四川省猕猴桃病毒A外壳蛋白基因的序列分析、原核表达及抗血清制备

【目的】研究猕猴桃病毒A(Actinidia virus A,AcVA)的发生及其多样性,为我国猕猴桃产业中AcVA病毒的快速检测、科学防控以及猕猴桃品种选育提供科学依据。【方法】通过巢式PCR从四川省猕猴桃感病叶片中扩增AcVA CP基因序列,进行序列分析和同源性比对;构建AcVA CP基因的原核表达载体,诱导目的蛋白表达后制备抗血清,用Western blot检测效价。【结果】克隆到3个AcVA四川分离株的完整CP基因序列,成功构建了pET28a-AcVA-DJY4-CP重组质粒,原核表达目的蛋白并制备出特异性抗血清,效价达到1∶5 000。【结论】首次获得了3个AcVA四川分离株,丰富了AcVA的序列多样性,并探索了原核表达的最佳条件,制备了高效价抗血清,为今后AcVA病毒的快速检测和防控提供了技术支撑。     

辣椒脉斑驳病毒CP基因的原核表达及其抗血清的制备

采用RT-PCR方法克隆了辣椒脉斑驳病毒文昌分离物（ChiVMV-WC）的CP基因,并将其连接到原核表达载体pET-30b（+）上,克隆测序以确定其阅读编码框的正确性,然后将获得的重组质粒pET30b-ChiVMV CP转化大肠杆菌Rosetta（DE3）后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,获得的融合蛋白分子量约为38 kD。用Ni2+-NTA 琼脂糖亲和层析纯化的融合蛋白免疫兔子并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的ChiVMV-WC编码CP蛋白发生特异性反应。间接酶联免疫吸附法（ID-ELISA）检测抗血清效价为1/106。通过对田间20个样品的ID-ELISA检测,证实了所制备的抗血清与ChiVMV病叶具有良好的反应特异性。     

葡萄A病毒四川分离物的外壳蛋白基因克隆与原核表达

葡萄A病毒（Grapevine Virus A,GVA）是葡萄病毒属（Vitivirus）的典型种,在世界葡萄产区广泛分布。采集10株“藤稔”葡萄成熟枝条,使用6种葡萄病毒ELISA试剂盒检测发现10个样本中有6个感染4种不同的葡萄病毒。以GVA的ELISA阳性植株为材料进行RT-PCR扩增,首次获得了GVA四川分离物SL10的完整外壳蛋白基因（CP）。该基因全长597 bp,将其与GeneBank收录的15个GVA分离物的CP序列进行比对和构建系统进化树。把不同地理起源的GVA分离物分成2个变异组;其中Ⅰ组包括3个分离物(与Ⅱ组的其他分离物只有75.9%～80.1%的序列同一性);其余的13个分离物组成Ⅱ组（组内分离物具有84.4%～99.5%的序列同一性）。构建了GVA CP的原核表达质粒PET-30-GVAcp并转化BL21菌株,经IPTG诱导,目的基因得到了大量表达。     

利用原核表达的外壳蛋白制备草莓轻型黄边病毒抗血清

【目的】探索以原核表达的草莓轻型黄边病毒(SMYEV)外壳蛋白(CP)为抗原制备抗血清的方法,从而建立利用ELISA检测SMYEV的技术体系。【方法】利用IPTG诱导SMYEV CP重组蛋白在大肠杆菌中表达,分离纯化重组蛋白并以其为抗原对新西兰兔进行免疫。血清效价达到要求后,分离纯化抗血清并利用DAC-ELISA对草莓植株进行SMYEV检测,同时利用RT-PCR对DAC-ELISA检测结果进行验证。【结果】宿有SMYEV CP基因的大肠杆菌经IPTG诱导后出现一条52.0 ku左右的特异性重组蛋白谱带,以纯化的重组蛋白为抗原制备出专一性较强的针对SMYEV的抗血清,该抗血清稀释800倍后仍能有效检测草莓植株中的SMYEV。利用DAC-ELISA和RT-PCR对26份草莓试材分别进行SMYEV检测,2种检测方法的检测结果基本一致。【结论】以原核表达的SMYEV CP为抗原可以制备出专一性较强、效价较高的SMYEV的抗血清。     

苹果褪绿叶斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

【目的】为了制备苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的抗血清,【方法】将ACLSV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因克隆到原核表达载体pEHISTEV和pEHISEGFPTEV,转化大肠杆菌Rosetta,切胶回收诱导表达的CP融合蛋白免疫新西兰长耳兔,制备ACLSV的抗血清。【结果】利用原核表达载体pEHISTEV和pE-HISEGFPTEV在Rosetta中分别表达出了分子质量为25 ku和55 ku的ACLSV CP融合蛋白。切胶回收25 ku的融合蛋白免疫新西兰长耳兔。经ELISA测定,所制备的抗血清效价为1∶1 024,Western blot及组织印迹分析表明抗血清能与ACLSV CP发生特异性的免疫反应。【结论】该血清特异性强,效价高,可用于苹果叶片、果实和枝条等样品中A-CLSV的检测。     

