蜡梅CpAGL6基因启动子的克隆及功能初步分析

利用hiTAIL-PCR法,从蜡梅（Chimonanthus praecox）基因组中克隆到花发育相关基因CpAGL6翻译起始位点上游1 266 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子序列中存在启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。为进一步分析CpAGL6启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用农杆菌介导法转化烟草。对转基因烟草进行GUS组织化学染色及GUS酶活性定量检测,结果显示,CpAGL6基因启动子能够驱动GUS基因在转基因烟草的叶、茎、花中表达,并且在不同花期表达强度存在差异,在根中几乎不表达。转基因植株经黑暗、赤霉素和4 ℃低温处理后,GUS酶活性均有所增加。结果表明,CpAGL6启动子主要驱动GUS报告基因在花器官和绿色器官组织中表达,推测其在抵抗非生物胁迫中具有重要作用。     

甜瓜CmACOⅠ启动子组织特异性表达研究

 为进一步明确甜瓜果实软化的分子机理,构建了ACC氧化酶Ⅰ基因（CmACOⅠ）启动子与GUS基因融合的植物表达载体,采用根癌农杆菌介导法转化甜瓜‘甘甜一号’。通过卡那霉素抗性和 PCR检测筛选呈阳性的转化植株,取不同组织进行X-Gluc染色。结果表明,转化植株的根、茎、叶、花、果实等器官组织经X-Gluc染色后,只在花药组织和成熟果果皮中出现蓝色斑点,其余组织均未检出,表明甜瓜CmACOⅠ启动子能够驱动GUS基因在转基因甜瓜花药和成熟果果皮中特异表达。     

激素和非生物胁迫对月季RhPIP1;1 启动子活性的调节作用

 通过反向PCR 方法克隆得到月季（Rosa hybrida L.）‘萨蔓莎’质膜型水孔蛋白基因RhPIP1;1 上游2 126 bp 的启动子序列。PLACE 分析发现，RhPIP1;1 启动子序列中含有GA、ABA 和乙烯等激素诱 导相关顺式作用元件及干旱、低温和盐胁迫等非生物胁迫相关顺式作用元件。在RhPIP1;1promoter：：GUS 转基因拟南芥中发现，RhPIP1;1 启动子活性与植株发育进程相关；几乎所有器官均可检测到GUS 表达， 而且在迅速扩展的器官以及叶片和花的维管组织中尤为强烈。同时在6 d 和9 d 苗龄的转基因植株中，GA 处理上调了莲座叶中RhPIP1;1 启动子的活性，而ABA、甘露醇、NaCl 和冷处理分别下调了莲座叶和根 中RhPIP1;1 启动子的活性。将RhPIP1;1 启动子不同长度的5′端缺失片段融合GUS 基因，并在烟草叶片 中瞬时表达，缺失–580 ~–256 之间的324 bp 片段后，启动子活性显著降低。研究结果表明RhPIP1;1 启 动子对多种激素和非生物胁迫存在响应，并且这种响应具有发育和器官特异性；RhPIP1;1 启动子中–580 ~ –256 区段对于启动子活性具有重要的作用。     

梨韧皮部特异表达启动子AtSUC2驱动下的GUS基因的转化和表达

 以 ‘Old Home’ 梨无菌苗叶片为外植体, 利用根癌农杆菌介导将专一在韧皮部表达启动子AtSUC2 驱动下的GUS 基因转入 ‘Old Home’中。筛选出了‘Old Home’ 梨叶片高效遗传转化的最佳条件：农杆菌和外植体在液体培养基上共培比在固体培养基上共培转化率提高5倍。 PCR分析和Southern 杂交鉴定表明GUS 基因已整合到转基因植株的基因组中,组织化学检测和Western 杂交鉴定证明了GUS 基因在转基因植株韧皮部中的表达。     

荔枝多酚氧化酶基因启动子克隆与功能分析

【目的】获得多酚氧化酶(PPO)基因启动子序列并初步分析其功能,为进一步研究PPO基因表达规律及应用PPO基因启动子提供基础。【方法】通过TAIL-PCR和接头PCR方法相结合获得荔枝PPO基因启动子序列并进行生物信息学分析,序列缺失结合瞬时表达法分析核心启动子调控元件。【结果】从‘妃子笑’荔枝基因组中克隆获得了1048bp的荔枝PPO基因启动子序列,含有多种顺式作用元件。不同长度的启动子序列均能驱动GUS基因在‘妃子笑’、‘无核’和‘紫娘喜’荔枝叶片和果皮中表达,但都不能驱动GUS基因在‘妃子笑’和‘紫娘喜’荔枝种子中表达。【结论】获得了荔枝PPO基因启动子序列并获得了其调控基因表达的部分规律。     

