仔猪感染粪肠球菌的病原鉴定及病原特性初报

旨在对引起河南省三门峡某猪场肥育仔猪发病死亡的病原菌进行鉴定,并对其病原特性进行初步分析。用常规手段分离纯化可疑病原菌,观察其形态染色特性和培养特性,然后利用Vitek-32全自动细菌鉴定系统进行生化特性鉴定,并进一步检测分离菌株的明胶酶和溶血素等毒力因子表型及其药物敏感性。结果表明：①经细菌分离纯化,得到2个呈链状排列的G＋球菌分离株,分别命名为HE1和HE2株。②经Vitek-32全自动细菌鉴定系统鉴定,2株分离菌均为粪肠球菌（E. faecalis）。③毒力因子表型试验表明,HE1和HE2均具有溶解明胶的能力,且能裂解兔红细胞,其中HE1呈现β型溶血,HE2呈现α型溶血。④动物试验表明,分离菌株对小鼠具有致死作用,其中HE1毒力更强。家兔对上述分离株具有一定耐受性,仅表现出临床症状但不死亡。⑤药敏结果显示分离菌对万古霉素、替考拉宁、利富平和氨苄西林敏感,对诺氟沙星、红霉素、卡那霉素和四环素耐药。粪肠球菌感染可以导致仔猪发病死亡,但不同的粪肠球菌分离株对动物的致死能力有差异。     

四川地区猪场中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的SCCmec基因分型与耐药性分析

为研究四川猪场分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的耐药现状及其SCCmec基因型情况,讨论猪源MRSA对公共卫生带来的隐患。于2013年3-12月在四川地区12个规模化猪场采集的120份样品中分离金黄色葡萄球菌(SA),对PCR初步鉴定出SA,再鉴定mec A、fem A耐药基因,阳性菌株判定为MRSA。对鉴定出的猪源MRSA进行SCCmec分型与耐药性试验及分析。共分离出60株金黄色葡萄球菌,其中22株MRSA,检出率18.3%(22/120),饲养员手棉拭子、猪鼻捻子、猪场水样中均分离出MRSA。药敏试验结果表明,22株MRSA菌株的多重耐药性明显,耐药性主要表现为4、6耐,其中SCCmecⅣa型17株、SCCmecⅠ型5株。目前四川地区猪源MRSA不仅对猪场人员存在感染隐患,同时也对公共卫生安全存在一定的威胁。     

猪源奥斯陆莫拉氏菌的分离鉴定、耐药性及大环内酯耐药基因检测

为研究奥斯陆莫拉菌的致病机制及防控措施,对疑似患有奥斯陆莫拉菌的病猪肺组织进行病原分离,得到了1株优势菌命名为ZF2。对分离菌株进行形态学观察、生化试验、分子生物学鉴定,动物回归试验和药敏试验。结果显示,分离菌株为革兰阴性杆菌且对健康仔猪具有较强的致病性,经生化试验和分子生物学分析鉴定为奥斯陆莫拉菌。该分离菌株对阿奇霉素、红霉素呈现较强的耐药性。经大环内酯耐药基因检测结果显示erm B基因为阳性。本研究对奥斯陆莫拉菌病选择合理、正确的抗菌药物提供了一定的科学依据,并为进一步研究其耐药机制奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌高免血清的制备与应用

利用华中农业大学蔡旭旺博士分离鉴定的副猪嗜血杆菌作为标准菌株培养灭活后,两次免疫家兔后,耳静脉攻毒,心脏采血,琼扩试验检测抗体效价,抗体在1:8以上颈静脉放血,分离血清,用于琼扩试验检测本室从河南省发病猪场分离鉴定的副猪嗜血杆菌的血清型,所分离的33株菌中有12株4型,9株5型,6株13型,3株14型,2株12型,1株2型,未分出其它血清型。结果表明河南省副猪嗜血杆菌主要以4型、5型和13型为主要流行的血清型。     

