橄榄转录组SSR信息分析及分子标记开发与应用

选取不同品种（系）橄榄成熟果进行转录组测序,结果获得296 314条序列,应用MISA软件进行SSR位点分析,获得86084个SSR位点,分布在70686条序列中,SSR在所检测序列中出现频率为23.86%,其中54735条序列含有两个及以上的SSR位点,占比达68.4%;橄榄转录组中SSR序列以复合型核苷酸、单核苷酸、二核苷酸重复类型为主,三者占SSR总数的88.88%;单核苷酸、二核苷酸重复类型中优势基元分别为A/T、AG/CT/TC/GA。以6个不同橄榄品系（种）为研究对象,对随机挑选的99对SSR引物进行有效性与多态性筛选,最终开发了53个有效性SSR分子标记,12个多态性SSR分子标记。利用开发的12个多态性EST-SSR标记对59份橄榄种质进行多态性评价与群体结构分析,结果共检测到48个多态性位点,香农多样性指数平均0.876,多态信息含量平均0.426。利用混群模型分组、UPGMA聚类和PCA对59份橄榄种质进行群体结构分析,混群模型分析结果与UPGMA聚类结果、主成分分析结果有类群上的交叉,但类群数有所不同,混群模型将其划分为3个类群;UPGMA聚类分析在遗传相似系数为...     

刺梨转录组SSR信息分析及其分子标记开发

利用MISA软件筛选刺梨（Rosa roxburghii Tratt）转录组测序获得的106 590条Unigene,共检测出21 711个SSR位点,分布于18 155条Unigene中,出现频率为20.37%,平均分布距离为1.68 kb。优势重复基序为三核苷酸、四核苷酸和二核苷酸,分别占总SSR位点的26.87%、26.77%和24.93%。AG/CT与AAG/CTT分别是二核苷酸与三核苷酸的优势重复基元,分别占总SSR重复类型的17.80%和11.55%。以不同主导重复基元类型设计合成42对SSR引物,并以刺梨及其他蔷薇属种质的基因组DNA为模板对其有效性及通用性进行初步验证,筛选出具有清晰扩增产物的引物23对,并且均在同属材料中通用。选取16份贵州刺梨资源对筛选出的引物进行多态性检测,获得12对具有多态性的引物。以上结果表明,刺梨转录组测序产生的Unigene信息可作为开发SSR标记的有效来源,获得的大批量SSR标记可为刺梨及其近缘种的遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更加丰富可靠的标记选择。     

莲雾转录组SSR信息分析及其分子标记开发

对莲雾[Syzygium samarangense（Bl.）Merr. et Perry]开展转录组测序分析,共获得87 538条Unigene。利用MISA软件搜索1 kb以上的21 153条Unigene,共检测出11 641个SSR位点,分布于8 115条Unigene中,出现频率为55.03%,平均分布距离为4.08 kb。优势重复基序为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸,分别占总SSR的43.44%、30.98%和24.38%。二核苷酸重复基元中以AG/CT为优势重复基元,占总位点的26.99%,三核苷酸重复基元以CCG/CGG为主。利用Primer 3.0共设计出25 734对SSR引物。从94对有效扩增引物中随机选择35对引物,对30个莲雾种质进行多态性验证分析,其中25对（占71.43%）引物表现稳定可重复的多态性。利用UPGMA作图,将30份供试材料分为2类。利用莲雾转录组数据进行SSR标记开发能获得较高频率的SSR位点,且类型丰富,可为莲雾遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更丰富可靠的标记选择。     

基于SSR 标记的四川野生中国樱桃遗传多样性和居群遗传结构分析

 采用SSR 分子标记技术对四川野生中国樱桃5 个居群共133 株的遗传多样性水平及居群的 遗传结构进行了研究。结果显示：10 对SSR 引物共检测到78 个等位基因,平均每位点等位基因7.8 个。 Nei’s 基因多样性指数（H）为0.6112 ~ 0.6689,Shannon’s 信息指数（I）为1.1984 ~ 1.3786。基于分子方 差分析（AMOVA）,92.53%的变异来自居群内,7.47%的遗传变异来自于居群间。居群间遗传距离（GD < 0.2416）、遗传一致度（GI > 0.7854）、遗传分化指数（Fst = 0.0844）以及较强的基因流（Nm = 2.7125）均 表明居群间的遗传分化水平较低,居群内存在显著近交现象（Fis = 0.3986）,且居群在大多数位点上偏离 Hardy-Weinberg 平衡。基于上述结果,分析讨论了居群较高遗传多样性和居群间较低遗传分化形成的可能 原因,并提出野生中国樱桃的保护利用策略。     

