‘苹果梨’果实着色过程中PyCHI和PyF3H的克隆与表达分析

【目的】克隆‘苹果梨’(Pyrus bretschneideri Rehd.‘Pingguoli’)Py CHI和Py F3H的全长c DNA序列,检测其在果实着色过程中的表达特性及其与花青苷积累的关系。【方法】以‘苹果梨’套袋后去袋处理的果实和未套袋的果实(CK)为试材,采用同源克隆技术克隆Py CHI和Py F3H的全长c DNA序列并进行生物信息预测分析;利用实时荧光定量PCR技术检测Py CHI和Py F3H在去袋处理与未套袋处理的不同着色时期的果实中的表达特性。【结果】Py CHI和Py F3H的全长c DNA分别为702 bp和1095 bp,分别编码233和364个氨基酸。同源性分析显示,其与沙梨、西洋梨等蔷薇科梨属植物相应基因的同源性均超过95%,相应氨基酸序列相似性均达到85%。实时荧光定量PCR分析显示,套袋果实去袋见光后Py CHI和Py F3H表达量均迅速上升,随后Py CHI表达量虽然略有下降,但在整个果实着色过程中Py CHI和Py F3H的表达量一直维持在较高水平,均显著高于对照,且与果实花青苷含量的变化规律基本一致。【结论】获得‘苹果梨’PyCHI和Py F3H的全长c DNA序列,其表达水平与果实花青苷积累关系密切,表明其在调控‘苹果梨’果实着色过程中起重要作用。     

枣果实黄烷酮-3-羟化酶基因(F3H)的克隆及生物信息学分析

以枣果实为试材,采用同源克隆的方法,利用转录组测序结果设计F3 H基因特异引物序列,成功克隆得到了枣果实F3 H基因全长,对其进行了生物信息学分析,并对该基因含量变化与花色苷的关系进行了研究。结果表明:F3 H基因全长1 336bp,编码367个氨基酸残基。根据基因序列比对结果,枣果实F3 H基因编码的氨基酸序列与龙眼(Dimocarpus longan)、橄榄(Canarium album)、荔枝(Litchi chinensis)及川桑(Morus notabilis)的一致性分别为90%、90%、89%、89%。半定量RT-PCR法分析表明,该基因在枣果实的红熟期表达量最大,其次为枣果实的半红期,而枣果实的绿熟期表达量最低;该基因表达量变化与花色苷含量变化一致。     

山桃稠李果实成熟过程花色苷含量的变化

以山桃稠李果实为试材,在山桃稠李的果实转色期采集果实,测定了不同采样时期果实的总花色苷、花青素-3-葡萄糖苷、苯丙氨酸解氨酶(PAL)含量,确定了果实从转色期至成熟期花色苷含量与PAL活性的相关性。结果表明:山桃稠李果实从转色期至成熟期总花色苷与花青素-3-葡萄糖苷均表现为增长趋势,成熟期含量最高;PAL对花色苷的形成具有积极作用;花青素-3-葡萄糖苷与花色苷变化呈正相关。     

茶树CsMAPK3的全长克隆及其逆境表达分析

以‘福鼎大白’茶树为材料,克隆了CsMAPK3的全长cDNA序列(GenBank登录号:MF034662)、基因组序列及其启动子序列。CsMAPK3的cDNA序列全长1700 bp,含有1119 bp的ORF序列,编码373个氨基酸;CsMAPK3蛋白预测为亲水性蛋白,含有多个磷酸化位点;多序列比对和进化树分析表明CsMAPK3 C–末端含有保守的CD结构域,属于TEY类型的A亚家族MAPK;亚细胞定位预测CsMAPK3主要定位于细胞质和细胞核中。CsMAPK3基因组全长4930 bp,包含5个内含子和6个外显子,第1个内含子和第2个内含子较大,分别为1608和1318 bp,外显子长度在130~350 bp之间。克隆获得起始密码子上游1125 bp的启动子区序列,该启动子上含有干旱、低温、高温以及ABA等相关的顺式作用元件。荧光定量表达分析显示,ABA、低温和盐胁迫均能显著上调茶树叶片中CsMAPK3的表达。蛋白互作预测表明CsMAPK3可能与MYBR1互作来响应ABA依赖途径的非生物胁迫过程。综上表明,CsMAPK3可能与茶树抗逆响应密切相关。     

