EDS1多肽抗体的制备和应用

EDS1蛋白是植物寄主SA信号转导通路中重要调控功能的蛋白,为获得效价高和选择性强的EDS1抗体,本研究根据NCBI GenBank中报道的EDS1蛋白一级结构信息,采用Blastn和Blastx等生物信息学软件进行序列同源性分析,获得三段序列特异性较高的多肽,并从中优选一段序列特异性多肽,采用9-氟甲氧羰基固相合成法获得序列特异性最好的多肽,采用HPLC和GC-MS测定合成多肽的浓度和分子量,试验表明目的多肽纯度达89.37%,目的多肽分子量为1978.33。采用碳化二亚胺法将多肽与KLH进行偶联获得免疫原-Pep-KLH,并将其免疫新西兰大白兔以获得抗血清和多克隆抗体,采用ELISA和Western blotting测定其效价和特异性,经ELISA检测表明抗血清和多克隆抗体可与Pep发生特异性免疫反应,经Western blotting试验表明抗血清和多克隆抗体可识别烟草叶片特异性条带,其相对分子量为70 kD,与预测分子量相符,表明利用该方法制备的EDS1多肽抗体具有较高特异性和灵敏度。     

马铃薯Y病毒脉坏死株系(PVYN)外壳蛋白基因的克隆、表达及其间接ELISA方法的建立

【目的】制备马铃薯Y病毒脉坏死株系（PVY^N）多克隆抗体,建立间接ELISA法用于检测PVY^N病毒。【方法】依据PVY^N的CP基因序列设计引物,利用RT-PCR方法获得CP基因并连接构建到原核表达载体,进行原核表达,以纯化的重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,获得PVY^N的抗血清并纯化。【结果】测序结果与其他已知序列比较,PVYNCP基因的核苷酸同源性95%,推断氨基酸的同源性达98%。以纯化蛋白为抗原进行免疫,成功获得了PVY^N外壳蛋白抗血清,纯化后的IgG采用间接ELISA法检测抗原,抗体效价达1：500,使用该抗体稀释度检测感染植株,结果呈阳性。【研究结论】通过分子生物学途径获得了PVY^N的多克隆抗体,建立的间接ELISA方法可以用于PVY^N的病毒检测。     

黄曲霉毒素B1完全抗原合成及鼠源多抗血清的制备

为了合成黄曲霉毒素B1(AFB1)完全抗原,制备鼠源AFB1多克隆抗体血清。通过琥珀酰亚胺酯法在黄曲霉毒素B1(AFB1)分子上引入羧基,生成黄曲霉毒素B1肟(AFB1O)。用EDC法和DCC法合成AFB1-BSA和AFB1-OVA。采用薄层层析技术、紫外光谱技术(Uv)、SDS-PAGE鉴定完全抗原的合成。通过免疫BALB/c小鼠,获得鼠原多克隆血清,采用间接ELISA方法测定多抗血清的免疫效价,用竞争ELISA检测多克隆血清的敏感性和特异性。结果表明：免疫小鼠血清效价都在1:3200以上,其中6号鼠效价最高,到达1.28×10-4,敏感性好,半数抑制浓度IC50为22.268 ng/mL,交叉反应率低。本研究成功制备了AFB1完全抗原,获得了敏感的AFB1多克隆抗体血清,为以后制备AFB1单克隆抗体及免疫学快速检测方法奠定了基础。     

TMV盆栽人为传毒试验研究

试验以烤烟品种K326为材料,对健康烟株以接触接种、磨擦接种、伤口接种、汁液喷施接种等方式进行接种烟草普通花叶病的试验,结果表明：烟草普通花叶病不通过烟叶气孔传毒,而是通过微伤口和大伤口渠道传播病毒,而且病毒入口离生长中心越近,病毒传播表现的速度更快。为烟草普通花叶病的侵染防范提供依据。     

伊维菌素人工抗原的制备及鉴定

为制备伊维菌素人工完全抗原,通过对伊维菌素进行化学修饰,引入活性基团羧基,合成具有半抗原结构特征的伊维菌素半琥珀酸酯。然后采用NHS法将半抗原与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联,制备人工免疫原IVM-BSA和检测原IVM-OVA,经SDS-PAGE和紫外光谱扫描鉴定。用人工免疫原IVM-BSA免疫Balb/c小鼠,间接竞争ELISA法测定抗血清效价。结果发现：偶联物IVM-BSA和IVM-OVA的偶联比分别为14.1:1和14.7:1,免疫小鼠抗血清效价达到1:12800,结果说明成功制备出人工完全抗原并且具有良好的免疫原性。     

