重组人肿瘤坏死因子TNF-α的克隆与原核表达

为了构建人肿瘤坏死因子TNF-α与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合基因表达载体,并进行原核表达。以人肿瘤坏死因子TNF-α全长转录本为模板,设计特异性引物,经PCR扩增目的基因将其定向克隆到pMD-l8T simple vector中,构建重组质粒pMD-18T-TNFα。然后通过亚克隆将测序正确的TNF-α基因插入表达载体pGEX-4T-1中,筛选出阳性质粒转化宿主菌株BL21(DE3),通过温度、时间等不同条件诱导表达重组蛋白。结果表明,成功克隆到大小为702 bp的TNF-α全长cDNA序列,通过限制性酶切、PCR扩增证实pMD-18T-TNFα和pGEX-4T-1-TNFα载体已构建成功。诱导表达得到约51 kDa重组蛋白GST-TNFα。说明重组蛋白GST-TNFα的表达成功,为进一步获得纯化TNF-α,研究其生物功能、作用机理,制备抗TNF-α单克隆抗体奠定基础。     

猪α1干扰素基因的克隆与原核表达

根据猪α1干扰素(pocine interferon-alpha1,poIFN-α1)的全基因序列(EU364896)设计合成1对特异引物,通过RT-PCR从三元杂交仔猪外周血淋巴细胞扩增出poIFN-α1全基因,将该基因克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T-poIFN-α1,进行测序。以pGEM-T-poIFN-α1为模板,经PCR扩增带有酶切位点的poIFN-α1基因,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达载体pGEX-6P-poIFNα1,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达和鉴定,并确定蛋白最佳表达条件。序列分析表明,克隆的poIFN-α1基因全长546bp,编码181个氨基酸,前23个氨基酸组成信号肽,无糖基化位点。SDS-PAGE和Western blotting证实重组表达菌经IPTG诱导后,可表达相对分子质量约46ku的融合蛋白(GST-poIFN-α1)。当以1.0mmol/L的IPTG于37℃下诱导表达9h时,蛋白表达量最高。poIFN-α1基因的克隆与表达为进一步研究其抗病毒活性,开发病毒治疗和疫苗免疫增强用生物制剂奠定了基础。     

棉花GhEPSPS基因的原核表达载体的构建及诱导表达

目的在于构建棉花GhEPSPS基因的原核表达载体,并在宿主大肠杆菌中成功诱导表达。利用RT-PCR技术从陆地棉苏棉18中克隆获得GhEPSPS基因的开放阅读框序列,连接到p EASY-Blunt平端载体,构建获得重组载体p EASY-Blunt-GhEPSPS;以该重组载体为模板,PCR获得两端含有Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点的GhEPSPS基因CDS序列,通过这2个酶切位点插入到p ET32a载体,构建获得原核表达重组载体p ET32a-GhEPSPS,转化到宿主菌株BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测目的基因的表达情况。研究结果表明,成功克隆获得了棉花GhEPSPS基因的CDS序列,并成功构建了该基因的原核表达载体,目的基因能够在宿主菌中被诱导大量表达。该研究结果将为深入研究棉花EPSPS酶的结构、功能以及酶学特性提供重要的研究基础。     

非洲马瘟病毒VP7基因的克隆与表达

为获得非洲马瘟病毒VP7蛋白,以用于制备AHS血清学诊断试剂并为AHS新型疫苗的构建奠定基础,笔者采用原核表达系统表达VP7蛋白。在GeneBank中查找非洲马瘟病毒VP7基因序列,人工合成VP7基因,将VP7基因片段克隆插入pBAD/Thio-TOPO表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌TOP10。经测序鉴定,筛选获得VP7基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,经L-Arabinose诱导表达VP7融合蛋白抗原。SDS-PAGE分析表明以终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖进行诱导,4h后表达可达到高峰,融合蛋白质量约54.72 kDa。Western blotting检测和间接ELISA表明诱导表达的融合蛋白能与非洲马瘟病毒VP7单克隆抗体发生特异性反应,说明蛋白有特异的免疫学活性。     

