鹤望兰八氢番茄红素脱氢酶基因SrPDS 的克隆及表达分析

 采用RT-PCR和RACE方法从鹤望兰黄色花萼中克隆到类胡萝卜素合成途径关键基因SrPDS, 该 cDNA 全长2 069 bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1 746 个碱基,编码581 个氨基酸。氨基酸 同源性分析表明,SrPDS 推导的氨基酸序列与已报道的其他植物的PDS 蛋白具有很高的同源性。系统进 化树分析显示,鹤望兰SrPDS 与番红花首先聚为一类,其次与百合、水仙PDS 蛋白亲缘关系较近。应用 半定量PCR 分析表明,SrPDS 在黄色花萼和叶片中高表达,在蓝色花瓣和根中低表达;且在花发育的始 花期表达量最高,表明该基因在黄色花萼发育过程中起着重要作用。     

草莓八氢番茄红素脱氢酶基因pds的克隆及特征分析

 采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆到草莓类胡萝卜素合成途径中关键基因pds,该cDNA全长2 043 bp,具有一个1 704 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码568个氨基酸。序列分析表明,pds编码的氨基酸序列与其它植物的PDS蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,草莓PDS与杏的PDS蛋白亲缘关系比较近。原核表达结果表明pds基因在大肠杆菌中获得高效表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,pds基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达,表达量为红果＞粉红果＞白果＞花＞青果＞叶。     

芥蓝八氢番茄红素脱氢酶基因BaPDS1和BaPDS2的克隆与表达分析

以白花芥蓝为材料,采用反转录PCR技术克隆得到2个八氢番茄红素脱氢酶基因BaPDS1和BaPDS2,GenBank登录号为KX426039和KX426040,其开放阅读框分别为1 692和1 698 bp,分别编码563和565个氨基酸。同源性及进化树构建结果表明PDS蛋白在进化过程中比较保守,芥蓝PDS基因与甘蓝、白菜、花椰菜等十字花科蔬菜亲缘关系较近。半定量PCR分析发现,BaPDS1和BaPDS2表达水平在芥蓝不同发育时期和组织器官间均存在显著差异。萌动种子期BaPDSs表达量较低,之后迅速上升;BaPDS1在成熟期器官间呈现组成型表达,BaPDS2在器官间表达差异较大,幼果中未检出;花器官中萼片的BaPDSs表达量显著低于其他组织,在开花过程中,雄蕊和雌蕊的BaPDS1表达水平出现上调。     

枣甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆及表达分析

以‘金丝小枣’为试材,根据GAPDH基因保守序列设计引物,采用同源克隆和RT-PCR法,克隆枣GAPDH基因并进行生物信息学及转录表达分析。结果表明:该基因包含完整的开放阅读框为1 020bp,编码339个氨基酸残基,预测分子量为36.904kDa,理论等电点为8.53,命名为ZjGAPDH(KP147910);该蛋白包含2个保守结构域,即Gp_dh_N superfamily和Gp_dh_C superfamily;系统进化树分析表明,ZjGAPDH与其它物种GAPDH蛋白的同源性相对较小,但均属于存在细胞质中参与糖酵解过程的蛋白;实时荧光定量分析表明,ZjGAPDH基因在枣果实不同发育时期中表达有显著差异,在幼果期和全红期果实中的表达丰度较高。     

苹果细胞质型苹果酸脱氢酶的基因克隆、表达及酶活性分析

 根据亚细胞定位,苹果酸脱氢酶可分为5种类型,其中依赖于NAD的细胞质型苹果酸脱氢酶（cyMDH）在植物上的研究较少。从苹果果实中分离了cyMDH的全长cDNA序列, 命名为Mal-cyMDH（Genebank登录号为DQ221207）,该序列含有一个996 bp的ORF。序列同源性分析表明Mal-cyMDH与其他物种cyMDH有较高的同源性,进化树分析表明几乎所有的cyMDH可以聚类在一个分支上,并且cyMDH可能是MDH的最原始种。原核表达得到一个37 kD左右的融合蛋白,酶活测定表明该酶主要催化合成苹果酸。苹果果实中cyMDH酶活分析表明在高酸和低酸基因型中该酶的还原活性存在明显差异。     