西马特罗人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备

拟合成并鉴定西马特罗(Cimaterol,CIM)人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源CIM多克隆抗血清.通过重氮化方法将西马特罗偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫抗原BSA-CIM和包被抗原OVA-CIM,并采用紫外分光光度法和SDS-PAGE进行了鉴定.结果表明,半抗原CIM和载体蛋白偶联成功.动物免疫试验结果显示,6只小鼠效价均达1×10-3以上,且4号小鼠多抗血清抗CIM的IC50为86.9 ng/mL,表明成功获得了高效价、特异性好、亲和力高的的鼠源抗CIM多抗血清.     

芽孢杆菌BJ-6抗血清制备及其ELISA检测条件初探

芽孢杆菌BJ-6分离于杏树根部土壤,对多种植物病原真菌有抑菌活性,试验制备其抗血清,明确ELISA反应条件,用于相似抗原性生防菌的筛选。本文分别以芽孢杆菌BJ-6的抗菌蛋白和菌体研磨物为免疫抗原,制备出两种抗血清,其效价分别为1：3200和1：6400。间接ELISA反应发现：所购辣根过氧化物酶标记羊抗兔效价为1:7000;待测抗原可在37℃3h、4℃18h+37℃3h、37℃3h+4℃18h和4℃18h条件下包被;初步测定两种抗血清具有种的特异性。     

特布他林人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备

合成并鉴定特布他林（Terbutaline,TBL）人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源TBL多克隆抗血清。分别通过1,4丁二醚法和EDC法将特布他林偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫抗原BSA-TBL和包被抗原OVA-TBL,并采用紫外分光光度法和SDS-PAGE进行鉴定,通过动物免疫试验获得鼠源多抗血清,并使用ELISA和阻断ELISA的方法对多抗血清进行了鉴定。结果表明半抗原TBL分别和载体蛋白BSA及OVA偶联成功;受免6只小鼠效价均达1×10-4以上,且1号小鼠多抗血清抗TBL的IC50为55.88 ng/mL。本试验成功合成了TBL人工抗原,并生产了高效价、高敏感性的鼠源多克隆抗血清,为TBL单克隆抗体制备及其快速检测试剂的研制奠定了坚实的基础。     

丙烯酰胺人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

摘 要：利用偶联方法合成丙烯酰胺人工抗原,通过免疫方法获得抗丙烯酰胺多克隆抗体;应用戊二醛法将丙烯酰胺与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,并对这两种物质及其复合物进行紫外扫描,并用此复合物免疫兔子,利用间接酶联免疫吸附法测定抗体的效价;应用牛血清白蛋白与丙烯酰胺偶联人工抗体成功,抗体效价大于8100;应用人工抗原免疫成功制备抗丙烯酰胺多克隆抗体。     

淀粉磷酸化酶原核表达及单克隆抗体的制备

旨在体外表达淀粉磷酸化酶,免疫小鼠制备单克隆抗体。用PCR扩增木薯淀粉磷酸化酶基因,将其克隆到原核表达载体(pET28a)中,经E.coli表达纯化淀粉磷酸化酶。用纯化的淀粉磷酸化酶蛋白免疫Babl/c小鼠,间接ELISA测定小鼠血清效价,取小鼠脾细胞与小鼠SP2/0细胞融合,制备能产生抗淀粉磷酸化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并检测其亚型和抗体稳定性。重组质粒在E.coli中能高效表达淀粉磷酸化酶,免疫小鼠后取效价高的3#小鼠脾脏细胞和SP2/0细胞融合,共获得15株抗体效价均达到10~5以上,能稳定分泌抗淀粉磷酸化酶抗体的细胞株,与钙调蛋白、牛血清白蛋白无交叉反应,抗体亚型鉴定其中13株为IgG型抗体,其中2株抗体性能非常稳定。本实验制备的淀粉磷酸化酶单克隆抗体效价高、特异性强、稳定性好,为后续木薯中淀粉磷酸化酶研究奠定基础。     