血清4型禽腺病毒六邻体蛋白的原核表达及鉴定

通过原核表达的方法得到血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白;根据GenBank中血清4型禽腺病毒六邻体蛋白的基因序列,设计一对特异性引物,利用普通PCR方法扩增得到hexon基因的全长序列。将PCR扩增得到的血清4型禽腺病毒六邻体基因片段,在其两端插入酶切位点后克隆至载体pMD18T中,经PCR鉴定和测序分析正确后,与原核表达载体pET-32 a进行连接,构建pET-32 a-hexon原核表达载体,并对其进行双酶切和测序鉴定。将构建成功的表达载体转化至BL21(DE3)中,用1 mmol/L的IPTG进行诱导表达,对得到的重组蛋白进行SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定;经双酶切鉴定和测序鉴定,pET-32a-hexon原核表达载体构建成功,插入的六邻体蛋白基因片段大小为2 814 bp,在1 mmol/L浓度IPTG诱导3 h时重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白分子量为118 ku。免疫印迹分析结果显示,融合蛋白可被抗FAdV-4的血清和HIS标签抗体特异性识别;成功表达了血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白,且得到的重组蛋白具有良好的反应原性,可用于血清4型禽腺病毒的进一步研究中,为血清4型禽腺病毒病的预防和治疗奠定了良好的基础。     

小麦TaNADP-ME1基因在大肠杆菌中的融合表达及可溶蛋白纯化

NADP依赖的苹果酸酶(NADP-ME)是C4光合途径关键酶。为了确定TaNADP-ME1基因的功能,利用重组技术将前期克隆到的TaNADP-ME1基因构建到原核表达载体pET32a,双酶切和PCR鉴定阳性克隆,CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白。成功获得了重组原核表达载体pETE1,TaNADP-ME1基因在BL21(DE3)pLysS中得到了融合表达,SDS-PAGE表明,融合蛋白分子量为80 kDa,并成功纯化到融合蛋白。     

牛IL-6基因原核表达及其对口蹄疫病亚单位疫苗的佐剂效应研究

为了研究荷斯坦奶牛白介素6(IL-6)基因作为佐剂对VP1蛋白免疫效果的影响,分别克隆IL-6基因和VP1基因,连接到载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-6P-1/BoIL-6、pGEX-6P-1/VP1、pGEX- 6P-1/BoIL-6/VP1。重组质粒在大肠杆菌RS21中高效表达,动物试验检测IL-6作为分子佐剂对豚鼠免疫应答的影响。结果表明：构建的重组质粒在原核系统中正确表达,以包涵体形式存在。表达的融合蛋白三次免疫豚鼠后,检测发现IL-6/VP1组能够诱导产生高水平的体液免疫反应和细胞免疫反应,与疫苗组及VP1+FCS组免疫效果相当。本实验证实IL-6作为分子佐剂能够提高VP1的免疫效果。     

C型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1基因的原核表达及其生物活性的初步分析

将口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白基因P1的完整cDNA序列插入原核表达性载体pET-28α(+)中,获得融合表达质粒pET-P1,转化E.coli.BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,pET-P1获得融合表达, Western Blot 检测证实表达的融合蛋白具有免疫活性,表达产物主要以包涵体的形式存在,进一步采用纯化试剂盒纯化P1蛋白做为诊断抗原.     

大肠杆菌异质型ACCase亚基基因accB重组表达载体的构建和原核表达

摘要：克隆大肠杆菌乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl CoA Carboxylase, ACCase）的生物素羧基载体蛋白（biotin carboxyl carrier protein,BCCP）亚基基因accB,构建accB的原核表达载体pGEX-4T-accB,转化大肠杆菌BL21（DE3）工程菌株, IPTG诱导进行融合表达,成功诱导表达了GST-accB融合蛋白,大小为43KDa。     

