菠萝AcSERK1启动子的转录起始位点及胚性细胞特异性鉴定

AcSERK1是菠萝(Ananas comosus)体细胞胚发生初期特异表达的基因,为探讨其转录调控规律,对其5′上游调控序列的转录起始位点及启动特性进行了鉴定。采用hiTAIL-PCR技术从菠萝基因组DNA中克隆了AcSERK1完整的5′上游调控序列,利用5′RACE技术鉴定出其转录起始位点位于起始密码子(ATG)上游258 nt(G)处。以AcSERK1 5′上游完整调控序列取代pBI121中的CaMV 35S启动子,构建植物表达载体AcSERK1(–2090/+258)︰︰GUS,并在菠萝不同组织器官中进行瞬时转化分析,发现AcSERK15′上游完整的调控序列(–2090/+258)能够启动GUS在胚性细胞中特异性表达,与AcSERK1表达规律相同,说明该启动子为胚性细胞特异性启动子,对调控外源基因在体细胞胚早期特异表达有重要意义。     

菠萝AcSERK15’上游区(-499/+258bp)转录活性的研究

【目的】探究Ac SERK1启动子的功能,有助于了解Ac SERK1的表达调控模式。【方法】以‘神湾’菠萝(Ananas comosus L.‘Shenwan’)为材料,将Ac SERK1启动子缺失序列与GUS融合,构建植物表达载体,并导入根瘤农杆菌GV3101中。利用农杆菌真空渗透法侵染烟草叶片,并检测GUS活性;利用浸染法转化菠萝胚性愈伤组织获得转基因植株,分析光照、2,4-D和4℃等处理后的GUS表达量。【结果】构建2个Ac SERK1启动子植物缺失表达载体,分别命名为p(-30/+258 bp)和p(-499/+258 bp)。烟草瞬时表达结果显示p(-499/+258 bp)表现出强的GUS活性,p(-30/+258 bp)表现出微弱的GUS活性。q RT-PCR结果表明,光照处理后,GUS表达量降低。相反的,2,4-D和4℃处理转基因菠萝植株后GUS表达量均显著增加。【结论】Ac SERK1启动子-499/-30 bp区段内含有光、生长素和低温响应元件。     

甘蓝Ogura 细胞质雄性不育相关基因BoMF1启动子的克隆及功能分析

 通过TAIL-PCR 染色体步移技术,从甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）基因组中克 隆到胞质雄性不育（OguCMS）相关基因BoMF1 翻译起始位点上游521 bp 的启动子序列。软件分析预测 表明,该启动子序列中存在多个顺式作用元件,包括TATA-box、CAAT-box、MYB 结合位点、植物激 素响应单元等。为了研究该启动子的表达特性,亚克隆了BoMF1 转录起始位点上游521 bp 序列,将其置 换pBI121 中的CaMV35S 启动子,驱动其下游的GUS 基因,构建植物表达载体pBI121-BoMF1P,以pBI121 空载体作为阳性对照,通过农杆菌（LBA4404）介导法转入拟南芥。结果表明,甘蓝BoMF1 启动子序列 能驱动GUS 基因在拟南芥花药发育晚期的花药和花粉中特异表达,表达具有组织特异性。     

银杏查尔酮合成酶基因启动子（GbCHSP）调控元件及功能分析

通过染色体步移方法从银杏（Ginkgo biloba L.）基因组中克隆到查尔酮合成酶基因（CHS）翻译起始位点上游1 711 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子片段中存在多个顺式作用元件,包括紫外/蓝光响应单元、植物激素响应单元、真菌诱导元件、MYB结合位点、TATA-box和CAAT-box等。亚克隆了CHS转录起始位点上游1 402 bp序列,将其与GUS基因构建融合表达载体pBI121 + CHSP,以pBI121-35S作为负对照,通过农杆菌（LBA4404）介导法分别转入烟草。结果表明,银杏CHS启动子序列能驱动GUS基因在烟草中的表达,表达具有组织特异性。GbCHSP的功能研究将有助于揭示银杏叶黄酮的积累与GbCHS基因表达的分子机理。     

桃PpPGIP1 启动子的分离与功能分析

 通过染色体步移法分离桃[Prunus persica（L.）Batch]PpPGIP1 上游启动子序列,利用生物信息学方法对其功能进行初步预测;构建该启动子植物表达载体并通过农杆菌介导法转化烟草,研究不同激素诱导条件下GUS 蛋白瞬时表达情况;并利用实时荧光定量RT-PCR 技术分析了PpPGIP1 在水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）和1–氨基环丙烷–1–羧酸（ACC）诱导下的表达特性,获得了长度为1 018 bp 的桃PpPGIP1 启动子序列。该序列与梅和中国李PGIP 启动子序列的同源性分别为90%和89%;该启动子序列含有SA、MeJA、ABA 和ETH 诱导调控相关的抗病与胁迫顺式作用元件;ABA 和ACC 可以诱导PpPGIP1 启动子调控GUS 基因的表达;实时荧光定量RT-PCR 分析结果表明：SA、MeJA、ABA 和ACC 都可以诱导桃叶片中PpPGIP1 的表达。PpPGIP1 可能参与SA、MeJA、ABA 和ETH的信号转导,在桃抵抗病原菌和逆境胁迫方面起着非常重要的作用。     