油梨转录组SSR分子标记开发与种质资源亲缘关系分析

选取海南大学油梨种质资源圃的‘Fuerte’油梨花朵和小果进行转录组测序,获得18 010条序列,总长度为29 422 056 bp。利用MISA软件检索转录组测序数据,获得分布于4 687个序列中的6 312个SSR位点。经统计发现,SSR在所检测的序列中出现的频率为35.05%。分析SSR位点特征显示,所有类型的SSR平均长度为18.90 bp,SSR之间的平均距离为4.66 kb。‘Fuerte’油梨转录组中SSR序列以二核苷酸、三核苷酸重复类型为主,两者占SSR总数的87.15%。二、三、四核苷酸重复类型中优势基元分别为AG/CT、AAG/CTT、AAAT/ATTT。利用Primer 3.0对SSR序列设计引物13 398对。以32份油梨种质资源为研究对象,对随机挑选的100对SSR引物进行有效性验证,并用于对这些油梨种质进行亲缘关系分析。发现其中40对引物具良好多态性,共扩增出219条谱带,其中171条为多态性谱带。经计算,平均每对引物产生4.275个多态性片段。He和PIC均值分别为0.529和0.456。UPGMA聚类和PCA分析结果较一致,在系数设定为0.74时可将32...     

韭菜全长转录组SSR信息分析及分子标记开发

利用MISA软件筛选韭菜(Allium tuberosum)全长转录组测序获得的49 876条(大于500 bp)转录本序列(89.44 Mb),共检测出13 111个SSR位点,分布在10 332条转录本中,SSR出现频率为26.29%,平均分布距离为6.82 kb。在搜索的6种SSR位点类型中,1～3个核苷酸重复类型占主要地位,占总SSR位点数的98.74%,其中单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复类型分别为66.55%、12.52%、19.67%。发现重复序列的基序有103个,其中二核苷酸和三核苷酸重复类型中出现频率高的基序有AC/GT(2.54%)、CA/TG(2.29%)、GAA/TTC(1.85%)和AAG/CTT(1.60%)。重复序列的长度在10～289 bp之间,其中小于20 bp的有11 128个(84.88%),大于20 bp的有1 983个(15.12%)。根据这些SSR位点,共设计出3311对SSR引物,在随机选取的208对引物中有164对(78.85%)能进行有效扩增,其中39对引物在24份韭菜种质资源中表现出多态性。利用多态性引物SSR41,鉴定出‘马蔺韭’×...     

榧树转录组SSR信息分析及其分子标记开发北大核心CSCD

【目的】基于‘细榧’(Torreya grandis‘Xifei’)和‘圆榧’(T.grandis‘Dielsii’)种子转录组数据,开发SSR分子标记,为榧属植物遗传多样性研究奠定基础。【方法】利用MISA软件对筛选得到的1 kb以上的Unigene做SSR分析,利用Primer 3.0设计引物,随机选择49对引物进行多态性扩增。【结果】在22 976条评估数目中,包含SSR位点5 458个,共鉴定出6种类型的SSR。单核苷酸重复、三核苷酸重复和二核苷酸重复分别占SSR总数的64.9%、18.56%和14.77%。对5 458个SSR位点设计出4 633对SSR引物,随机选择49对在10份榧属植物中进行多态性扩增,其中16对引物表现出多态性,各个位点的等位基因数为2~6个,平均等位基因数3个,多态信息含量PIC、观测杂合度Ho、期望杂合度He的平均值分别是0.464 4、0.283 7和0.500 6。【结论】榧树转录组测序数据能够提供丰富的SSR位点,用于快速高效地开发SSR引物。所开发的引物能为榧树遗传多样性研究、品种指纹图谱构建和分子标记辅助选择育种提供标记选择。     

蓝靛果忍冬转录组SSR信息分析及其分子标记开发

利用MISA软件筛选蓝靛果忍冬（Lonicera caerulea L.）转录组测序获得的45 656条Unigene,共检测出14 841个SSR位点,分布于11 251条Unigene中,出现频率为32.51%,平均分布距离为2.58 kb。优势重复基序为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸,分别占总SSR位点的34.81%,42.79%和20.64%。二核苷酸重复基元中以AG/CT为优势重复基元,占总位点27.2%,三核苷酸重复基元以AAG/CTT为主,占6.18%。利用 Primer 3.0 共设计出 21 867 对SSR引物。随机选择20对引物进行PCR扩增,其中8对扩增出清晰可重复的条带,5对在16个蓝靛果忍冬材料中表现出多态性。利用UPGMA作图,将16份供试材料分为3类。丰富的SSR多态性为蓝靛果忍冬遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更加丰富可靠的标记选择。     