海岛棉GBNBS基因的原核表达以及表达产物的活性分析

 分别构建含有GBNBS基因全长序列以及去除富含亮氨酸重复区(Leucine-rich repeat, LRR)的部分序列的原核表达载体P3161和NBCD,SDS-PAGE凝胶电泳检测发现在IPTG诱导下,重组载体P3161和NBCD在BL21菌株中可以分别表达90 kDa和60 kDa的目的蛋白,Western blot证明它们为目的基因表达产物。分离纯化这两种蛋白并分析酶活功能,发现GBNBS全长蛋白具有ATPase活性,而去除LRR的缺失蛋白的ATPase活性则大幅降低。GBNBS基因的原核表达以及表达产物的活性研究为进一步了解该基因抗性功能与抗性机制奠定基础。     

鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶的原核表达

为了原核表达鸭疫里默氏菌噬菌体RAP44的裂解酶基因,以噬菌体RAP44的基因组为模板,用PCR方法扩增裂解酶基因,与表达载体p GEX-6P-1连接,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱纯化表达蛋白。结果成功构建了表达载体p GEX-N,转化菌经IPTG诱导后成功表达出了分子量约为37 k D的可溶性重组蛋白。本研究获得了纯化的鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶重组蛋白,为裂解酶的功能研究奠定了基础。     

小麦甲基结合蛋白基因MBD3重组表达载体的构建和原核表达

本研究构建了小麦甲基结合蛋白基因MBD3的原核表达载体pGEX-4T-MBD3, 转化大肠杆菌BL21 (DE3)工程菌株,在37 ºC,1 mM IPTG浓度条件下,成功诱导表达了的GST-MBD3融合蛋白,大小为49.6 kDа,这为进一步开展MBD3的蛋白纯化和功能分析奠定了基础。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a蛋白转肽酶区的原核表达及鉴定

本研究对编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）非青霉素结合蛋白2a（PBP2a）的转肽酶区（TPase）原核表达并进行Western blot鉴定。首先通过PCR方法由MRSA基因组中扩增转肽酶区基因片段,并构建pGEX-6p-1-TPase重组质粒,转化BL-21,诱导目的蛋白表达,然后进行Western blot鉴定。结果表明,成功构建出pGEX-6p-1-TPase原核表达载体,并成功表达出PBP2a的转肽酶区蛋白（TPase）,为其进一步的研究和应用奠定了基础。     

玉米Zmcen基因的克隆、表达与生物信息学分析

为研究玉米Zmcen基因的特征及生物学功能,并对其编码蛋白结构与功能进行分析。以玉米c DNA为模板,将其构建到带有GST表达标签的原核表达载体p GEX-6p-1中,构建的重组载体p GEX-6p-ZmCen转化至大肠杆菌BL21(DE3),通过0.3 mmol/L IPTG在27℃下诱导表达20 h,获得了可溶性的GST融合蛋白。采用GST亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经12%SDS-PAGE电泳和GST标签抗体Western Blotting检测,鉴定为含有GST-Tag的融合蛋白,纯化的蛋白经Pre Scission Protease(PPase)过夜酶切切除GST标签,得到较纯的ZmCen蛋白;同时利用生物信息学的方法,解析ZmCen蛋白质的结构特征。结果表明,该基因定位于玉米第7#染色体上,全长基因含有6个外显子和7个内含子,519 bp的开放阅读框,编码172个氨基酸,分子量约为19.78 k Da,等电点为4.78。采用maize GDB数据库对玉米整个生命周期的表达水平进行分析表明,细胞分裂旺盛的部位,Zmcen基因的表达量较高。对16种植物进行系统发育树分析显示,Zmcen基因与水稻、小麦、拟南芥等的centrin基因同源性高达80.21%,该结果为探索Zmcen蛋白的未知生物学功能提供了线索。     