猪链球菌ssnA基因缺失突变菌株的构建及毒力分析

分泌型核酸酶基因ssnA是近年来研究发现的一种脱氧核糖核酸酶,被认为是一种猪链球菌2型(SS2)潜在的毒力因子。为了分析ssnA基因对于SS2毒力的影响,通过体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,电转化进入SS2,经同源重组构建了SS2流行毒力株GD01的ssnA基因缺失突变菌株,并通过比较分析了野生菌株与缺失突变菌株的生长特性及溶血活性等生物学特性。结果显示,GD01株与ΔssnA突变株的生长速度及溶血活性没有明显差异;ssnA基因缺失后SS2对Hep-2细胞的黏附及入侵能力则明显下降。小鼠毒力试验结果显示,ssnA基因缺失突变菌株对于CD1小鼠LD50是6.17×108cfu,而SS2野生菌株的LD50是4.42×107cfu,缺失突变株的LD50约是野生株的14倍,表明ssnA的缺失对SS2毒力产生明显影响,提示ssnA基因在其致病过程中具有重要作用,其具体作用机制需进一步分析。     

陕西省地方酸奶中乳酸菌的分离鉴定及耐药性分析

从5种陕西省市售地方酸奶中分离出乳酸菌,研究乳酸菌分离株对多西环素、万古霉素、头孢吡肟、庆大霉素、四环素、链霉素以及红霉素这7种抗生素的耐药性。利用MRS培养基和MC培养基,通过划线分离培养分离酸奶样品中的乳酸菌,对分离株进行甲苯胺蓝染色初级鉴定,同时采用纸片扩散法进行耐药性对比。从5种品牌酸奶中共分离出5株菌株,包括杆菌4株、球菌1株,用纸片扩散法进行耐药性测定均没有检测到获得性耐药表型。     

零售鲜猪肉中肠球菌的鉴定与毒力基因检测

2007年～2008年间,分别从郑州市5个农贸市场鲜猪肉销售摊点采集了52份猪肉样品,经细菌分离得到30株疑似肠球菌,通过细菌形态学和培养特性的观察,并采用Vitek-32全自动细菌鉴定系统对其进行分析,最终鉴定为肠球菌,其中粪肠球菌(E. faecalis)16株、屎肠球菌(E. faecium)4株、铅黄肠球菌(E.casseliflavus)6株、鸟肠球菌(E.avium)2株、鹑鸡肠球菌(E. gallinarum )2株。药敏试验结果表明：肠球菌对呋喃妥因、万古霉素、替考拉宁和氨苄青霉素有较高的敏感性,对四环索、卡那霉素和红霉索的敏感性较低。经过对肠球菌6种公认的毒力基因cylA、gelE、efaA、ace、AS和esp的检测,发现分离株携带毒力基因不同,7号粪肠球菌携带6种,而12号屎肠球菌则全部为阴性,其它菌株则携带1～5种不等的毒力基因。     

猪细小病毒1型突变株分离鉴定及全基因组进化分析

旨在对猪细小病毒1型(PPV1)突变株生物学特性进行分析。对采自山东不同地区养猪场的67份流产胎儿组织样品进行PPV的分离和培养，经电镜观察和IFA试验进行鉴定，通过Overlap PCR对分离株进行全基因序列扩增，SnapGene V4进行序列拼接和比对，利用DNAMAN V6对基因组末端5′UTR和3′UTR二级结构进行展示和比较，应用MEGA V7进行遗传进化分析，最后利用多步生长曲线绘制对分离株在易感细胞内的增殖能力进行比较。共分离得到3株病毒，均鉴定为PPV1型毒株，分别命名为SDPV1、SDPV2和SDPV3,GenBank登录号分别为ON924737、ON924738和ON924739;3个分离株全基因序列长度基本一致，其中5′-UTR序列高度保守，呈Y型结构；而3′-UTR呈U型结构，个别碱基有所差异；VP2氨基酸序列中有5个非同义突变位点，分别为T20A、R82K、Q226E、D366N和K407N,为国内毒株首次发现。生长曲线显示，突变株生长趋势相对较快，与PPV-QN株相比，最高滴度相差10倍。报道了包含新型变异位点的PPV毒株的基因组特征。     

