谷氨酰胺合成酶产酶菌株的筛选及酶学性质

通过对枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉3种菌株的筛选,得到3种菌株具有产谷氨酰胺合成酶(GS)的能力,其中米曲霉产酶能力较高,对米曲霉菌株进行紫外线诱变使其产酶能力提高了15.6%。确定了米曲霉最佳超声波破碎条件为:功率400W,工作1s,间歇3s,超声20min。谷氨酰胺合成酶的最佳酶促反应时间为30min,最适pH值为6.5,最适温度为60℃,并且得出了Mg2+和Mn2+对维持酶活至关重要。     

海马齿甜菜碱醛脱氢酶基因克隆、高效表达及酶学特性分析

在许多渗透调节剂中,甜菜碱是最理想的有机小分子渗透调节物质。甜菜碱在植物体内大量积累不会带来危害,同时能提高植物对环境胁迫的抗性。将海马齿中克隆到的甜菜碱醛脱氢酶基因构建到表达载体pET-28a(+)上,获得重组载体pET-SpBADH并将其成功地转化到BL21(DE3)中得到重组工程菌,经IPTG诱导能高效表达55 kD目的蛋白,表达量可以达到301 μg mL–1。酶学特征分析表明,该蛋白最适pH值为7.2,在偏碱条件下能维持较高的催化活性;SpBADH蛋白对高温敏感,且温度对催化活性影响较大,超过55℃时酶活性只有20%,最适酶催化活性温度为37℃;而有机小分子醇类对酶的催化活性有保护作用,可以通过自身特征维持酶催化活性的微环境。     

海南黄灯笼椒辣椒素合成酶基因克隆及表达研究

本研究根据csy1基因序列设计引物,从海南黄灯笼椒（C. chinense Jacq.）中克隆了类似基因片段csy-h,比对结果表明,csy1和csy-h基因与AT3基因同源性很低。Ben-Chaim等[8]证实6个不同主效QTL影响辣椒素类物含量,说明除csy1基因外,还可能存在其它基因如AT3基因影响辣椒素含量。 此外还发现辣椒果实发育中csy-h基因的表达量与CS活性大小呈相同的变化趋势,Narasimha Prasad等[2] 还发现辣椒素含量最高峰出现时间较CS活性出现时间较晚,说明CS活性可能是辣椒素含量增加的主要原因之一。此外,从来自于本研究黄灯笼椒csy-h基因片段和来自于C. chacoense、C. annuum、C. frutescens csy1基因片段同源性高达100%,而表达量不同的结果看,可能csy1基因存在转录水平的调控机制。     

蛋白酶产生菌的筛选及酶学性质研究

从养牛厂附近的土壤中分离得到一株产蛋白酶性质优良的菌株,初步鉴定为芽孢杆菌,对其最适产酶条件进行了研究。试验表明,最适碳源为玉米粉,最适氮源为玉米浆,300mL摇瓶最适装液量为60mL,最适接种量为2%,起始pH值为4.5和6.5时有2个产酶高峰,并对其进行酶学性质的研究。该酶最适温度为65℃,最适pH值为7.5,该酶在50℃以下保温30min酶活仍较高,在70℃以上酶活全部丧失。在pH值7.0～9.0时比较稳定,而在pH值5.0以下时酶活下降很快。金属离子Pb2+,鳌合剂EDTA能抑制蛋白酶的活性,而Fe2+能激活蛋白酶活性。     

低温淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究

从新疆高海拔地区采集土样中定向筛选得到1株低温淀粉酶产生菌株LA77,初步鉴定为解淀粉类芽孢杆菌(P.amylolyticus)。摇瓶发酵实验表明,该菌株最适产酶温度为35℃,最佳产酶pH值为6.0,生长高峰出现在第30h,产酶高峰出现在38h,低温淀粉酶的活力达到34.5U/mL,温度超过40℃时此酶极易失活。此菌株生长周期短,产生的淀粉酶在温度高于40℃极易失活,在化工和食品等行业有良好的应用前景。     

