰富橡胶树中碱性转化酶家族成员的生理生化研究。     

SikCDPK1基因EF-hand的定点突变、原核表达及蛋白纯化

钙依赖性蛋白激酶(calcium dependent protein kinase, CDPK)通过与Ca²⁺相互作用,在植物响应各种逆境胁迫的过程中发挥重要作用,其C端调控区的EF-hand基序是使CDPK的激活依赖于Ca²⁺的关键结构。为进一步研究具有极强耐寒性的天山雪莲对逆境的响应机制,本研究采用PCR定点突变技术,将SikCDPK1基因EF-hand基序的第435、第471、第507和第540位氨基酸分别由E(谷氨酸)突变为Q(谷氨酰胺),构建定点突变原核表达载体,转化表达菌株E. coli BL21 (DE3),使用IPTG诱导蛋白表达,利用亲和层析系统对重组蛋白进行纯化。结果显示,重组菌株能够成功表达出目的重组蛋白,重组蛋白可溶性表达量较高的诱导培养条件是18℃1 mmol/L IPTG诱导16 h,最后成功纯化出符合预期大小的可溶性蛋白,为进一步探究SikCDPK1中不同EF-hand基序的生物学功能提供了实验依据。     

血清4型禽腺病毒六邻体蛋白的原核表达及鉴定

通过原核表达的方法得到血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白;根据GenBank中血清4型禽腺病毒六邻体蛋白的基因序列,设计一对特异性引物,利用普通PCR方法扩增得到hexon基因的全长序列。将PCR扩增得到的血清4型禽腺病毒六邻体基因片段,在其两端插入酶切位点后克隆至载体pMD18T中,经PCR鉴定和测序分析正确后,与原核表达载体pET-32 a进行连接,构建pET-32 a-hexon原核表达载体,并对其进行双酶切和测序鉴定。将构建成功的表达载体转化至BL21(DE3)中,用1 mmol/L的IPTG进行诱导表达,对得到的重组蛋白进行SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定;经双酶切鉴定和测序鉴定,pET-32a-hexon原核表达载体构建成功,插入的六邻体蛋白基因片段大小为2 814 bp,在1 mmol/L浓度IPTG诱导3 h时重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白分子量为118 ku。免疫印迹分析结果显示,融合蛋白可被抗FAdV-4的血清和HIS标签抗体特异性识别;成功表达了血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白,且得到的重组蛋白具有良好的反应原性,可用于血清4型禽腺病毒的进一步研究中,为血清4型禽腺病毒病的预防和治疗奠定了良好的基础。     

鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶的原核表达

为了原核表达鸭疫里默氏菌噬菌体RAP44的裂解酶基因,以噬菌体RAP44的基因组为模板,用PCR方法扩增裂解酶基因,与表达载体p GEX-6P-1连接,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱纯化表达蛋白。结果成功构建了表达载体p GEX-N,转化菌经IPTG诱导后成功表达出了分子量约为37 k D的可溶性重组蛋白。本研究获得了纯化的鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶重组蛋白,为裂解酶的功能研究奠定了基础。     

藏猪IGF-1成熟肽基因的克隆及原核表达

旨在克隆藏猪胰岛素样生长因子1(IGF-1)的成熟肽基因,并进行原核表达的研究。提取藏猪肝脏组织RNA,通过RT-PCR扩增出藏猪IGF-1全长基因,构建重组质粒p MD19-T-IGF-1,以p MD19-T-IGF-1质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽序列并构建成熟肽p ET-32α-IGF-1表达质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),对IPTG诱导剂浓度和诱导时间进行优化,Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白后采用Western Blot对其鉴定。结果显示,IGF-1成熟肽基因(315 bp),成功构建了成熟肽p ET-32α-IGF-1原核表达质粒;重组大肠杆菌BL21-IGF-1以包涵体形式表达出分子量约31 k Da融合蛋白,最优IPTG浓度为0.5 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为10 h;纯化获得了高纯度的融合蛋白,经鉴定IPTG诱导表达和纯化的蛋白为IGF-1融合蛋白。结果表明,成功构建了表达质粒p ET32α-IGF-1及获得重组大肠杆菌BL21-IGF-1,表达了藏猪IGF-1成熟肽融合蛋白及该蛋白具有抗原抗体反应活性。     