中国水仙NTMADS1基因表达分析及转化拟南芥研究

 利用RT-PCR技术分析了中国水仙（Narcissus tazetta var.chinensis）花器官特征基因NTMADS1在花期不同器官及花不同部位的表达模式。结果表明,该基因只在花器官中表达,且在雄蕊和副冠中的表达量高于雌蕊,在花瓣中未检测到该基因的表达。将该基因置于CaMV 35S启动子控制下,构建到载体pBI121的多克隆位点,获得了包含35S启动子、NTMADS1基因的编码区和NOS终止区域的植物表达载体。在农杆菌介导下将该基因转入模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中,获得了卷叶、花期提早和花型改变的转基因植株。     

山梨B-box基因PuBBX24表达特性及其在童期调控中的功能分析

为了解PuBBX24基因在梨生长发育过程中的功能,以山梨(Pyrus ussuriensis Maxim.)实生苗为试材,分离PuBBX24及其启动子序列,qRT-PCR分析PuBBX24在山梨根、茎、花、叶片以及果实中的表达特性,对启动子顺式作用元件进行预测,获得PuBBX24启动子驱动GUS基因表达的转基因拟南芥并进行不同组织、不同生长发育阶段,以及ABA、非生物胁迫和不同光处理下PuBBX24基因启动子活性分析,同时在拟南芥中异源表达PuBBX24并验证其功能。结果表明,PuBBX24在山梨根、茎、叶、花以及果实中均有表达,但在茎中表达量最高,叶片表达量最低,且在由童期向成年期发育的叶片中表达水平逐渐降低。PuBBX24上游启动子序列中包含一系列响应激素、光、胁迫等顺式作用元件。而PuBBX24启动子驱动的GUS基因主要在转基因拟南芥叶片、下胚轴以及萼片中表达,且在叶片中的表达水平随童期向成年期的发育而逐渐降低,在根中表达不均匀,在柱头和花柄中表达水平较低,在角果中未检测到GUS活性。PuBBX24启动子显著响应ABA、光、低温、渗透以及盐胁迫处理,且PuBBX24的过量表达影响了转基因拟南芥植株童期—成年期阶段转变进程。这些结果表明,山梨PuBBX24可能参与ABA、光以及胁迫响应,同时在童期—成年期阶段转变过程中起负调控作用。     

康乃馨ACC氧化酶反义基因遗传转化康乃馨的研究

 在建立康乃馨从愈伤组织到完整植株的高频再生体系的基础上，用花特异表达启动子驱动的康乃馨ACC氧化酶反义基因通过农杆菌介导法对康乃馨进行遗传转化，获得了3株转基因植株．经多重PCR及PCR-Southem杂交检测，证实康乃馨ACC氧化酶的反义基因已整合进康乃馨的基因组中。     

GhMADS3基因组成型表达对矮牵牛花形和花色的影响

 利用农杆菌介导法将GhMADS3基因转入矮牵牛。对14株转基因植株进行分析鉴定, GUS染 色表明外源基因在转基因植株中表达, PCR检测显示GhMADS3整合到矮牵牛的基因组中, RT-PCR分析表 明GhMADS3在转基因植株中表达。转基因植株花器官普遍较野生型小, 花萼膨大、顶尖向内弯翘, 花冠深 裂且边缘伴有不规则褶皱, 柱头裸露在外, 花器官颜色较野生型变淡甚至完全白化。测定花瓣、花萼中花 色素苷和花萼中叶绿素含量, 结果表明转基因植株均较对照偏低。说明GhMADS3的导入使得矮牵牛花形、 花色发生改变。     

欧洲葡萄VvMYB6正向调控花青素合成

从欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’中克隆到1个MYB转录因子基因VvMYB6。VvMYB6蛋白定位在细胞核,其N端包含1个保守的R2R3结构域。在葡萄中,VvMYB6主要在在根、花器官及果实发育早期表达。在烟草中异位表达VvMYB6,显著促进花瓣和雄蕊中花青素的积累;代谢组分析发现,相比野生型,转基因植株花中累积高含量的飞燕草色素和矢车菊色素。转基因烟草植株中查尔酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮4–还原酶(DFR)、花青素合酶(ANS)和UDP葡萄糖–类黄酮–O–葡萄糖基转移酶(UFGT)基因表达显著上调。结果表明VvMYB6正向调控花青素合成。     