绿盲蝽膜结合型海藻糖酶ALTre-2基因表达、纯化及酶学特性

以绿盲蝽为材料,在前期获得绿盲蝽膜结合型海藻糖酶(ALTre-2)基因的基础上,构建了ALTre-2原核表达载体(pET28a-ALTre-2),经IPTG诱导表达、变性、复性和蛋白纯化后,获得具海藻糖酶活力的重组蛋白,最后在以海藻糖为底物及重组蛋白浓度为1.1 mg·mL-1的条件下,对纯化得到的重组ALTre-2蛋白进行活性检测,确定了其酶促反应的最佳pH和最适温度.试验结果表明:ALTre-2基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够高效表达一个约60 kD大小的蛋白,SDS-PAGE显示该蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性及蛋白纯化获得了具海藻糖酶活力的重组蛋白;该重组ALTre-2蛋白在pH为7.0时活性最高,同时重组ALTre-2蛋白酶活性最适温度是50℃.研究结果为深入探讨绿盲蝽膜结合型海藻糖酶分子调控机制奠定基础.     

硫酸盐还原菌酶学性质及应用的研究进展

文章总结了同化性硫酸盐还原和异化性硫酸盐还原2种不同的代谢途径,归纳了腺苷酰硫酸还原酶和亚硫酸盐还原酶2种关键酶的酶学性质。指出硫酸盐还原菌可利用自身的代谢特性降低农业领域的土壤重金属污染,促进农作物生长;利用其具有降解乳酸盐的功能,使白酒增己降乳;还可用于微生物燃料电池以及多环芳烃的降解等其他领域。同时硫酸盐还原菌也具有腐蚀金属的弊端,分析表明可以筛选出对硫酸盐还原菌的自我修复机制抑制程度强的金属离子或者对其进行基因工程改造,从而减少对金属腐蚀的危害。     

一株有机磷农药高效降解菌的筛选及酶学性质研究

为了从有机磷农药严重污染的土壤中分离筛选出一株有机磷农药高效降解菌,并对其进行鉴定及其酶学性质研究。通过有机磷农药驯化培养、形态学和生理生化特性及其16S rDNA序列分析等试验对其进行了初步鉴定,并初步研究了pH值、温度、底物及金属离子等外界因素对其粗酶液酶学性质的影响。分离筛选出一株有机磷农药高效降解菌J7-4,经形态学和生理生化特性及其16S rDNA序列分析等试验,初步将其鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri),其降解酶为胞内酶,该酶最适pH为9.0,最适反应温度为45℃;最适底物为甲基对硫磷,并且该酶具有广谱降解特性;Mg2+、Ca2+等金属离子对其有不同程度的激活作用,Co2+、Cr3+对该酶有轻微的抑制作用,而Mn2+、Fe3+、Zn2+、Al3+、Hg+、Cd2+、Ba2+、Ag+对该酶有强烈的抑制作用。成功地从有机磷农药严重污染的土壤中分离筛选出了一株有机磷农药高效降解菌J7-4,并对其降解酶的性质进行了初步研究。     

黑木耳漆酶酶学性质的研究

本实验从黑木耳液体发酵液中提取漆酶,对其酶学性质进行研究,为该漆酶的应用提供有价值的理论数据。对漆酶发酵液进行硫酸铵分级沉淀和透析,制得粗酶液。采用分光光度法,以ABTS[2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)]为底物测定漆酶活力。结果表明：黑木耳漆酶在55℃以下保温,漆酶活力和热稳定性良好。最适温度为45℃。温度超过65℃,出现明显的抑制作用。黑木耳漆酶最适pH为4.0,pH高于6.5,出现明显的抑制作用。金属离子对酶活表现出促进或抑制的作用。     