香石竹水孔蛋白基因的克隆及表达分析

以香石竹(Dianthus caryophyllus)‘马斯特’为试验材料,在分析香石竹和石竹转录组数据的基础上克隆得到10个水孔蛋白(AQP)基因,7个属于PIP亚家族,3个属于TIP亚家族;其中DcaAQP1、DcaAQP2、DcaAQP3、DcaAQP4、DcaAQP6、DcaAQP8和DcaAQP10在萼片中优势表达,DcaAQP5在茎和花瓣中优势表达,DcaAQP7在叶中优势表达,DcaAQP9在各个组织中表达均比较低;在切花开放萎蔫过程中,DcaAQP1、DcaAQP3和DcaAQP6的表达量从花蕾期开始升高,半开期达到最高,DcaAQP4、DcaAQP7、DcaAQP9和DcaAQP10在盛开期表达量达到最高;DcaAQP2在花蕾期表达量最高,DcaAQP5在开始萎蔫期表达量达到最高,表明多个AQP基因协同作用来维持切花开放萎蔫过程中花瓣细胞水分吸收和营养物质转运。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

以‘丰香’草莓为试材,通过SON-PCR结合RT-PCR技术获得了1个冷诱导转录因子CBF/DREB家族基因编码区全长cDNA序列,命名为FaCBF1,GenBank登录号为FJ767754。该基因包含1个长为636 bp的完整开放阅读框,编码211个氨基酸,预测分子量为23.4 kD,等电点为6.53。氨基酸同源性分析表明,FaCBF1与GenBank中登录的蔷薇科植物CBF/DREB具有较高的同源性。进化树分析表明,草莓FaCBF1与近缘属的月季、苹果和沙梨处于同一进化枝上,而与李属植物进化关系较远。半定量RT-PCR分析显示,FaCBF1能被低温、干旱和高盐胁迫诱导,但对ABA诱导不敏感;在同一诱导时期在根中的表达量高于叶和茎中的表达量。     

延边苹果梨PyDFR基因的克隆及表达分析

以延边苹果梨果实为试材,采用同源克隆及实时荧光定量PCR的试验方法,研究PyDFR基因在果实着色过程中的表达特性及其与花青苷积累的关系。结果表明:PyDFR基因cDNA全长1 039bp,推断其含有1个843个核苷酸的开放阅读框(ORF),编码281个氨基酸,推导的蛋白分子量为32kDa,理论等电点pI为6.32。同源性分析表明,PyDFR基因与沙梨的(JQ749637.1)DFR基因的同源性高达99%;实时荧光定量PCR分析表明,PyDFR基因受到光诱导表达量迅速上升,去袋后1d即达到最大值,随后迅速下降,最终稳定在同一表达水平,与果实着色和花色苷含量测定的结果相对应,即PyDFR基因对果实花色素苷积累有一定的促进作用。     

枸杞酸性转化酶基因的克隆及组织表达分析

以"宁杞1号"枸杞为试材,通过RT-PCR及RACE技术进行枸杞酸性转化酶基因的克隆及组织表达分析,并运用MEGA 5.0软件对植物转化酶基因进行了系统树分析。结果表明:扩增获得2 193bp的枸杞酸性转化酶基因,命名为LbSAI(GenBank:KC776575),该基因推导氨基酸序列与马铃薯、番茄、梨等酸性转化酶基因氨基酸序列同源性为68%~100%;LbSAI编码的蛋白质属于液泡酸性转化酶;Real-time PCR表达分析显示,LbSAI基因在枸杞花中表达量最高,在根中表达水平较低。     