烟草Ⅰ型几丁质酶的生物信息学分析

旨在对烟草Ⅰ型几丁质酶进行生物信息学分析,了解其生物学特征,为下一步研究烟草Ⅰ型几丁质酶在烟草抗病过程中的作用奠定基础。采用生物信息学的方法,对已在NCBI 上登陆的烟草、拟南芥、水稻、菜豆的Ⅰ型几丁质酶(chitinase,ChiⅠ)氨基酸序列特征和进化关系进行了预测和分析。结果表明,这4 种植物Ⅰ型几丁质酶的分子量大小在28~37 kDa之间,均具有信号肽,结构域高度保守,均具有几丁质结合区(Cht BD1)和催化功能区(Glyco_hydro_19);烟草中的3 种Ⅰ型几丁质酶序列相似性较高,可以聚为一类;烟草与拟南芥和菜豆中的一种ChiⅠ遗传距离较近,而与水稻中ChiⅠ的遗传距离较远。通过分析发现,烟草Ⅰ型几丁质酶有着与其他植物中该酶相同的特性,为进一步研究烟草抗病蛋白提供理论依据。     

烟草染色体片段代换系的构建与遗传评价

以综合性状优良的烤烟种质Y3为轮回亲本,抗烟草黑胫病(0、1号生理小种)和赤星病的雪茄烟种质Beinhart1000-1及优质烤烟品种K326为供体亲本,连续回交并结合分子标记辅助选择,构建国内外第一套由256个具有烤烟Y3遗传背景并渐渗有Beinhart1000-1和K326染色体片段株系代换系群体。该群体携带377个代换片段,分布于烟草24条连锁群上。每个株系携带1~5个代换片段,代换片段长度介于0.05~36.88 cM,平均长度7.75 cM。代换片段重叠累加总长度为2922.57 cM,是烟草基因组总长度的2.61倍。代换片段覆盖总长度为1114.32 cM,烟草基因组覆盖率为99.45%。本研究构建的片段代换系可用于烟草基因定位、复杂性状的QTL分析和标记辅助选择育种。     

对位红抗原合成和多克隆抗体的制备

制备了一种特异性强的抗对位红的多克隆抗体。采用混合酸酐法将活化的对位红半抗原与阳离子化牛血清白蛋白（cBSA）偶联成免疫原,免疫大白兔制备多克隆抗体,利用紫外分光光度计分析结合物的结合情况,间接ELISA和间接竞争ELISA分析抗体特性。紫外扫描分析的免疫原对位红与蛋白结合的偶联率为14:1,间接竞争ELISA法分析多克隆抗体效价达到1×106,50%抑制率检测限为7.43 ng/mL,检测的对位红线性范围在0.1 ng/mL～1μg/mL,抗体与对位红和苏丹红I交叉反应率分别为100%和97.8%,与苏丹红II、III、IV和甲苯胺红的交叉反应率很低,与罗丹明类色素无交叉反应。制备的对位红多克隆抗体具有很高的特异性,与其他色素交叉反应率低,可用于对位红在食品中残留的检测。     

花叶毛白杨叶片致黄因子的病毒学研究

为了探索花叶毛白杨的花叶形成因子,以花叶毛白杨为研究材料,采用接种鉴定、ELISA测定法、病毒双链RNA检测及RT-PCR检测4种方法对花叶毛白杨的致黄因子进行病毒学鉴定。结果表明：（1）花叶毛白杨花叶样品过滤液经对指示植物烟草（Nicotiana tabacum）、大豆（Glycine max）及北京杨幼苗（Populus beijingensis）摩擦接种或注射接种后,未出现皱折、局部失绿等症状。（2）花叶毛白杨花叶样品过滤液选用24种抗血清进行酶联免疫检测,均未得到阳性结果。（3）花叶毛白杨花叶样品dsRNA电泳图未出现明亮条带。（4）RT-PCR未得到扩增产物。花叶毛白杨的叶片致黄因子不是由植物病毒引起。     

新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及其抗原捕捉ELISA方法的建立

为建立一种快速的新城疫病毒病原检测方法。本研究以原核表达的重组HN蛋白免疫7周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA方法筛选,成功获得了1株能稳定分泌抗新城疫病毒HN蛋白的McAb杂交瘤细胞,命名为4E8,4E8亚类鉴定为重链属于IgG2a,轻链属于κ链。以多克隆抗体作为包被抗体、单克隆抗体4E8作为检测抗体,通过双抗夹心ELISA各个反应条件的优化,建立检测新城疫病毒抗原捕捉ELISA方法。该方法对EDSV、ITLV、IBV、IBDV不发生交叉反应,其敏感性比HA试验要高4倍以上,与RT-PCR相比较,符合率、敏感性和特异性分别为95.6%、93.3%、96.1%。本研究建立的NDV AC-ELISA有良好的重复性、敏感性和特异性,可应用于新城疫病毒感染的早期诊断。     