棘孢木霉几丁质酶基因的原核表达、复性、纯化以及酶学性质研究

为高效表达几丁质酶基因tachi1,研究Tachi1的酶学性质。采用PCR技术从棘孢木霉中克隆了几丁质酶基因tachi1并与pEHisTEV原核表达载体融合,转化大肠杆菌BL21。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得了以包涵体形式高效表达的Tachi1。包涵体经洗涤、溶解、复性和纯化后获得了高纯度的Tachi1。复性后的Tachi1具有较高的几丁质酶活性,该几丁质酶反应的最适温度为50℃,最适pH 5.5。几丁质酶在30~35℃下稳定,在pH 3~7之间几丁质酶有较高活性。     

薰衣草芳樟醇合酶基因的克隆、表达及酶活性检测

从高油薰衣草品种“杂花”中克隆得到芳樟醇合酶基因LIS1和LIS2,并对其进行了生物信息学和表达模式分析、原核表达和酶活性检测,以低油品种“法国蓝”为对照。结果表明,LIS1基因编码602个氨基酸,LIS2基因编码564个氨基酸。LIS1蛋白与阔叶薰衣草、一串红的芳樟醇合酶亲缘关系相近,LIS2蛋白与狭叶薰衣草、杂薰衣草的芳樟醇合酶亲缘关系相近。LIS1基因在“杂花”花器官半开期、盛开期和衰败期的表达量均高于“法国蓝”;LIS1基因在“杂花”花萼中的表达量最高,且仅在“法国蓝”雄蕊中少量表达。LIS2基因在“杂花”花器官不同组织和不同发育时期表达量均低于其在“法国蓝”中表达量,该基因在“杂花”花器官衰败期和“法国蓝”花器官半开期表达量最高,在2个品种花萼中高表达。LIS2基因在2个品种不同发育时期及组织中的表达量均明显高于LIS1基因。LIS1和LIS2重组蛋白具有单萜合酶活性,且均参与合成芳樟醇。     

羊踯躅psy基因的克隆及表达分析

[目的]为了研究羊踯躅psy基因的功能及其在花瓣着色中的分子机理,[方法]以羊踯躅花瓣的cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE方法克隆得到1 638 bp的psy基因全长cDNA序列,命名为RmPSY (GenKank登录号为KX230461)。[结果]序列分析表明,RmPSY开放阅读框为1 296bp,编码432个氨基酸。羊踯躅PSY为亲水性的不稳定蛋白,无信号肽,属于非分泌蛋白;预测的蛋白质分子量48.91 kD,等电点为8.78。RmPSY与GenBank中收录的其它植物PSY蛋白氨基酸的相似性达到81%。构建系统进化树,结果显示羊踯躅PSY与葡萄PSY蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在羊踯躅花发育的不同阶段均有表达,在花蕾期表达量较低,在初开期表达量最高,盛开期表达量有所下降。[结论]试验结果为进一步揭示RmPSY基因参与调控羊踯躅花色形成的分子机制奠定基础。     

罗马洋甘菊HMGR基因的克隆与表达分析

3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGR)是植物萜类化合物甲羟戊酸合成途径中的关键限速酶。为研究HMGR基因在洋甘菊萜类化合物合成代谢中的功能,根据前期罗马洋甘菊转录组注释HMGR的Unigene序列设计引物,以罗马洋甘菊c DNA为模板,采用RT-PCR方法,从罗马洋甘菊中克隆得到一个长为1 856 bp的HMGR基因,命名为CnHMGR(Gen Bank登录号为KU589282)。CnHMGR基因序列包含1个1 746 bp长的开放阅读框,编码582个氨基酸,生物信息学软件预测蛋白质分子量和等电点分别为62.5 k Da和6.80。氨基酸序列多重比对结果显示,CnHMGR蛋白质与其他植物的HMGR蛋白具有高度相似性,并包含HMGR蛋白质家族中的2个HMG-CoA结合基序:TTEGCLUA、EMPVGYVQIP以及2个NADP(H)结合基序:TVGGGT、DAMGMNM,表明CnHMGR属千罗马洋甘菊HMGR家族成员。组织表达分析显示CnHMGR在罗马洋甘菊的不同组织均有表达,在花中表达量最高,在茎中表达量最低。通过对CnHMGR基因的克隆及表达特性分析,为后续深入研究其在洋甘菊倍半萜合成途径中的功能奠定了理论基础。     