猪α1干扰素基因的克隆与原核表达

根据猪α1干扰素(pocine interferon-alpha1,poIFN-α1)的全基因序列(EU364896)设计合成1对特异引物,通过RT-PCR从三元杂交仔猪外周血淋巴细胞扩增出poIFN-α1全基因,将该基因克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T-poIFN-α1,进行测序。以pGEM-T-poIFN-α1为模板,经PCR扩增带有酶切位点的poIFN-α1基因,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达载体pGEX-6P-poIFNα1,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达和鉴定,并确定蛋白最佳表达条件。序列分析表明,克隆的poIFN-α1基因全长546bp,编码181个氨基酸,前23个氨基酸组成信号肽,无糖基化位点。SDS-PAGE和Western blotting证实重组表达菌经IPTG诱导后,可表达相对分子质量约46ku的融合蛋白(GST-poIFN-α1)。当以1.0mmol/L的IPTG于37℃下诱导表达9h时,蛋白表达量最高。poIFN-α1基因的克隆与表达为进一步研究其抗病毒活性,开发病毒治疗和疫苗免疫增强用生物制剂奠定了基础。     

灰葡萄孢BcKMO基因的原核表达分析

为构建灰葡萄孢犬尿氨酸单加氧酶(Bc KMO)基因的原核表达载体并进行高效表达,获得纯化的Bc KMO蛋白。以灰葡萄孢野生型BC22为试材,通过反转录PCR扩增Bc KMO基因,回收Bc KMO基因片段克隆到p MD19-T载体中,测序正确后,酶切p MD19-T-Bc KMO和带有GST标签蛋白的p GEX4T-1质粒,将目的片段进行连接,构建Bc KMO基因的原核表达载体p GEX4T-1-Bc KMO-GST。经酶切和测序鉴定正确后,将构建好的原核载体转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了与GST标签蛋白融合的Bc KMO蛋白,大小约71 k Da。SDS-PAGE分析表明,该蛋白在0.2 mmol/L IPTG诱导12 h时高效表达;Western Blot结果发现目的蛋白能与GST特异性抗体起特异性反应,表明Bc KMO基因的体外诱导表达成功。     

抗凋亡融合蛋白PTD-Bcl-xL原核表达载体的构建及表达纯化

人工抗凋亡蛋白PTD-Bcl-x L能保护多种因素引起的细胞异常凋亡,为了获得高纯度Bcl-x L与PTD(Protein transduction domains)的融合蛋白,首先采用TRIzol法提取SD大鼠肝脏总RNA,将RNA反转录为c DNA,设计引物以c DNA为模板,PCR扩增Bcl-x L基因,构建p UM19-T-Bcl-x L质粒,并对质粒双酶切鉴定和测序鉴定;其次设计包含PTD序列的Bcl-x L引物,以测序正确的p UM19-T-Bcl-x L质粒为模板,PCR扩增PTD-Bcl-x L序列,将扩增序列克隆入p ET28a载体,构建PTD-Bcl-x L蛋白的原核表达质粒p ET28a-PTD-Bcl-x L,并对p ET28a-PTD-Bcl-x L载体双酶切鉴定和测序鉴定;将p ET28a-PTD-Bcl-x L重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对IPTG诱导融合蛋白表达的浓度和诱导时间进行了优化;SDS-PAGE分析表达蛋白的可溶性情况,在变性条件下用Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白;最后用SDS-PAGE、Western Blot及质谱对融合蛋白进行鉴定。结果表明:双酶切p UM19-T-Bcl-x L质粒出现约774 bp大小条带,p UM19-T-Bcl-x L质粒测序结果与NCBI数据库比对序列一致,表明成功构建p UM19-T-Bcl-x L质粒;双酶切p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒出现约744 bp大小条带,p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒测序结果与预期序列一致,表明成功构建了p ET28a-PTD-Bcl-x L原核表达载体;在IPTG诱导下p ET28a-Bcl-x L重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出36 k Da大小蛋白,最优IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为6 h;SDS-PAGE电泳显示融合蛋白主要出现在菌液超声后的沉淀里,以包涵体形式表达,经Ni-NTA琼脂纯化获得了高纯度的融合蛋白;Western Blot和质谱鉴定证明IPTG诱导表达蛋白和纯化的融合蛋白为PTD-Bcl-x L蛋白。纯化得到了PTD-Bc L-x L融合蛋白,推进了PTD-Bcl-x L蛋白在猪、牛等家畜精液冷冻保存的应用进程。     