激素和非生物胁迫对月季RhPIP1;1 启动子活性的调节作用

 通过反向PCR 方法克隆得到月季（Rosa hybrida L.）‘萨蔓莎’质膜型水孔蛋白基因RhPIP1;1 上游2 126 bp 的启动子序列。PLACE 分析发现，RhPIP1;1 启动子序列中含有GA、ABA 和乙烯等激素诱 导相关顺式作用元件及干旱、低温和盐胁迫等非生物胁迫相关顺式作用元件。在RhPIP1;1promoter：：GUS 转基因拟南芥中发现，RhPIP1;1 启动子活性与植株发育进程相关；几乎所有器官均可检测到GUS 表达， 而且在迅速扩展的器官以及叶片和花的维管组织中尤为强烈。同时在6 d 和9 d 苗龄的转基因植株中，GA 处理上调了莲座叶中RhPIP1;1 启动子的活性，而ABA、甘露醇、NaCl 和冷处理分别下调了莲座叶和根 中RhPIP1;1 启动子的活性。将RhPIP1;1 启动子不同长度的5′端缺失片段融合GUS 基因，并在烟草叶片 中瞬时表达，缺失–580 ~–256 之间的324 bp 片段后，启动子活性显著降低。研究结果表明RhPIP1;1 启 动子对多种激素和非生物胁迫存在响应，并且这种响应具有发育和器官特异性；RhPIP1;1 启动子中–580 ~ –256 区段对于启动子活性具有重要的作用。     

柑橘CsHB1启动子的克隆及功能分析

以‘伏令夏橙’叶片基因组DNA为模板,克隆了CsHB1启动子5′端转录起始位点上游分别为1 741 bp和1 613 bp的区域序列。序列分析表明这两个启动子区序列相似度为90.7%,存在141 bp的差异片段,该差异片段中含有2个Box4元件。通过PlantCare数据库对启动子序列的顺式作用元件进行预测,结果表明CsHB1的不同启动子序列含有多种响应元件,如胚乳特异性元件、分生组织表达元件、光反应元件、热应激反应元件、MYB结合位点等。为进一步分析CsHB1启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体prCsHB1::GUS,并用农杆菌介导法转化拟南芥,获得prCs HB1-1::GUS拟南芥纯合材料13株和prCs HB1-2::GUS拟南芥纯合材料10株。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色鉴定,结果表明两类启动子表达载体已成功转入拟南芥中并进行了表达,其表达部位主要集中于愈伤组织和花药中,而在种荚、叶片及幼苗中未检测到GUS蛋白的表达。     

龙眼miR408与DlLAC12克隆及其在球形胚发生和非生物胁迫下的表达分析

为探讨mi R408及靶基因DlLAC12在龙眼球形体细胞胚诱导及不同非生物胁迫下的表达模式,采用miR-RACE PCR和Tail-PCR克隆获得pri-miR408 cDNA和转录起始位点、dlo-miR408 gDNA、靶基因DlLAC12 cDNA及启动子pro-MIR408序列。研究结果显示：dlo-pri-miR408 cDNA、gDNA全长均为706 bp,5′端转录起始位点为胞嘧啶（C）。DlLAC12 cDNA全长为1 725 bp,pro-MIR408全长为1 532bp。pro-MIR408序列上存在ABA、GA3、JA等激素信号传导顺式作用元件和响应光、低温胁迫等相关元件。q RT-PCR结果显示,dlo-miR408-3p随外源添加的蔗糖浓度、Cu2+浓度及培养温度的变化呈现动态表达;而dlo-miR408-5p1对蔗糖不敏感,在铜离子失衡和低温时下调表达。dlo-miR408-3p与DlLAC12负调控模式能响应高浓度ABA（≥500μmol·L-1）处理,而不同浓度GA3处理下二者表达模式一致。dlo-miR408-3p与DlLAC12在球形胚诱导不同天数...     