印度南瓜转录组SSR信息分析及其多态性研究

对印度南瓜（Cucurbita maxima）开展转录组测序分析,共获得131 960条unigene（90.80 Mb）,筛选得到12 557个SSR位点（占总unigene的9.52%）,其发生频率为1/7.4 kb;其中SSR位点中主导类型为二核苷酸重复,占总SSR的49.82%;其次是三核苷酸重复,其出现频率为45.31%。通过Primer5设计得到7 290对SSR引物,随机选择20对SSR引物对30种不同来源的南瓜进行多态性验证分析,结果显示在14对可扩增产物的SSR引物中,11对引物表现稳定可重复的多态性,UPGMA多态性分析显示11对引物可将30份南瓜材料分为5类。研究表明通过对南瓜转录组分析可获得较高频率的SSR位点且类型丰富,为印度南瓜遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了候选标记。     

中国樱桃14个自然居群遗传多样性和遗传结构的SSR评价

以中国樱桃14个自然居群280个个体为材料,采用SSR分子标记技术分析其遗传多样性和遗传结构。结果显示：11对SSR引物共检测到80个等位基因,各引物扩增条带在4 ~ 13条之间。基因多样性指数（h）为0.5431 ~ 0.7151,Shannon’s信息指数（I）为0.9057 ~ 1.4684。分子方差分析（AMOVA）表明,遗传变异主要来自居群内（70.00%）,Mantel检验显示总群体的遗传距离和地理距离显著相关（r = 0.472,P = 0.011)。因此,中国樱桃在居群水平（PPL = 100%,h = 0.643,I = 1.207）和物种水平（PPL = 100%,h = 0.743,I = 1.591）上均具有较高的遗传多样性。     

中国樱桃地方种质资源表型性状遗传多样性分析

以源自中国樱桃主产区7个群体,80份地方种质资源为试材,采用巢式方差及聚类分析法对其叶片、果实及果核26个表型性状进行多样性分析。结果表明:(1)质量性状之间存在较大的多样性差异,Shannon-Wiener多样性指数范围在0.61~1.64之间,其中果实形状、果皮颜色、叶片及果核剖面形状等表现出较高的遗传多样性。(2)数量性状无论是在群体间还是群体内均表现出极显著差异,14个数量性状的平均变异系数为9.93%,其中果柄长度的变异系数最高(24.80%),果核顶面观指数最低(6.61%)。在7个群体中,云南的种质材料变异系数最大,为12.92%;安徽的最小,为7.42%。(3)对14个数量性状的主成分分析表明,前5个主成分的累积贡献率达80.9434%,能反应数量性状的基本特征。(4)基于Nei’s遗传距离的聚类分析以及主坐标分析将80份材料分为2个大类,分布于山东、河南和安徽群体的种质资源聚为一类,为华北类群,分布于四川、云南、贵州和重庆群体的聚为另一类,为西南类群。研究结果表明不同地理分布群体的中国樱桃表型多样性存在差异,而这种遗传差异可能是由于来自不同的驯化位点而造成的。     

中国樱桃半野生种对樱的茎尖培养

 以中国樱桃半野生种对樱茎尖为外植体进行试管繁殖，最佳灭菌方法为二次灭菌(70％乙醇30 S→0.1％新洁尔灭15 min→0．1％升汞3 min)结合培养基添加抗生素羧苄西林二钠50 mg/L。 最佳培养条件：(1)初代培养基为F14+6-BA 0.5 mg/L+IBA0.2 mg/L+GA30.5 mg/L；(2)继代培养基为F14+6-BA0.5 mg/L+IAA 1.0 mg/L+GA30.5 mg/L，碳源采用白砂糖20 L+山梨糖醇5 g/L。同时研究表明，外植体种类、茎尖大小及抗氧化剂维生素c均影响茎尖初代培养成活率。     

不同产地中国李资源遗传多样性SSR分析

利用均匀分布在8个染色体连锁群上的16对SSR引物对来自3类产区的24份中国李品种的遗传多样性进行分析,结果表明：各引物的多态信息含量（PIC）在0.547 ~ 0.783间变化,其中引物CPSCT005最低,引物CPSCT022最高。不同引物间有效等位基因数（Ne）、Nei’s基因多样性（H）和Shannon’s指数（I）分析均存在显著差异,且均为引物CPSCT039最高,引物CPSCT031最低。3类产区所有引物分析表明,Nei’s基因多样性（H）、Shannon’s指数（I）和有效等位基因数（Ne）的关系是：南方品种和北方品种相差不大,均大于国外品种,且南方品种与国外品种先聚到一类。16对SSR引物总共扩出条带86条,其中多态性条带81条,多态性比率为94.19%,平均每对引物扩增位点5.38个。品种聚类分析表明,在遗传距离0.35处,24份中国李材料可分为2大类,大部分北方品种聚为一类,南方品种和国外品种聚为一类,从分子水平支持了以前提出的国外品种起源于中国的说法。     