龙眼胚胎F3H基因的cDNA克隆及序列分析

采用IEF-SDS-PAGE双向电泳技术,对‘立冬本'龙眼合子胚发育不同时期的蛋白质进行分离,通过MALDI-TOF-TOF鉴定到其中一个上调差异表达的蛋白为黄烷酮-3-羟化酶 (flavanone 3-hydroxylase,F3H)。以‘立冬本’龙眼胚胎cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术,获得F3H基因cDNA 1 404 bp全长序列。序列分析表明,F3H基因共编码365个氨基酸,其cDNA序列与柑橘、苹果、棉花等F3H基因的同源性均高达80%以上,该基因在GenBank中登录号为EF468104。     

迎红杜鹃的花色素组成及花色在开花过程中的变化

分析了迎红杜鹃（Rhododendron mucronulatum Turcz.）的花色素组成,调查了其在开花过程中花色、花色素组成和含量的变化。采用英国皇家园艺学会比色卡和分光色差计测量了不同开花阶段的花色。结果表明,开花过程中花色的明度增加,彩度变小,由红紫（70B）变为淡紫红色（84B）。用高效液相色谱—光电二极管阵列检测技术（HPLC - PAD）和高效液相色谱—电喷雾离子化—质谱联用技术（HPLC - ESI - MS）分析花瓣中花青苷和黄酮醇的组成及含量。在520 nm和350 nm波长下,共检测到15种化合物：5种花青苷、8种黄酮醇和2种芳香酸,推定出了其中10种化合物。花青苷：锦葵素 3-阿拉伯糖苷-5-葡萄糖苷;黄酮醇：杨梅黄素3-半乳糖苷和杨梅黄素3-鼠李糖苷;槲皮素3-半乳糖苷、槲皮素3-葡萄糖苷和两种槲皮素-鼠李糖苷以及山奈酚3-鼠李糖苷;芳香酸：绿原酸及其异构体。未检测到酰基化色素及5-O-甲基化黄酮醇。在6个开花阶段中,虽然花色变化明显,但花色素种类不变,其含量在各阶段差异极显著。从小蕾期到初开期,总花青苷含量（TA）和总黄酮醇含量（TF）迅速减少,花开放后变化平稳。基于花色素组成信息,探讨了耐寒杜鹃的花色育种策略。     

芜菁Br14-3-3的克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

克隆了‘津田芜菁’(Brassica rapa subsp. rapifera‘Tsuda’)通用调节因子14-3-3基因cDNA序列,命名为Br14-3-3(GenBank登录号为MK896872)。该基因全长1 113 bp,开放阅读框全长774 bp,编码含有257个氨基酸的多肽。荧光定量PCR分析Br14-3-3在‘津田芜菁’不同组织中及其在温度、脱水、渗透、ABA和无机盐等非生物胁迫下幼苗中的表达,结果表明该基因在‘津田芜菁’的花中表达量最高,幼苗中次之;低温抑制了Br14-3-3的表达,其他非生物胁迫可诱导该基因表达,暗示Br14-3-3在非生物胁迫应答中发挥功能。     

石蒜黄烷酮3–羟化酶基因LrF3H 的克隆及表达分析

 采用RT-PCR 和RACE 技术相结合的方法,从石蒜花瓣中克隆到1 个黄烷酮3–羟化酶（F3H） 基因的cDNA 全长序列,全长1 293 bp,包含1 098 bp 的完整开放阅读框,编码365 个氨基酸;氨基酸序 列比对显示该序列编码的氨基酸与水仙的F3H 具有高达91%的同源性,将其命名为LrF3H。二级结构预 测表明,随机卷曲是LrF3H 蛋白最大量的结构元件,而α–螺旋和延伸链散布于整个蛋白中。保守结构 域预测表明该基因编码的蛋白具有典型的F3H 蛋白功能结构域,其保守结构域中含有铁离子及2–O–酮 戊二酸结合位点,属于2OG-FeⅡ_Oxy 双加氧酶超家族。实时荧光定量PCR 分析表明,LrF3H 在整个花 发育过程中均表达,而且从初蕾期到盛开期随着花瓣着色加深表达量逐渐增加,盛开期表达量最高,之 后随着花朵萎蔫表达量下降;在不同器官中,LrF3H 的表达量在花瓣和花葶中最高,而在根、鳞茎和叶 片中都很低,推测该基因在石蒜花色形成过程中起着关键作用。     