抗凋亡融合蛋白PTD-Bcl-xL原核表达载体的构建及表达纯化

人工抗凋亡蛋白PTD-Bcl-x L能保护多种因素引起的细胞异常凋亡,为了获得高纯度Bcl-x L与PTD(Protein transduction domains)的融合蛋白,首先采用TRIzol法提取SD大鼠肝脏总RNA,将RNA反转录为c DNA,设计引物以c DNA为模板,PCR扩增Bcl-x L基因,构建p UM19-T-Bcl-x L质粒,并对质粒双酶切鉴定和测序鉴定;其次设计包含PTD序列的Bcl-x L引物,以测序正确的p UM19-T-Bcl-x L质粒为模板,PCR扩增PTD-Bcl-x L序列,将扩增序列克隆入p ET28a载体,构建PTD-Bcl-x L蛋白的原核表达质粒p ET28a-PTD-Bcl-x L,并对p ET28a-PTD-Bcl-x L载体双酶切鉴定和测序鉴定;将p ET28a-PTD-Bcl-x L重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对IPTG诱导融合蛋白表达的浓度和诱导时间进行了优化;SDS-PAGE分析表达蛋白的可溶性情况,在变性条件下用Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白;最后用SDS-PAGE、Western Blot及质谱对融合蛋白进行鉴定。结果表明:双酶切p UM19-T-Bcl-x L质粒出现约774 bp大小条带,p UM19-T-Bcl-x L质粒测序结果与NCBI数据库比对序列一致,表明成功构建p UM19-T-Bcl-x L质粒;双酶切p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒出现约744 bp大小条带,p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒测序结果与预期序列一致,表明成功构建了p ET28a-PTD-Bcl-x L原核表达载体;在IPTG诱导下p ET28a-Bcl-x L重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出36 k Da大小蛋白,最优IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为6 h;SDS-PAGE电泳显示融合蛋白主要出现在菌液超声后的沉淀里,以包涵体形式表达,经Ni-NTA琼脂纯化获得了高纯度的融合蛋白;Western Blot和质谱鉴定证明IPTG诱导表达蛋白和纯化的融合蛋白为PTD-Bcl-x L蛋白。纯化得到了PTD-Bc L-x L融合蛋白,推进了PTD-Bcl-x L蛋白在猪、牛等家畜精液冷冻保存的应用进程。     

口蹄疫病毒受体羊源整联蛋白β6亚基配体结合域的原核表达、纯化及鉴定

利用原核细胞表达羊口蹄疫病毒(FMDV)受体整联蛋白β6亚基的配体结合域 (LBD)片段,分离纯化目的蛋白.以含有羊整联蛋白β6亚基全长cDNA的质粒为模板,PCR扩增得到β6LBD基因片段,经酶切消化处理后与同样酶切处理的原核表达载体pP_(RO)EX~(TM)HTb相连,构建原核表达质粒pP_(RO)/β6LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞 BL21 (DE3),IPTG诱导表达重组羊β6LBD融合蛋白.SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达并利用镍离子亲和树脂对其纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot方法分析鉴定表达产物.成功构建了pPRO/β6LBD原核表达载体,实现了羊FMDV受体整联蛋白亚基β6LBD在大肠杆菌中的高效表达, SDS-PAGE显示其相对分子质量(Mr)约为33 kDa,重组蛋白主要以包涵体形式存在于菌体中.用本试验室保存的抗FMDV受体猪源整联蛋白β6亚基LBD的单克隆抗体进行ELISA 和Western blot检测,显示该单抗可与重组目的蛋白发生特异性反应,证明纯化后的蛋白与特异性抗体具有良好的特异性反应及抗原活性.为深入研究整联蛋白受体β6亚基在羊体内的分布及其在FMDV致病过程中的作用机制奠定了基础.     

重组人早孕因子的表达与纯化

早孕因子(EPF)是具有免疫抑制和生长调节活性的妊娠相关蛋白,为目前最早确认妊娠的生化指标之一。为获得人早孕因子重组蛋白,利用PCR技术扩增人早孕因子基因,克隆入原核表达载体pGEX-6p-1,与GST基因相融合,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌表达菌株BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,以SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白的表达,利用GST树脂纯化表达蛋白。结果成功构建重组表达质粒pGEX6P-EPF,在大肠杆菌中诱导表达了GST- EPF融合蛋白,表达蛋白分子量为37.3kDa,并能被抗GST单克隆抗体特异识别,GST亲和层析纯化,制备了EPF重组蛋白。