芋淀粉合成酶AGPase基因的克隆及表达分析

通过对‘靖江香沙芋’转录组数据进行功能注释,克隆获得‘靖江香沙芋’淀粉合成酶AGPase的基因,序列全长为1 596 bp,命名为CeApS1（NCBI：Colocasia KU288757,未公布）。该基因编码532个氨基酸,蛋白含有1个NTP_transf_3结构域（Gly¹⁰⁴ ~ Pro³⁰⁶）和1个PbH1结构域（Gly⁴⁷³ ~ Ser⁵¹⁵）,编码产生AGPase小亚基,等电点和分子量分别为6.73和57.6 kD。ApS1在单子叶和双子叶植物中广泛存在,CeApS1与紫萍（AIZ00992.1）中相应蛋白的亲缘关系最近,相似性为83.4%,与草莓（AAS00541.1）、苜蓿（XP_003617925.1）、水稻（AAK27313.1）和小麦（CAA46879.1）等植物中相应蛋白的亲缘关系较远。CeApS1在‘靖江香沙芋’的母芋和子孙芋中表达量较高,在叶片、叶柄和根中低表达。芋球茎中的CeApS1表达水平与球茎发育密切相关,在播种160 d后达到最大值。该基因的表达模式与球茎淀粉含量的积累显著正相关。     

茶树LEAFY基因的克隆和表达分析

以茶树（Camellia sinensis）大叶且无蕾不开花的突变体‘大叶龙’及其母株为材料,通过同源克隆结合RACE-PCR方法,克隆了LEAFY（LFY）同源基因的全长cDNA序列,两种序列分别命名为CsLFL1和CsLFL2,其cDNA全长分别为1 448和1 466 bp,各自包含1 191和1 197 bp的完整开放阅读框,编码396和398个氨基酸。它们与漆树科、无患子科以及壳斗目（山毛榉目）一些物种的LFY同源序列具有77% ~ 79%的一致性,具有植物LFY成员作为转录因子的脯氨酸富集区、亮氨酸重复、酸性和碱性结构域以及保守的C–端等典型结构特征。系统发育分析表明,它们属于双子叶植物LEAFY分支,并且亲缘关系最近,说明两者的形成是发生在茶树物种进化过程中较晚期的复制事件。两种序列在正常开花母株及‘大叶龙’中没有区别,在母株花芽中强烈表达,在母株和‘大叶龙’叶芽中有微弱表达。这些结果说明CsLFL1和CsLFL2代表了茶树中LFY的同源基因,并且可能参与茶树的成花启动过程。     

白姜花倍半萜合成酶基因的克隆及表达

以白姜花的叶片为材料,通过RT-PCR与RACE相结合的方法,克隆到一个倍半萜合成酶基因的cDNA序列,其全长为1 932 bp,基因编码区共1 653 bp,编码551个氨基酸,命名为Hc-Sesqui。该基因编码蛋白的氨基酸序列与姜和玉米中的倍半萜合成酶有较高的同源性,并且含有DDXXD保守序列。通过Clustal.X进行序列分析,确定该基因属于植物萜类合成酶基因家族中的Tps-a亚族。Northern杂交的结果表明,该基因在茎、叶和萼片中均有表达。     

蜡梅快速碱化因子基因CpRALF 的克隆及表达分析

 通过随机克隆测序的方法从蜡梅花cDNA文库中获得快速碱化因子基因,命名为CpRALF（GenBank登录号为：JQ217379）。扩增获得的DNA序列与cDNA序列一致,表明该基因不具有内含子,包含一个384 bp的最大开放阅读框,编码一个长127个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有快速碱化因子特有的YIXY、YXRGC和4个保守的半胱氨酸以及双精氨酸结构。实时荧光定量PCR分析表明该基因在蜡梅茎、根和盛开的全花中表达量较高;在花发育过程中,蕾期和衰败期表达丰度高。在对蜡梅幼苗进行高温、低温、高盐、重金属4种非生物胁迫处理后,通过实时荧光定量PCR对CpRALF在幼叶中的表达量进行分析,结果表明高温、高盐和重金属能够促进该基因表达,而低温则抑制该基因的表达,且CpRALF对高盐与重金属胁迫的响应比对高温和低温胁迫的响应更为显著和迅速,表明该基因可能在蜡梅花发育以及非生物胁迫反应响应方面发挥作用。     