水稻去泛素化酶OsUCH-L5基因的克隆及表达分析

通过生物信息学及RT-qPCR(quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)的方法对水稻OsUCH-L5基因进行探究.生物信息学预测结果表明,该基因全长837 bp,编码278个氨基酸;OsUCH-L 5蛋白的相对分子质量为31.64 kDa,等电点为5.66,为亲水性蛋白,具备Peptida...     

甘蔗ABA信号转导关键酶SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶(SnRK)是植物体内ABA信号转导途径的关键调控酶, 在植物的抗逆境生长过程中发挥着重要的作用。本研究通过RT-PCR和RACE-PCR技术克隆出编码甘蔗SnRK2蛋白的基因SoSnRK2.1。该基因cDNA序列全长为1385 bp, 包含一个1002 bp的开放阅读框(ORF)。根据氨基酸序列预测SoSnRK2.1基因编码333个氨基酸残基, 与其他高等植物中相关蛋白的氨基酸具有高度的相似性, 尤其是与禾本科的玉米和水稻。构建该基因的原核表达载体pET-SoSnRK2.1, 在IPTG诱导下可得到38 kD 左右的蛋白, 与理论值一致。实时荧光定量PCR分析表明, SoSnRK2.1基因在ABA、干旱(PEG)+ABA、干旱(PEG)、NaCl、低温(4℃)和H₂O₂外源胁迫下均呈诱导表达的趋势。推测该基因参与调控干旱、高盐和低温等胁迫过程, 在甘蔗抗逆境胁迫中起重要作用。     

杨梅肌动蛋白基因MrActin1的克隆及表达分析

扩增杨梅嫩叶中肌动蛋白基因(MrActin1)全长编码区cDNA序列,并评价MrActin1的进化地位,同时分析MrActin1的表达模式。利用RT-PCR扩增MrActin1全长编码区cDNA序列。用生物信息学手段分析预测MrActin1的理化性质和同源性,用临接法构建其的系统发生树。通过Northern blot分析MrActin1在不同组织部位的表达。该基因cDNA序列（GenBank登录号AB 650589）全长1137 bp,编码了1个由377个氨基酸残基组成的蛋白质,所得序列与GenBank中注册的其他植物Actin氨基酸序列的相似性均在88%以上,根据高等植物Actin相似性构建了进化树,表明MrActin1与陆地棉、圆叶锦葵Actin之间的亲缘关系最为密切,在进化中分化时间最为接近。Northern blot分析表明,MrActin1在杨梅的花、叶、枝条和果组织中恒定表达。首次获得了杨梅MrActin1 cDNA全长序列。     

马铃薯野生种CHS基因cDNA的克隆与表达分析

设计简并引物,用RT-PCR法从马铃薯野生种(Solanum pinnatisectum)克隆到了CHS(Chalcone synthase,查尔酮合酶)基因的全长cDNA,并用半定量RT-PCR法进行了表达分析.序列分析表明,CHS基因编码一个389个氨基酸残基的多肽,在氨基酸水平上与其他茄科植物的同源性达到89%～93%,多重比较和系统发育分析均表明该基因为CHS家族中的一个新成员;检测了CHS基因的空间表达模式,该基因在花和匍匐茎中表达量最高,在根和块茎中没有检测到,这与花和匍匐茎呈淡紫色有花色苷合成,而根和块茎呈白色无花色苷合成是相一致的;发现在块茎中CHS受光诱导表达,光照后的第3天表达量最高,而在光照前检测不到,光照前块茎为白色,随着光照时间的延长,其表层颜色因积累花色苷而变成紫红色.     