不同覆盖方式对烤烟成熟期根系活力和叶片衰老特性的影响

以烤烟K326为试材,在大田条件下研究了前膜后草、地膜覆盖、无覆盖3种不同覆盖方式下烤烟成熟期根系活力和叶片衰老特性变化.结果表明,与常规栽培相比,前膜后草覆盖方式下,烤烟成熟期根系活力显著提高,叶片叶绿素和可溶性蛋白质含量较高,叶片保护酶SOD、POD、CAT活性较强,MDA含量较低,烤烟衰老速度缓慢,延长烤烟成熟期,提高烤烟经济性状;而地膜覆盖方式下,烤烟根系活力降低,叶片叶绿素和可溶性蛋白质含量急剧下降,叶片保护酶SOD、POD、CAT活性下降,烤烟膜脂过氧化程度加剧,烤烟衰老速度加快.     

地黄花叶病毒（ReMV）生物学特性研究初报

地黄花叶病毒（Rehmannia mosaic virus,ReMV）是地黄上发生的一种烟草花叶病毒属（Tobamovirus）可能的新病毒。笔者对ReMV的生物学特性进行了初步研究。结果表明,ReMV粒子形态为杆状,可以侵染茄科、番杏科、十字花科和藜科等4科10种植物,其中在茄科的心叶烟、黄花烟、蔓陀罗;番杏科的番杏;藜科的苋色藜和昆诺藜上表现为局部枯斑症状。在红花烟、普通烟、番茄和白菜等植物上表现为系统花叶症状。ReMV的钝化温度为90-95℃,稀释限点为10-5-10-6,20-22℃条件下的体外存活期在60 d以上。     

烟草SKP1基因cDNA的克隆分析及原核表达

应用DDRT-PCR法获得可被壳寡糖诱导的枯斑三生烟SKP1基因cDNA的3’端序列,通过5’ RACE扩增该基因cDNA的5’ 端,进而扩增此基因cDNA的全长,通过同源性比较分析,与本塞姆氏烟草的SKP1基因同源性达81%,其cDNA全长653 bp(GenBank登录号：AY702087),其中编码区位于73~540 bp,编码一条155个氨基酸的多肽。经预测该多肽的分子量为17 527.78 Da,等电点为4.57,定位于细胞质,功能结构域分析结果显示在4~105位氨基酸有一明显的Skp1结构域,其E值为1.25e-52,因此推断该基因为枯斑三生烟的SKP1基因。将该基因编码区亚克隆到原核表达载体pET23b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达出与预测分子量一致的蛋白。为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

三个烟草品种瞬时表达OsWAK1::GFP的差异

在研究水稻基因OsWAK1功能的过程中,利用荧光分子标记的方法,将OsWAK1与绿色荧光蛋白GFP构建为融合蛋白,利用注射法使表达OsWAK1::GFP融合蛋白的农杆菌浸入烟草叶片。通过荧光显微观察,根据烟草叶片表皮细胞中是否产生绿色荧光来判断融合蛋白是否表达。研究中同时利用了3个不同的烟草品种,利用同样的方法和操作程序,但是最后根据烟草叶片中绿色荧光的检测结果发现,不同的烟草品种对OsWAK1::GFP融合蛋白的表达差异很大。OsWAK1::GFP融合蛋白能够在心叶烟叶片中表达,却未能检测到其在本生烟和三生烟两个品种的叶片中表达。     

鲁梅克斯K-1对关中奶山羊产奶性能的影响

为了研究鲁梅克斯K-1对关中奶山羊产奶性能的影响。选取50只健康、体质量、产奶量接近(P>0.5)的关中奶山羊,试验共分5个处理,每个处理10只,各处理每只羊每天均饲喂3 kg粗饲料和1 kg精饲料,对照组粗饲料全喂玉米秸杆青贮,A、B、C、D组用鲁梅克斯青贮分别替代0.5、1、1.5、2 kg玉米秸杆青贮,进行为期50天泌乳试验。结果表明：（1）整个试验期,处理C组共产羊奶1850 kg,处理C组分别比CK、A、B、D组多产奶490、325、260、310 kg,差异极显著(P<0.01);（2）处理C组比CK、A、B、D组奶山羊的乳干物质、乳脂率、乳蛋白及乳糖含量均有所改善,但差异不显著(P>0.5);（3）C组的纯收入为5675元,C组分别比CK、A、B、D组多收入2035、1350、1065、1215元,差异极显著(P<0.01)。鲁梅克斯营养丰富,与玉米秸杆混合青贮能有效提高关中奶山羊产奶量,改善乳蛋白、乳糖及乳脂率,其在粗饲料中添加量在50%为宜。