核桃FRUITFULL(JrFUL)基因的克隆及表达分析

【目的】研究核桃JrFUL基因的序列特征及在核桃雌雄异熟开花机制中的作用。【方法】以核桃雌先型品种‘极早丰’及雄先型品种‘新早丰’的雌雄花芽为材料,外部形态测量确定不同品种核桃雌雄花芽形态分化差异。通过qRTPCR技术,分析核桃JrFUL、JrAP1、JrLFY及JrSOC1基因在两个核桃品种不同发育时期的雌、雄花芽中的表达模式。克隆核桃JrFUL基因CDS序列,对其结构进行分析。【结果】春季萌芽期后,2月26日雌、雄花芽的横、纵径逐渐开始出现显著差异。不同核桃品种同一时期的雌、雄花芽的几个基因表达量有所差异。克隆得到的核桃JrFUL基因CDS编码区的全长序列长度为747 bp,命名为JrFUL,编码248个氨基酸。NCBI数据库Blast比对表明核桃JrFUL基因与其他植物物种FUL同源基因的相似性较高。系统进化分析发现核桃JrFUL与连香树及葡萄的FUL亲缘关系最近。【结论】JrFUL基因可能在核桃开花进程中起到关键作用,可能对雄花的开放有促进作用。JrLFY与JrSOC1基因可能一定程度上促进核桃开花,JrAP1基因可能一定程度上抑制核桃开花。     

月季乙烯受体基因的全长克隆及原核表达分析

 利用已构建的月季花朵转录组数据库,筛选得到了22个与乙烯受体同源性较高的UniGene片段,并利用这些片段从月季花瓣中克隆得到了3个乙烯受体基因全长,分别为RhETR1、RhETR3和RhETR5。其中,RhETR1全长为2 814 bp,编码一个595 aa的肽链;RhETR3全长为2 468 bp,编码一个765 aa的肽链;RhETR5全长2740 bp,编码一个742 aa的肽链。这3个基因推定的编码蛋白分别与枣（Ziziphus jujuba）中的ZjETR1、杨树（Populus trichocarpa）中的PtETR2和砂梨（Pyrus pyrifolia）中的PpERS2同源性最高,依次为85.2%、75.8%和80.3%。蛋白同源性及结构分析表明,RhETR1和RhETR5分别与拟南芥中的ERS1和ETR1结构相似,属于第1亚家族成员,RhETR3与ERS2结构相似,属于第2亚家族成员。在花朵自然瓶插过程中,这3个基因分别表现为下调、上调和组成型表达。利用原核表达载体,选择和月季花朵开放最为相关的RhETR3,获得了和理论分子量一致的重组蛋白,表明克隆得到的RhETR3具有完整的读码框。     

牡丹病程相关蛋白1基因的克隆及表达分析

 以牡丹柱枝孢叶斑病病原菌Cylindrocladium canadense处理的牡丹‘鲁菏红’叶片为材料,根据已发表植物PR1的保守区域设计兼并引物,利用RT-PCR和RACE技术,获得病程相关蛋白1基因的cDNA,命名为PsPR1。该序列全长为744 bp,5′和3′非翻译区分别有42 bp和225 bp。该基因有477 bp的开放阅读框（ORF）,编码158个氨基酸,成熟蛋白分子量14.8 kD,等电点（pI）6.19,具有典型的SCP_PR1_like保守结构域。通过Blast比对发现该基因与多种植物病程相关蛋白1基因具有高度同源性。通过实时荧光定量PCR检测,发现该基因在牡丹萼片中相对表达量最高,在正常生长的叶片中最少。该基因受病原菌C. canadense和信号物质SA的显著诱导,分别在处理的24 h和12 h达到最高峰,说明PsPR1可能参与了牡丹的抗病防御过程。     