川西獐牙菜SmGES基因的克隆、生物信息学分析与原核表达

研究藏药川西獐牙菜中环烯醚萜合成途径中的关键酶香叶醇合成酶的功能,并探讨其在香叶醇、龙胆苦苷和獐牙菜苦苷生物合成中的作用。以川西獐牙菜叶片为材料,提取RNA并反转为cDNA,通过川西獐牙菜转录组相关信息,用RT-PCR技术克隆得到了川西獐牙菜香叶醇合成酶基因,并命名为SmGES基因。将SmGES基因片段通过分子生物学的方法连接到原核表达载体pET-28a上并转化到Escherichia coli Rosetta(DE3)原核表达感受态中,进行相关的诱导表达。通过生物信息学进行相关分析得出,SmGES基因长1761 bp,编码586个氨基酸;SmGES蛋白等电点为5.35,相对分子质量为67.78 kDa。分析表明SmGES基因带有叶绿体转运肽,预测其是定位于叶绿体的亲水蛋白。文章还分析了该蛋白的细胞内定位、结构域、二级和三级结构。进化关系分析表明,SmGES基因与滇龙胆的GES基因具有较近的亲缘关系。诱导得到重组蛋白分子质量67.78 kDa的蛋白条带,与预期大小一致。研究结果为进一步阐明川西獐牙菜中环烯醚萜合成途径提供参考。     

紫色不结球白菜花色苷合酶基因BrcANS的克隆与表达分析

以不结球白菜紫色品系NJZX1-3和其绿色突变体NJZX1-0及其后代F₂的2个株系NJZX2-1和NJZX2-2为材料,研究花色苷合酶基因在紫色不结球白菜叶片花色苷合成途径中的作用。利用同源克隆的方法,分别在NJZX1-3及NJZX1-0中克隆到花色苷合酶基因;经序列比对发现,花色苷合酶基因的核苷酸和氨基酸序列在2种材料和大白菜中完全一致,长度为1077 bp,编码358个残基,第211~307肽段具有2OG-Fe (II)双加氧酶家族基因的结构域,被命名为BrcANS。BrcANS蛋白与同科芥菜的同源性高达99%,进化关系亦与其最相近。在全部4种材料鲜叶中,总花色苷的含量(TAC)与叶片紫色程度是一致的,其中,NJZX1-3叶片中总花色苷含量最高,达到80.15±5.74 mg 100 g^–1 FW;BrcANS表达量为NJZX1-0 < NJZX2-1 < NJZX2-2< NJZX1-3,与其总花色苷含量呈正相关。BrcANS的mRNA在NJZX1-3和NJZX1-0两种材料的不同组织中特异性表达：在叶片中高度表达,而在其他组织中表达较弱;另外,在两种材料间的表达亦存在显著差异,在NJZX1-3叶片中的表达丰度显著高于NJZX1-0。随着叶龄的增大,紫色不接球白菜叶片紫色变浅,BrcANS的表达量下降,但在NJZX1-3和NJZX1-0间的表达差异亦明显减小。以上结果表明,BrcANS基因是紫色不结球白菜中花色苷合成的关键基因之一,其mRNA表达量与叶片紫色直接相关,可能在其转录水平上调控叶片中紫色的形成。     

Bacillus subtilis FS321的α-淀粉酶基因的克隆与表达

耐热α-淀粉酶被广泛用于食品等诸多行业,本研究从中国北方高温堆肥分离的枯草芽孢杆菌FS321中克隆了一中度耐热α-淀粉酶基因,并实现在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达。通过PCR技术克隆Bacillus subtilis FS321的α-淀粉酶编码基因(BSA),该基因全长1980 bp。并构建重组表达质粒pET-28a/BSA,转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测到大小约为73.0 kDa的重组融合蛋白,可溶性淀粉平板检测结果表明BSA在大肠杆菌中实现了有效表达。该重组α-淀粉酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为7.5。