蜡梅CpAGL6基因启动子的克隆及功能初步分析

利用hiTAIL-PCR法,从蜡梅（Chimonanthus praecox）基因组中克隆到花发育相关基因CpAGL6翻译起始位点上游1 266 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子序列中存在启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。为进一步分析CpAGL6启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用农杆菌介导法转化烟草。对转基因烟草进行GUS组织化学染色及GUS酶活性定量检测,结果显示,CpAGL6基因启动子能够驱动GUS基因在转基因烟草的叶、茎、花中表达,并且在不同花期表达强度存在差异,在根中几乎不表达。转基因植株经黑暗、赤霉素和4 ℃低温处理后,GUS酶活性均有所增加。结果表明,CpAGL6启动子主要驱动GUS报告基因在花器官和绿色器官组织中表达,推测其在抵抗非生物胁迫中具有重要作用。     

川乌头F3′5′H 基因的cDNA 克隆与表达分析

 利用RT-PCR 结合RACE 技术,从川乌头（Aconitum carmichaeli Debx.）花朵中克隆到1 个类黄酮–3′,5′–羟基化酶基因的cDNA 全长序列,全长1 720 bp,包含1 个编码506 个氨基酸的开放阅读框,命名为Ac-F3′5′H（GenBank 登录号：JN635708）。序列分析表明Ac-F3′5′H 编码的氨基酸序列中包含有已确定的保守基序,包括CYP 基序、I 螺旋区和血红素结合区等。氨基酸序列比对显示Ac-F3′5′H 与其它物种的F3′5′H 有很高的序列相似性。以川乌头18S rRNA 基因（FJ748878）为内参,通过半定量RT-PCR对Ac-F3′5′H 的时空表达模式进行了分析,结果显示Ac-F3′5′H 随花朵发育,表达量呈递增趋势,并且在正在开放的花朵中达到最高,而在根、茎、叶中不表达,推测该基因可能在调节川乌头蓝色花朵形成中发挥作用。     

番木瓜凝乳蛋白酶基因启动子的克隆及功能研究

 采用 PCR技术从番木瓜品种‘穗中红’克隆了木瓜凝乳蛋白酶基因的部分序列及其5'侧翼序列,构建含有两种长度启动子片段的植物表达载体,并用基因枪轰击番木瓜叶组织和农杆菌转化烟草叶盘。结果表明,克隆产物长719 bp,163 bp 3'侧翼序列与 GenBank中的番木瓜凝乳蛋白酶基因序列同源性为99%,556 bp的 5'侧翼序列有基础启动子区,转录起始位点位于ATG上游38bp的T。序列登录号为 AY803756。预测在启动子区存在 TATA-box、CAAT-box、WUN和HSE等顺式作用元件。两种启动子片段驱动的GUS基因瞬时表达和稳定表达结果表明,该启动子片段具有乳管特异表达活性。     

异源韧皮部特异启动子在转基因枳中的表达

为了筛选在柑橘韧皮部中特异表达的启动子,构建GRP、Rolc、RSSl异源韧皮部特异启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色分析表明,3个启动子均显示了维管束组织特异性。其中,GRP启动子活性强,且具有严格的韧皮部组织特异性;Rolc启动子活性最强,在根和茎中呈组成型表达;RSSl启动子活性最弱。Real-time RT-PCR和GUS酶活性分析进一步证明了GRP启动子具有较强的韧皮部组织特异性,该启动子有望应用于柑橘抗黄龙病基因工程育种。     

梨糖转运相关基因PbTMT4启动子克隆及功能分析

以‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri‘Dangshan Suli’)为材料,利用梨基因组数据库,通过PCR获得了糖转运相关基因PbTMT4(Pbr032130.1)2 211 bp的CDS序列及其编码起始位点上游长度为1 220 bp的启动子序列。使用农杆菌介导法将PbTMT4导入拟南芥,与野生型对照植株相比,转基因拟南芥植株的生长速度更快,抽薹、开花时间更早,叶片糖积累量更高。生物信息学分析表明,该启动子中含有多个与逆境应答、激素信号和光信号相关的顺式作用元件。为进一步分析PbTMT4启动子功能,构建了该启动子与GUS基因融合的植物表达载体并转化拟南芥。对T_3代转基因拟南芥各组织进行GUS活性染色和半定量分析,发现GUS基因在根、茎、叶、花和果荚中均有表达,NaCl、干旱、GA_3、MeJA以及光照处理均能一定程度上提高转基因拟南芥中GUS基因的转录水平。逆境处理发现,PbTMT4转基因株系较野生型植株受到的伤害小。研究结果初步表明,PbTMT4可促进转基因拟南芥发育并提高糖积累量,可能在抗非生物胁迫中起重要的调控作用。     

结球甘蓝春化相关基因VIN3反义植物表达载体构建及转化

以pBI121植物表达载体和BoVIN3-1基因片段为基础,构建结球甘蓝春化相关基因VIN3反义植物表达载体。将BoVIN3-1基因片段反向插入355启动子与GUS基因之间的限制性酶切位点XbaⅠ和SmaⅠ中,构建含反义BoVIN3-1基因的工程质粒pBI35S-BoVIN3-1。通过花蕾微量注射法转化结球甘蓝,获得9株转化植株。PCR检测结果表明,其中5株为阳性植株,阳性株率55.6%。经春化处理的转反义基因植株与对照相比,春化一定程度被推迟。半定量RT-PCR检测结果表明,转化植株在进行低温处理后仍有该基因少量表达,并随春化处理时间的延长转录水平升高,在第50天时表达量达到最高。     