砂糖橘精氨酸脱羧酶CrADC基因的克隆及表达分析

【目的】克隆砂糖橘精氨酸脱羧酶基因（CrADC）,分析其在干旱胁迫下的表达模式,为探究CrADC基因调控多胺合成的抗旱分子机制提供理论参考。【方法】利用RT-PCR技术克隆砂糖橘CrADC基因,采用生物信息学进行蛋白序列及进化分析,利用qPCR检测不同组织和干旱胁迫下的基因相对表达量,并进行植物表达载体构建与烟草遗传转化验证。【结果】砂糖橘CrADC基因全长2262 bp,编码753个氨基酸,含有一个吡哆醛结合域。序列及进化分析显示果树ADC蛋白序列较保守且分为3类,起源于温带的苹果、李、枣、葡萄等8种落叶果树为一个进化分支,起源于热带或亚热带的柑橘、杧果、番木瓜等6种果树属于另一分支。qPCR实验表明,CrADC基因在砂糖橘叶、花、果肉和果皮组织均能表达,但不同时期叶片和果实不同部位的表达量差异显著,干旱胁迫24 h内的基因表达量会逐步上升。转基因实验表明,CrADC基因在烟草根、茎、叶组织中也能稳定表达,转基因系比对照烟草的电导率和丙二醛含量更低,过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性更高,表现出更好的抗旱生理特征。【结论】砂糖橘CrADC序列较保守,起源于亚热带或热带果树的进化分支。Cr...     

葡萄白粉病菌应答基因VpSTART的克隆及表达分析

 在前期获得葡萄白粉病菌应答基因VpSTART的EST基础上,采用RACE和RT-PCR技术克隆该基因cDNA全长序列。VpSTART全长1 321 bp,3′端非编码区114 bp,包含一个1 206 bp开放阅读框,编码401个氨基酸。VpSTART蛋白分子量为45.3 kD,与欧亚种葡萄、玉米、拟南芥、蒺藜状苜蓿和蓖麻的蛋白同源性分别为99%、64%、58%、46%和25%。实时荧光定量PCR表明,VpSTART在‘商–24’葡萄花序、卷须和茎中表达量较高;感白粉病的‘湖南–1’葡萄叶片接种白粉病菌后VpSTART表达量与对照没有显著差异,而抗白粉病的‘商–24’葡萄接种12 h后VpSTART表达量增加,在24 ~ 96 h表现显著性差异;用SA、MeJA和Eth等不同信号分子分别处理‘湖南–1’和‘商–24’葡萄叶片1 ~ 48 h后,VpSTART基因的表达受SA负调控,受MeJA和Eth正调控。     

梨PbChiⅡ基因的克隆及荧光定量表达分析

以鸭梨为试材,采用qRT-PCR技术克隆鸭梨果实几丁质酶基因PbChi Ⅱ,并对几丁质酶氨基酸序列进行聚类分析;同时采用荧光定量PCR的方法对鸭梨植株不同器官及水杨酸(salicylic acid,SA)和梨轮纹病菌(Botryosphaeria berengeriana de.Not.f.sp.piricola(Nose)Koganecawa et.Sokwwa)处理后几丁质酶基因的表达量进行了分析,以期为该基因的进一步研究与利用提供参考依据。结果表明:PbChi Ⅱ基因长度为969bp,核苷酸序列及推导的氨基酸序列与沙梨的同源性均达到100%,该基因属于第Ⅱ类几丁质酶基因;PbChi Ⅱ在根和果实中表达量较大。在鸭梨果实中,SA和病原菌可诱导该基因表达,且表达量在48h达到最高,初步推测PbChi Ⅱ可能参与SA介导的植物抗病防卫反应的信号通路及轮纹病菌引起的防卫反应。