‘巍山红雪梨’和‘美人酥’叶绿素、花色苷和类黄酮的动态变化分析

【目的】探究云南红梨果实各部分(果皮、果肉和种子)花色苷、叶绿素和类黄酮的动态变化规律,力求为优质红梨的生产提供理论依据。【方法】以云南境内主栽的‘美人酥’和‘巍山红雪梨’2个品种为试材,取其不同发育期的果实,将其果皮、果肉和种子分离,对花色苷、叶绿素和类黄酮含量进行测定。【结果】‘美人酥’各部位花色苷含量为0.395~0.896 g·L-1;‘巍山红雪梨’各部位花色苷含量为0.047~0.854 g·L-1。‘美人酥’各部位叶绿素含量为0.011~0.132g·L-1;‘巍山红雪梨’各部位叶绿素含量为0.023~0.203 g·L-1。‘美人酥’各部位类黄酮含量为0.689~2.564 g·L-1;‘巍山红雪梨’各部位类黄酮含量为0.182~0.974 g·L-1。红色砂梨各部位类黄酮含量花色苷含量叶绿素含量。花色苷在果实成熟过程中各部位含量都呈上升趋势而叶绿素含量呈下降趋势,类黄酮的含量在果皮中先升后降,在果肉中呈降—升—降的趋势。【结论】果实花色苷的变化规律有异于类黄酮和叶绿素,而类黄酮和叶绿素的变化规律相似。     

津田芜菁BrEGL3 cDNA的克隆及表达分析

 EGL3（Enhancer of Glabra3）蛋白是一种bHLH类蛋白,是一类重要的转录调节因子。为阐释BrEGL3在‘津田’芜菁（Brassica campestris L. ssp. rapifera‘Tsuda’）花青素生物合成中的调控作用,根据拟南芥EGL3基因序列信息设计兼并引物,克隆获得了‘津田’芜菁EGL3基因的全长cDNA序列,命名为BrEGL3,其GenBank登录号为HM208589。序列分析结果显示,BrEGL3全长1 794 bp,包含编码597个氨基酸的开放阅读框,分子量约为66.8 kD。氨基酸结构分析显示该蛋白含有DNA结合域,该结合属于螺旋—环—螺旋家族。氨基酸对比分析表明,BrEGL3与萝卜EGL3蛋白相似性最高,其次为拟南芥中的EGL3。荧光定量PCR检测BrEGL3在芜菁不同组织中的表达结果表明,该基因在有花青素合成的红色芜菁根皮中表达量最高。     

红穗醋栗生物学特性及其适生性研究

对引进的原产于哈萨克斯坦、由俄罗斯选育的红穗醋栗品种"红1号"、"红2号"、"KPC"在新疆玛纳斯平原林场和额敏县不同立地条件下栽培,进行物候期观察比较。结果表明:2个不同区域栽培的红穗醋栗的物候期具有10～15d的差异;在夏季炎热干燥、蒸发量较大的平原区栽培红穗醋栗如果水肥条件跟不上容易发生高温灼伤,停止生长等的现象,从而引起产量的降低。表明气候冷凉、土壤湿润、昼夜温差较大的区域是红穗醋栗最佳的栽培区域。     

白菜黄烷酮-3-羟化酶基因的电子克隆与序列分析

现根据同源基因相对保守性,利用已知的油菜F3H基因序列,采用电子克隆的方法获得了白菜F3H基因的cDNA序列;并采用生物信息工具对白菜F3H的性质包括氨基酸序列组成,物理和化学性质,疏水性或亲水性,二级和三级结构的特点进行了研究。结果表明:白菜F3H基因cDNA全长为1 228bp,包含1个完整的开放读码框(1 077bp),编码358个氨基酸。其分子量为40 104.6Da,等电点为5.45;其三维结构显示其是具有7个螺旋和12个折叠和一些不规则卷曲组成的球状结构。     

茶树亚硝酸还原酶基因CsNiR的克隆及表达分析

以‘龙井43’茶树叶片的cDNA为模板,利用RT?PCR技术克隆了茶树亚硝酸还原酶基因（CsNiR）,得到完整的ORF全长为1 764 bp,编码587个氨基酸;所推导的氨基酸序列与垂枝桦（Betula pendula）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、菠菜（Spinacia oleracea）和水稻（Oryza sativa）的同源性均大于76%。生物信息学分析表明,CsNiR分子量为68.648 kD,等电点为6.12,为亲水性的非分泌蛋白;二级结构的预测显示,CsNiR具有完整的NiR 蛋白结构,含血红素蛋白β–化合物区域和4Fe-4S区域。实时荧光定量结果表明,该基因在成熟叶片中表达量高于一芽二叶和根。采用营养液水培3个茶树品种,在氮饥饿两周后分别供应正常氮素和低氮素（1和0.1 mmol · L^-1 NH₄NO₃）,qRT-PCR测定发现,正常氮素处理的2 h和6 h,诱导根CsNiR表达量显著增加,叶片中的表达量变化延迟到24 h之后,且变化幅度存在基因型之间的差异;低氮处理对CsNiR表达量的影响相对较小。因此,研究CsNiR基因的表达特性及其在茶树氮素利用中所发挥的作用,需结合茶树基因型、组织部位、供氮水平等进行综合评价。     