草原樱桃和对樱杂交后代的分子鉴定

草原樱桃具有较强的抗寒、抗旱、抗病虫害性,而对樱是北京当地的中国樱桃品种。为了培育出适合北京及华北地区的抗逆性强的砧木,分别在2005年和2006年将草原樱桃和对樱杂交,共得到17个杂交后代。现采用SRAP技术验证了草原樱桃和对樱的17个杂交后代的杂种真实性。聚类分析结果表明:17个杂交后代的遗传基础更多的来自于草原樱桃。     

中国樱桃泰山干樱S-RNase基因的克隆及序列分析

以中国樱桃品种泰山干樱为试材,利用李属植物C2、C5保守区引物,扩增花柱S-RNase基因,获得4个S等位基因,测序结果表明序列大小分别为:1608、950、796、504bp。根据同源比较发现大小为796bp的等位基因与基因库中登录的S1-RNase为同一基因,其它3个S-RNase基因为首次报道,依序列大小分别命名为S2(1608bp,登陆号EF541168)、S4(950bp,登陆号EF541173)和S6(504bp,登陆号EF541172)。序列分析表明S2-RNase在C3区存在终止密码子,导致翻译提早终止;S4-RNase的C5区前有插入片断;S6-RNase在高变区比其它S等位基因少一个氨基酸残基。氨基酸序列同源性比较分析表明,中国樱桃S-RNase与樱花、扁桃的相似性高。在系统进化树中中国樱桃的4个S-RNase基因的氨基酸序列和樱花、扁桃、甜樱桃、酸樱桃等一起归于李亚科。     

普通杏品种SSR遗传多样性分析

利用来自杏、桃和扁桃的25对SSR多态性引物对66个普通杏品种进行了PCR扩增及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,共检测出284个等位位点,每对引物的等位位点数在3～17之间,平均为11.36。通过NTSYS软件计算得到的Dice相似性系数为0.083～0.987,平均值为0.370,表明中国普通杏种质资源的遗传多样性丰富。UPGMA法聚类将66份材料分为5个组。SSR标记反映出的品种间亲缘关系与根据地理生态类型对杏种质的分类结果基本一致。来自四川和贵州的多数品种独立聚成一组,表现出与其它品种较远的亲缘关系,该地区可能存在特异性较高的种质资源。证实了扁桃基因组SSR引物可用在杏SSR标记的研究中。     

甜樱桃SSR标记的选择性扩增微卫星( SAM) 法筛选

 以甜樱桃‘红灯’为试材, 应用选择性扩增微卫星( SAM) 法分离、克隆了100个SSR序列, 其中81个非重复, 可用。加上搜索数据库所获得的1个SSR序列, 一共82个序列用于特异引物的设计。仅从69个序列的77个基因座设计出特异引物。合成38对特异引物, 对其中的36个基因座进行检测。其中19对引物扩增出相应大小的片段, 另外8对引物扩增出非预期片段。最后, 以27个甜樱桃种质的基因组DNA为模板, 从27对可扩增出带的引物中, 筛选出多态性引物24对, 获得了24个甜樱桃基因座特异性SSR标记。     

基于万寿菊转录组测序的SSR标记开发

万寿菊（Tagetes erecta L.）花蕾转录组测序共获得48 953条Unigene,利用MISA软件检测出20 666个SSR位点,分布于13 849条Unigene中,出现频率为28.29%,平均分布距离为2.51 kb。优势重复基序为三核苷酸、四核苷酸,分别占总SSR位点的50.16%和20.94%。ATG/ATG和AAAC/GTTT分别是三核苷酸、四核苷酸的优势重复基元,占总SSR重复类型的13.82%和3.66%。随机选取不同主导重复基元类型并合成SSR引物36对,以20份万寿菊自交系的基因组DNA为模板,对引物有效性和多态性进行了验证,30对引物可以扩增到清晰稳定的目标条带,有效扩增率为80.56%;其中13对引物具有多态性,平均He和PIC分别为0.275和0.608。以上结果表明,万寿菊转录组测序产生的Unigene信息可作为开发SSR标记的有效来源,获得的大批量SSR标记可为万寿菊的遗传多样性分析和遗传图谱构建提供可靠的标记选择。