香蕉线条病毒衣壳蛋白功能域基因的原核表达及抗血清制备

 制备香蕉线条病毒广东分离物（BSV-GD）的抗血清,可为BSV-GD 的快速检测和进一步研 究BSV 编码蛋白的功能提供条件。通过常规分子生物学方法,克隆了BSV-GD 衣壳蛋白（Coat protein, CP）功能域基因,构建了该基因的原核表达载体pET28b-CP,并诱导表达了大小约为46.5 kD 的融合蛋 白His-CP。可溶性分析表明该融合蛋白以包涵体形式存在。利用His 标签纯化试剂盒对目的蛋白进行纯 化、回收,获得了高纯度的融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫健康大耳白兔,成功制备了BSV-GD CP 功能域基因编码蛋白的兔抗血清。Western-blotting 分析表明该抗血清具有很强的特异性,间接ELISA 法检测抗血清效价达204 800 倍以上,对植物材料的合适检测浓度为1︰1 600 ~ 1︰6 400。     

番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因原核表达蛋白的抗血清制备及其检测应用

 以受番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus,PRSV）侵染的番木瓜（Carica papaya）叶片为供试材料,采用RT-PCR 方法克隆其外壳蛋白基因cp,并将其连接到原核表达载体pET-28b（+）上,酶切鉴定及克隆测序确定开放阅读框的正确性,将获得的重组质粒转化大肠杆菌表达宿主菌。通过摸索转化的表达宿主菌种类、IPTG 浓度及诱导时间,获得高效表达PRSV cp 的条件。SDS-PAGE 分析结果表明,CP 融合蛋白分子量为36.8 kD。以Ni2+-NTA 亲和层析柱纯化的融合蛋白为抗原,免疫注射新西兰大白兔制备得到高效价抗体,间接ELISA 测定效价为1︰16 384。Western blot 检测结果表明,制备的抗血清可与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应。通过ID-ELISA 检测田间样品证实了制备的抗血清与PRSV 侵染病叶发生了良好的特异性反应。本试验为PRSV 的快速检测以及PRSV 编码蛋白的功能研究奠定了基础。     

甘蔗黄叶病毒P0基因的克隆与原核表达及抗血清制备

根据已发表ScYLV-P0基因系列设计特异性引物,应用RT-PCR技术从甘蔗病叶的mRNA扩增得到目的DNA片段.以pET32a（＋）为原核表达载体,构建重组表达质粒pET32a-P0.经过双酶切鉴定和DNA测序后,将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21 （DE3）pLySs,在30℃培养条件下IPTG诱导表达.通过SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达情况.表达结果显示,在该表达系统中,融合表达蛋白P0是以包涵体形式的蛋白存在;P0融合蛋白大小约45kDa,与P0开放阅读框的理论推算值29.991 kDa加上载体自身蛋白约18 kDa相符,用Ni2＋-NTA琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白,免疫家兔制备出抗血清,通过酶联法（ID-ELISA）测定本实验制备的ScYLY-P0抗血清工作浓度为1：25000.     

温州蜜柑萎缩病毒小外壳蛋白基因克隆与原核表达及其抗体制备

 用RT-PCR方法,从采自重庆奉节的‘宫本’柑橘的2个样品中扩增出温州蜜柑萎缩病毒（Satsuma dwarf virus,SDV）SDV RNA2的3′末端,长度为975 bp,与报道的SDV S-58 3′末端序列同源性分别为98.7%和98.4%。根据获得的序列设计引物,以含有SDV FJ 3′末端序列的质粒为模板,PCR扩增获得大小为 654 bp的SDV-FJ小外壳蛋白（Small coat protein,CPS）基因产物。构建了CPS与GST融合表达载体PGEX-CPS,在37 ℃、1.0 mmol · L-1 IPTG条件下诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表明成功表达出分子量约为42 kD的GST-CP融合蛋白。以表达的融合蛋白为抗原免疫家兔,制备的抗血清的效价为1/12 800。用获得的抗体进行组织印迹分析表明,SDV在柑橘叶柄基部韧皮部维管束区域含量最高。     