一株中华鳖源嗜水气单胞菌的分离鉴定及毒力基因分析

为了确定安徽某中华鳖养殖场导致中华鳖发病的病原,为今后生产中有效防控该疾病提供参考。本研究无菌条件下从患病中华鳖体内分离病原,通过形态学、生理生化特征和16SrDNA序列分析对病原菌进行鉴定;利用回归感染试验对病原菌致病性进行确定,采用琼脂扩散法进行药敏试验,并对病原的毒力基因进行分析。结果从患病中华鳖体内分离纯化得到一株致病菌,命名为AM-1,经鉴定该菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila);用该菌进行人工感染得到的症状与自然发病中华鳖症状一致;该菌对恩诺沙星和左氧氟沙星等药物敏感,对复方新诺明、氨苄西林和四环素等不敏感。毒力基因检测显示,该嗜水气单胞菌AM-1分离株携带气溶素、热不稳定性肠毒素、热稳定性肠毒素、溶血素、弹性蛋白酶5种毒力基因。最终表明嗜水气单胞菌AM-1是引起此次中华鳖发病的病原,可以使用恩诺沙星和左氧氟沙星等药物进行防治。     

副猪嗜血杆菌vacJ基因缺失菌株构建及其生物学特性分析

为了探究副猪嗜血杆菌外膜脂蛋白编码基因vacJ在其致病中的作用,以血清5型临诊分离株HS49为研究对象,构建了vacJ基因缺失菌株(ΔvacJ),进而比较了野生株与缺失株在生长特性、对细胞的黏附及入侵和毒力等方面的差异。结果显示,与野生株相比较,缺失vacJ后的菌株生长速率明显下降,对PK-15细胞的黏附和入侵能力则明显降低,形成生物被膜的能力也显著下降。缺失vacJ菌株对Balb/C小鼠感染模型的LD_(50)是野生株的14倍,表明vacJ基因敲除后,副猪嗜血杆菌毒力明显下降。表明vacJ基因与副猪嗜血杆菌生长、黏附入侵、生物被膜形成及毒力密切相关。     

猪源2型链球菌福建株CPS2J基因PCR检测及序列分析

设计并合成一对扩增2型猪链球菌CPS基因的特异性引物,以猪2型链球菌福建株DNA为模板,筛选最佳反应条件,建立检测CPS2J基因的PCR方法,并对PCR扩增产物进行序列测定和同源性比较分析。结果如下：应用该方法对猪2型链球菌福建株和标准阳性株进行扩增,均获得与预期大小一致的675bp特异性目的片段,而对8株非2型猪链球菌的扩增结果均呈阴性;敏感性测定最低可检出100cfu细菌量或50pg 细菌DNA;SS2PFJ06CPS2J 基因部分核苷酸及其推导的氨基酸序列与猪链球菌2型不同菌株的同源性分别达98.7%-100%和97.8%~100%。上述结果表明建立并优化的猪2型链球菌CPS2J基因的PCR检测方法敏感性好、特异性高,能用于2型猪链球菌的分子流行病学调查和快速检测; 序列分析表明猪2型链球菌福建株与国内外8株标准株之间同源性高、亲缘关系密切。     

银翘天甘对猪链球菌Ⅱ型病理模型的防治试验

为观察银翘天甘中药制剂体内抗猪链球菌病的效果。用猪链球菌Ⅱ型对18~22 g昆明鼠攻毒并开展预防和治疗实验。预防试验是用猪链球菌Ⅱ型对18~22 g昆明鼠攻毒同时口服银翘天甘中药制剂0.5、1.0、2.0 g/mL,1次/d,连用3天,观察7天后的动物发病率、死亡率和保护率;治疗试验是先用猪链球菌Ⅱ型攻毒并建立昆明鼠疾病模型后口服上述药物,2次/d,连用3天,观察7天后的动物死亡率、治愈率和有效率。预防试验结果表明：银翘天甘中药制剂组实验动物死亡率均极显著低于感染对照组(P<0.01);给药组实验动物发病率均极显著低于感染对照组(P<0.01);治疗试验结果表明：银翘天甘中药制剂组昆明鼠死亡率极显著低于阴性对照组(P<0.01);低剂量组治愈率极显著高于中、高剂量组(P<0.01),低剂量组有效率显著高于中、高剂量组(P<0.05),与阳性对照组之间无显著性差异(P>0.05)。由此表明,口服低剂量银翘天甘中药制剂能够在昆明鼠猪链球菌病理模型上发挥预防和治疗作用。     