猪瘟病毒Shimen株p80基因的克隆及其真核表达质粒的构建

根据已发表的猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)Alfort株和Brescia株的全基因组序列,设计2对引物P1/P2和B1/B2,在B1和B2的5'端分别加上XhoI和ApaI位点,以CSFVShimen株细胞毒为材料一步法提取总RNA,并以此为模板采用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR),成功地扩增到约2.0kb的片段,将此PCR产物回收后与pMD18-T连接、转化,获得重组质粒,经PCR扩增,限制性酶切(BamhI/HindШ)和序列部分测定鉴定为阳性重组质粒P80-T。将P80-T分别经XhoI和ApaI酶切消化、回收后,与经XhoI/ApaI酶解的真核表达载体PEGPF-C1连接、转化,获得重组质粒,经PCR,XhoI和ApaI限制性酶切和序列测定鉴定为真核表达质粒P80-P,目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确。为下一步在哺乳动物细胞中表达猪瘟病毒p80蛋白奠定了基础。     

能源甜菜BvGST基因在大肠杆菌体内对镉逆境的应答特性分析

为了进一步研究BvGST基因(LOC104898671)在能源甜菜耐受重金属镉逆境胁迫过程中的功能,明确其在细胞解毒镉离子中的作用和应答特性,本研究以780016B/12优为植物材料,通过RT-PCR的方法将BvGST基因克隆并构建于大肠杆菌原核表达载体pEASY-Blunt E1上,并转化到大肠杆菌BL21中。SDS-PAGE电泳表明,通过1 mmol/L IPTG诱导,在重组菌BL21总蛋白的25.9 kDa左右的位置上,获得了大肠杆菌his tag-BvGST的融合蛋白。当施加0.5 mmol/L CdCl2逆境胁迫后,表达BvGST蛋白的重组菌表现出优于对照菌的生长状态;与此同时,大量表达BvGST的大肠杆菌体内的GST酶活性也要远高于对照。这说明,能源甜菜BvGST基因通过在E. coli体内大量表达高活性的谷胱甘肽转移酶,来解毒细胞内由镉胁迫带来的氧化伤害,从而提高大肠杆菌的Cd耐受性。研究结果暗示了能源甜菜BvGST在镉逆境胁迫分子机制中发挥着重要作用。     

棉花GhEPSPS基因的原核表达载体的构建及诱导表达

目的在于构建棉花GhEPSPS基因的原核表达载体,并在宿主大肠杆菌中成功诱导表达。利用RT-PCR技术从陆地棉苏棉18中克隆获得GhEPSPS基因的开放阅读框序列,连接到p EASY-Blunt平端载体,构建获得重组载体p EASY-Blunt-GhEPSPS;以该重组载体为模板,PCR获得两端含有Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点的GhEPSPS基因CDS序列,通过这2个酶切位点插入到p ET32a载体,构建获得原核表达重组载体p ET32a-GhEPSPS,转化到宿主菌株BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测目的基因的表达情况。研究结果表明,成功克隆获得了棉花GhEPSPS基因的CDS序列,并成功构建了该基因的原核表达载体,目的基因能够在宿主菌中被诱导大量表达。该研究结果将为深入研究棉花EPSPS酶的结构、功能以及酶学特性提供重要的研究基础。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a蛋白转肽酶区的原核表达及鉴定

本研究对编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）非青霉素结合蛋白2a（PBP2a）的转肽酶区（TPase）原核表达并进行Western blot鉴定。首先通过PCR方法由MRSA基因组中扩增转肽酶区基因片段,并构建pGEX-6p-1-TPase重组质粒,转化BL-21,诱导目的蛋白表达,然后进行Western blot鉴定。结果表明,成功构建出pGEX-6p-1-TPase原核表达载体,并成功表达出PBP2a的转肽酶区蛋白（TPase）,为其进一步的研究和应用奠定了基础。     

鸡贫血病毒VP1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据鸡贫血病毒Cux_1株基因组序列设计了一对引物,通过PCR扩增出VP1基因。将扩增出的片段克隆到pGM_T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux_1株的VP1基因序列一致。然后将克隆化VP1基因亚克隆到PET_32a( )载体上并进行原核表达。SDS_PAGE和Western Blot分析表明,一个分子质量为70.4 kDa的重组蛋白获得了成功表达,并且鸡贫血病毒阳性血清能和重组蛋白发生反应。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的克隆与表达

猪圆环病毒II型(PCV2)是引起断奶后仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原。本研究用PCR方法扩增PCV2截短的ORF2基因并亚克隆至表达载体pGEX-6P-1,构建的重组表达质粒命名为pGEX-ORF2,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),在37℃经IPTG诱导4小时。PCV2的cap蛋白以包涵体形式得到有效表达。经SDS-PAGE及Western blot分析表明表达的重组蛋白分子量约为46KD,重组蛋白具有良好的免疫学活性。