马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因的原核表达及抗血清的制备

 利用RT-PCR扩增马铃薯卷叶病毒（PLRV）外壳蛋白（CP）基因（PLRV-CP）,回收大小约630 bp的特异性扩增片段并进行T-A克隆,测序表明该基因长度为627 bp,与已报道的36个PLRV-CP基因的核苷酸序列的同源性大于96%。以pBAD/Thio-TOPO为起始载体,构建了PLRV-CP基因的原核表达载体pBAD-LRCP。以pBAD-LRCP为模板,用PCR法删除了该基因富含精氨酸稀有密码子的第52 ~ 177核苷酸,获得了PLRV缺失突变CP基因的原核表达载体pBAD-LRCP-126。用阿拉伯糖诱导工程菌TOP10（pBAD-LRCP-126）,获得了34 kD的诱导表达的融合蛋白（重组CP）。用镍离子亲和层析法从包涵体中纯化出了高纯度的重组CP,用纯化的重组CP作抗原免疫家兔获得了PLRV特异性的抗血清,间接ELISA检测显示效价为1︰12 800。本研究结果为利用重组CP作抗原大量制备PLRV抗血清奠定了基础。     

落葵皱缩花叶病毒CP基因的原核表达及多克隆抗血清的制备

以感病紫茉莉叶片为材料,采用RT-PCR方法克隆落葵皱缩花叶病毒(Basella rugose mosaic virus,Ba RMV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因,并构建p ET30a-Ba RMV-cp原核表达载体。将原核表达载体转化大肠杆菌[Rosetta(DE3)Plys S],成功诱导表达得到大小约为40.0 k D的与预期大小相符的融合蛋白(His-CP)。SDS-PAGE电泳完毕后用0.25 mol·L~(-1)的KCl溶液染色,将目的蛋白切胶纯化后免疫新西兰大白兔,制备抗血清。间接酶联免疫吸附法(ID-ELISA)检测该抗体的效价为1︰16 000,Western-blotting分析表明该抗体具有很强的特异性。对野外感病紫茉莉和实验室内接种发病本氏烟检测结果也表明,所制备的抗体具有良好的特异性,可用于大规模样品检测。     

瓜类褪绿黄化病毒p22 基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

 以被瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV）侵染的甜瓜叶片为供试材 料,采用RT-PCR 方法克隆其P22 蛋白基因,并将其连接到原核表达载体pGex-4T-3 上,PCR 验证及克隆 测序确定开放阅读框的正确性。将重组载体pGexp22 转化大肠杆菌BL21 菌株,诱导表达,SDS-PAGE 分 析表明,经IPTG 诱导,p22 基因在大肠杆菌BL21 中得到了高效表达。以表达的蛋白作为抗原,免疫家 兔,制备了CCYV P22 的特异性抗血清。ACP-ELISA 检测结果表明,血清效价高达1.28 × 10⁵。Western blot 检测甜瓜叶片,结果表明抗血清能够特异性地检测CCYV 侵染的甜瓜叶片中的CCYV P22 蛋白。     

百合无症病毒16kD基因的克隆、原核表达及抗血清制备

以感染百合无症病毒(LSV)的百合叶片为试材,克隆LSV16 k D基因,连接到原核表达载体p ET-28a(+)上。将获得的重组质粒p ET-28a(+)+16 k D转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到了高效表达的16 k D蛋白,融合蛋白分子量约为20 k D。融合蛋白经过镍柱纯化后作为抗原免疫注射小鼠,制备得到16 k D蛋白抗血清。Western blot分析显示所制备的抗血清与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应;通过ELISA检测和RT-PCR检测百合样品,证实制备的抗血清与LSV侵染的百合叶片发生了相同的特异性反应。结果表明,目的蛋白表达成功,所制备的抗血清具有特异性,可用于LSV的快速检测、免疫组织化学以及16 k D蛋白功能研究。     

葡萄卷叶伴随3型病毒和葡萄A病毒的多重检测及其系统进化分析

 葡萄卷叶伴随3型病毒（Grapevine leafroll associated virus-3,GLRaV-3）和葡萄A病毒（Grapevine virus A,GVA）常常复合侵染部分主栽欧美杂交葡萄品种。以半定量RT-PCR与qRT-PCR方法研究了‘希姆劳特’葡萄（Vitis vinifera L. × V. labrusca L.‘Himrod’）中不同组织内病毒的相对积累量,结果表明叶脉和韧皮部内的病毒相对积累量显著高于其他组织。以成熟枝条韧皮部组织的cDNA为模板,优化了RT-PCR多重扩增体系,可以同时扩增待测样本中两种病毒的目标基因。从一株复合感染GLRaV-3与GVA的‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera L. × V. labrusca L.‘Fujiminori’）中,分别克隆了GLRaV-3外壳蛋白（coat protein,CP）基因全长序列和GVA部分基因组区域序列,后者包括CP基因的部分序列与病毒RNA沉默抑制子（viral suppressor of RNA silencing,VSR）基因全长序列。病毒核酸同源性分析与系统进化研究表明,不同GLRaV-3分离物的CP高度保守;而‘藤稔’葡萄的GVA分离物包含多种变异株,具有准种病毒的特点。