猪附红细胞体感染BALB/c小鼠试验研究

为了解现阶段延边地区猪附红细胞体的致病性。本试验以注射地塞米松和摘除脾脏的BALB/c小鼠为实验动物,以腹腔注射方式人工感染猪附红细胞体,通过临床症状观察、血液涂片姬姆萨染色镜检及PCR方法对BALB/c小鼠感染猪附红细胞体情况进行了鉴定,并进行了血液常规检测。结果表明：注射地塞米松组、摘除脾脏组和正常感染组BALB/c小鼠在感染后8~10天相继达到高峰,正常感染组BALB/c小鼠在感染后第24天猪附红细胞体消失,注射地塞米松组在感染后第32天消失,而摘除脾脏组在试验结束时仍具有较高的感染率。经血液常规检测,各组BALB/c小鼠在感染猪附红细胞体后,白细胞总数显著升高(P<0.01),淋巴细胞总数、红细胞总数、血红蛋白含量均显著下降(P<0.05),红细胞比容显著下降(P<0.01)。本试验证实猪附红细胞体对低免疫力的BALB/c小鼠具有一定感染性,并表现出典型临床症状。     

菌落聚合酶链反应检测支气管败血波氏杆菌

根据支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica) 鞭毛蛋白基因的上游序列设计1对引物Fla1和Fla2,采用菌落PCR方法扩增目的基因片段来检测支气管败血波氏杆菌。利用该方法成功的从8株支气管败血波氏杆菌中扩增出237 bp左右的特异性目的片段。特异性试验表明,该方法对大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪链球菌和副猪嗜血杆菌均无交叉性反应。灵敏性试验表明,将单个菌落稀释105倍利用此菌落PCR仍能扩增到相应的目的片段。结果表明建立的菌落PCR方法对支气管败血波氏杆菌的检测敏感性高、特异性强,可用于Bb感染的诊断和流行病学调查。     

18个茶树菇菌株的亲缘关系分析及农艺性状评价

为获得不同来源茶树菇的亲缘关系并筛选适合工厂化生产综合农艺性状较优菌株,以18株(4株野生菌株、7株栽培菌株、5株经钴60辐照诱变菌株和2株搭载神州十号的航天飞船诱变菌株)茶树菇菌株为试验材料,采用分子标记ISSR、拮抗和同工酶技术进行菌株分型和亲缘关系分析;通过分析菌盖厚度和直径、菌柄长度和直径、生育期、产量,对18...     

猪等孢球虫PCR诊断方法的建立

参照GenBank收录的Isospora suis 18SrRNA基因全序列（U97523）,利用引物分析软件Oligo 6.57和Primer Premier 5.0设计了一对引物（上游引物：5'-tcctgcgagtactcatatgc-3';下游引物：5'-gttcagctacgcataccttg-3'）,首次扩增出猪等孢球虫分离株的18SrRNA基因序列,结合GenBank上登录的相关原虫序列,用DNAstar4.0软件比较其同源性,经Clustalx1.81序列比对,Paup4.0、Treeview3.0、Phylip种系发育关系软件分析后,证实该分离株为猪等孢球虫,并且河南不同地区之间的猪等孢球虫没有明显遗传差异     