菜薹BcAMT1;4启动子的克隆及活性分析

以菜薹(Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee)为材料,利用染色体步移法获得了铵转运蛋白基因BcAMT1;4的ATG上游长度为2 086 bp的启动子序列。生物信息分析表明,该启动子中包含多个光信号、激素信号、逆境应答、组织特异表达等顺式作用元件。构建该启动子与GUS基因的融合表达载体,并用农杆菌介导法转化拟南芥。通过对T3代转基因拟南芥植株GUS活性分析发现,GUS染色主要集中于叶片,而在根、茎、花中染色较浅。此外,不同氮源也影响BcAMT1;4启动子的活性,缺氮处理提高了转基因拟南芥GUS表达活性,而分别供0.25 mmol·L^-1 NO₃^-、NH₄⁺和NH₄NO₃的处理在一定程度上抑制其表达活性。研究结果表明,BcAMT1;4可能对菜薹叶片铵态氮营养具有重要调控作用。     

菠萝生长素极性运输载体基因AcPINs和AcAUXs的分离与表达分析

乙烯已经被广泛应用于菠萝人工催花,但其分子机制不是很清楚。以菠萝(Ananas comosus L.‘Perola’)茎尖为材料,采用RT-PCR结合RACE方法得到3个生长素极性运输输出载体基因(Ac PIN1、Ac PIN2和Ac PIN3)和2个生长素极性运输输入载体基因(Ac AUX1和Ac AUX2)的c DNA及基因组DNA全长。Ac PIN1、Ac PIN2、Ac PIN3、Ac AUX1和Ac AUX2的c DNA全长分别为2 690、2 388、2 057、2 156和1 580 bp,其开放读码框长度分别为1 854、1 917、1 530、1 479和1 392 bp,分别编码617、638、509、492和463个氨基酸;其基因组DNA全长分别为3 602、3 208、4 204、5 457和2 436 bp,从起始密码子到终止密码子的长度分别为3 244、2 780、3 947、5 264和2 321 bp。氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示Ac PINs和Ac AUXs分别属于植物PINs和AUX/LAXs家族。荧光定量PCR结果表明,菠萝茎尖经200和1 200 mg·L-1乙烯利诱导处理后,Ac PINs的表达上调较多,其中Ac PIN2在处理后的早期(1~2 d)和后期(28~37 d)显著上调,另外两个PIN家族基因Ac PIN1和Ac PIN3在处理后的大部分时间都明显提高。Ac AUX1的上调表达量相对较少,且相对表达量显著提高也主要集中在处理初期(1 d)和后期(28~37 d),而Ac AUX2的上调表达则只在处理后的前期(1、2、9 d)。研究结果表明,乙烯利诱导菠萝成花过程中,存在着生长素极性运输,且生长素极性输出在此过程中的作用可能更重要。     

杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因PbCBL2的克隆和功能初探

 类钙调磷酸酶B亚基蛋白（Calcineurin B-like protein,CBLs）是植物中一类重要的钙离子传感器,参与调控植物生长发育及逆境胁迫响应过程。为了探明杜梨CBLs家族成员PbCBL2的序列特征和表达模式,以杜梨（Pyrus betulaefolia Bunge）幼苗为试材,运用EST搜索结合RACE技术、染色体步移法对PbCBL2的cDNA、DNA和启动子进行克隆,采用半定量RT-PCR和原核表达研究该基因在非生物胁迫下的表达模式。结果表明,PbCBL2基因cDNA序列长681 bp,编码一个含有226个氨基酸残基的蛋白。基因组DNA序列长1 927 bp,包括8个外显子和7个内含子,启动子序列包含光反应元件、厌氧诱导必需顺式作用元件、赤霉素反应元件和水杨酸响应顺式作用元件。PbCBL2编码的多肽具有植物类钙调磷酸酶B亚基蛋白结合Ca²⁺所必需的4个EF手型结构和1个典型的植物钙调磷酸酶A亚基结合位点。未经处理的杜梨幼苗（对照）根和叶中未检测到PbCBL2的表达,PbCBL2的表达受NaCl、PEG6000、甘露醇和ABA诱导上调。PbCBL2转入大肠杆菌BL21（DE3）后,能够明显减轻NaCl、甘露醇和PEG6000对该菌株的生长抑制。PbCBL2基因具备植物CBLs基因家族的固有特征,对盐碱、干旱、渗透胁迫和ABA处理均存在转录响应,大肠杆菌转入该基因后能够提高对盐胁迫和渗透胁迫的耐受能力。