黄瓜果实弯曲相关基因Cs14-3-3 的克隆及表达分析

 以黄瓜（Cucumis sativus L.）果实易发生弯曲的品种‘长春密刺’为试验材料,采用RT-PCR 技术从果皮中分离并克隆了14-3-3 蛋白基因,并将此基因命名为Cs14-3-3。Cs14-3-3 基因cDNA 全 长792 bp,编码263 个氨基酸,分子量29 589.287 Da,等电点为4.585。生物信息学分析表明此基因含有 14-3-3 蛋白基因的典型结构域,与其他物种14-3-3 蛋白基因核苷酸序列同源性达到75%以上,编码的氨 基酸序列同源性达到85%以上,属于14-3-3 蛋白基因家族。同时,采用实时荧光定量PCR 方法对顺直果 实和弯曲果实腹部及脊部在果实开花的2、4、6、8、10、12 d 的基因表达量进行了研究。结果显示,在 果实发育各个时期,Cs14-3-3 的表达量均为在弯曲果实腹部 > 顺直果实 > 弯曲果实脊部的表达量;在 各个部位,Cs14-3-3 在果实开花2 d 的表达量明显高于开花后其他时期。试验结果表明,Cs14-3-3 基因为 黄瓜果实弯曲相关基因,在黄瓜果实开花早期发育过程中起重要作用。     

黄瓜转录因子CsCBF3 的克隆及表达分析

利用RT-PCR 技术从黄瓜中克隆了植物低温信号转导途径中的关键转录因子C-repeat-Binding
Factor3,将其命名为CsCBF3,GenBank 登录号为JQ900769。CsCBF3 基因开放阅读框全长为615 bp,
编码204 个氨基酸。进化树分析表明,CsCBF3 隶属于CBF 基因家族,与葡萄CBF3 蛋白亲缘关系最近,
而与黑麦草、水稻CBF3 蛋白亲缘关系较远。生物信息学分析结果表明,CsCBF3 编码的蛋白包含保守的
AP2 DNA 结合域,N 端的核定位信号区和C 端的酸性氨基酸富集区,且该蛋白中的一些磷酸化位点及二
级结构在与DNA 互作过程中发挥重要作用。荧光定量PCR 检测结果显示低温可诱导CsCBF3 的表达,且
其表达量在迅速达到峰值后又降低,说明CsCBF3 是一个快速响应基因,推测其在黄瓜耐冷过程中起着重
要的作用。     

龙眼TPI基因的克隆及其在体胚发生过程中的表达分析

 采用RT-PCR结合RACE法,通过T/A克隆测序,获得龙眼胚性愈伤组织磷酸丙糖异构酶基因（TPI）两个类型的全长序列TPIⅠ（GenBank登录号：FJ595244）和TPIⅡ（GenBank登录号：GU073294）,序列全长分别为1 084 bp和1 113 bp,其ORF都由765 bp核苷酸组成,编码254个氨基酸,与其它植物的TPI在核苷酸序列和推导的氨基酸序列的相似性较高。qRT-PCR结果分析表明,在龙眼体胚发生过程中,TPI在松散型胚性愈伤组织阶段的转录水平比较低,在胚性愈伤组织Ⅱ阶段转录水平急剧升高,并一直持续到胚性紧实球形结构阶段,球形胚阶段大幅下调,之后至子叶形胚阶段都维持在较低水平,初步证明TPI及其编码蛋白在龙眼启动体胚发生和早期体胚发育中行使重要的功能。     

荔枝类甜蛋白基因的克隆与表达分析

以‘妃子笑’荔枝（Litchi chinenesis）为试材,通过PCR方法克隆了荔枝类甜蛋白基因LcTLP（登录号JF682821）的cDNA全长和完整开放阅读框（ORF）对应的gDNA序列。序列分析表明：该基因无内含子,cDNA序列含有一个672 bp的ORF,编码223个氨基酸残基序列。荧光定量PCR结果表明：LcTLP在花中表达量最高,其次是果皮,在果肉中表达量最低;在果实发育过程中,果皮中LcTLP表达量先上升后下降,采后果皮中的表达量高于采前,炭疽菌侵染诱导LcTLP的表达,失水和低温能抑制LcTLP的表达。