附红细胞体感染后红细胞相关免疫因子的研究

为了检测小鼠感染附红细胞体后红细胞相关免疫因子的功能受影响,用猪附红细胞体阳性血感染BALB/c小鼠,在第1,3,5,7,9天后采用ELISA方法检测小鼠红细胞表面CD35和血浆中CD35、CD58和CD59水平变化。结果表明,小鼠感染猪附红细胞体后红细胞表面CD35分子水平逐渐降低;第1,3,5,7,9天后,血浆中CD35、CD58和CD59水平分别高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01),且第3天血浆CD35、CD58和CD59水平达到高峰。说明小鼠感染猪附红细胞体后红细胞表面CD35降低,血浆中CD35、CD58和CD59出现升高现象,且高峰均出现在第3天。试验表明,小鼠感染附红细胞体后红细胞表面CD35、CD58和CD59分子受到破坏,影响了红细胞的免疫功能,进一步可影响到机体的整个免疫系统的功能。     

阿魏侧耳与白灵侧耳的菌丝体生长和出菇特性

摘要：对2个白灵侧耳和2个阿魏侧耳菌株,进行拮抗试验、菌丝体生长观察和出菇试验。结果表明：两种侧耳的菌丝形态、子实体形态和对温度的反应有很大的差异。白灵侧耳的一级种、二级种均比阿魏侧耳菌株提前3-5天长满,栽培菌袋也是如此。拮抗试验两者间产生不生长区带。两种菌丝在低温下（15-20℃）试管内都易分化原基。阿魏侧耳由于播种期不同菇体的颜色和出菇所需的时间变化很大。白灵侧耳随着秋季播种期推后出菇时间延迟,菇形无变化,两者每袋产量差异不显著。     

兰州市娃娃菜褐腐病菌生物学特性及融合群鉴定

为给病害科学防治提供基础信息,对分离自兰州市红古区和永登县武胜驿镇罹病娃娃菜病株上的8 株立枯丝核菌菌株的形态、生长温度、致病性、对杀菌剂的敏感性等生物学特性进行研究,对其菌丝融合群归属进行分子生物学鉴定。采用温度梯度法测定病菌适宜生长温度,同时观察试验菌株微菌核产生情况;采用番红O和KOH染色法观测试验菌株细胞核数目;采用离体叶片接种法测定试验菌株的致病力;采用含药平板法测定试验菌株对5 种杀菌剂的敏感性;以试验菌株的5.8S rDNA-ITS 区序列构建系统发育树,进行融合群的分子生物学鉴定。结果表明,除菌株Rh-5 适宜生长温度为15~20℃外,其余试验菌株适宜生长温度均为25℃。试验菌株在5~30℃培养均可形成微菌核。菌株Rh-1~Rh-8 的细胞核数目分别为3~6、6~14、3~18、4~15、3~10、4~10、3~10、4~8 个。接种Rh-2~Rh-6 的娃娃菜离体叶片在20℃保湿培养2 天内发病显症,7 天发病率达75%~100%;接种Rh-1~Rh-8 的娃娃菜离体叶片在25℃保湿培养1~3 天内发病显症,7 天发病率达25%~100%;接种Rh-1、Rh-7 和Rh-8 的娃娃菜离体叶片在28℃保湿培养2~3 天发病显症,7 天发病率达100%。在试验浓度下,8 个试验菌株对5 种杀菌剂的敏感性由大 到小依次为多菌灵、代森锰锌、速克灵、三唑酮、苯醚甲环唑。除Rh-1 与Rhizoctonia solani AG 4 HG-II 聚为一枝外,其余试验菌株（Rh-6 除外,因Rh-6 测序未果）均与R. solani AG 2-1 聚为一枝。依据试验菌株的5.8S rDNA-ITS 区序列分析所得结果,引起兰州市娃娃菜褐腐病的立枯丝核菌包括AG 2-1 和AG 4HG-II 融合群。试验菌株在菌落形态、细胞核数目、适宜生长温度、生长速度、侵染温度、致病性及对杀菌剂的敏感性等方面呈现出丰富的多样性特征。在试验浓度下,多菌灵和代森锰锌对试验菌株的抑制率≥80%,可作为田间病害防治试验的推荐药剂。