山茶花CjAPL1基因正义表达载体的构建及对拟南芥的转化分析

 为研究山茶花CjAPL1基因对于重瓣花形成的作用,构建了pCAMBIA1300-CjAPL1正义植物表达载体,酶切结果显示,CjAPL1基因正向插入pCAMBIA1300的启动子和终止子之间,表明CjAPL1植物表达载体构建成功。将pCAMBIA1300-CjAPL1采用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,获得转基因阳性植株65株。随机挑选表型变异明显的3株进行PCR扩增都得到了目的条带,Southern杂交鉴定进一步确认为转基因阳性植株。同时荧光定量检测到在转基因植株中CjAPL1基因表现出较对照显著提高6 ~ 25倍的表达量。转基因阳性植株表型变异明显,花柱和雄蕊数相比野生型各增加1枚和1 ~ 4枚,萼片边缘发育成白色的瓣化状,表明在拟南芥中过量表达CjAPL1基因可以引起花器官形态的变异和数量的变化,因此该基因在花器官形成和重瓣花发育中具有显著的调控功能。     

苹果MdFT基因对番茄的遗传转化

 通过RT2PCR扩增, 从苹果叶片cDNA中克隆了^FT基因的同源基因^MdFT, 构建了花椰菜病毒35S启动子驱动的MdFT植物表达载体35S: : MdFT, 并利用根癌农杆菌介导法将其导入番茄栽培品种‘中蔬四号’; 同时转化拟南芥A tFT基因作为阳性对照。从添加卡那霉素的筛选培养基上再生了抗性植株,PCR扩增证明, 外源基因MdFT和AtFT已经整合到转基因番茄的基因组, 半定量RT-PCR则证明它们已经在转基因番茄中得到异位过量表达。形态鉴定发现, 转基因番茄植株比非转基因对照植株开花早, 表明成功地从苹果中克隆了成花素基因MdFT, 该基因具有通过转基因缩短苹果树童期的潜在价值。     

梨糖转运相关基因PbTMT4启动子克隆及功能分析

以‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri‘Dangshan Suli’)为材料,利用梨基因组数据库,通过PCR获得了糖转运相关基因PbTMT4(Pbr032130.1)2 211 bp的CDS序列及其编码起始位点上游长度为1 220 bp的启动子序列。使用农杆菌介导法将PbTMT4导入拟南芥,与野生型对照植株相比,转基因拟南芥植株的生长速度更快,抽薹、开花时间更早,叶片糖积累量更高。生物信息学分析表明,该启动子中含有多个与逆境应答、激素信号和光信号相关的顺式作用元件。为进一步分析PbTMT4启动子功能,构建了该启动子与GUS基因融合的植物表达载体并转化拟南芥。对T_3代转基因拟南芥各组织进行GUS活性染色和半定量分析,发现GUS基因在根、茎、叶、花和果荚中均有表达,NaCl、干旱、GA_3、MeJA以及光照处理均能一定程度上提高转基因拟南芥中GUS基因的转录水平。逆境处理发现,PbTMT4转基因株系较野生型植株受到的伤害小。研究结果初步表明,PbTMT4可促进转基因拟南芥发育并提高糖积累量,可能在抗非生物胁迫中起重要的调控作用。     

海南杜鹃热诱导基因RhRCA1启动子的克隆与功能分析

为了阐述RhRCA1基因的调控机制,以海南杜鹃(Rhododendron hainanense)3年生扦插苗为材料,分析RhRCA1高温响应和组织表达特性;并克隆获得RhRCA1的启动子序列,将该启动子分别驱动荧光素酶报告基因在烟草中瞬时表达、GUS报告基因在拟南芥中稳定表达,分析该启动子活性、组织特异性和热诱导性。结果显示:(1)25℃条件下,RhRCA1表达量极低,37℃处理后其表达量显著升高,呈现典型的热诱导特性,并且RhRCA1在绿色组织中的表达量显著高于非绿色组织,呈现组织特异性;(2)获得的启动子长1 624 bp,其含有多个非生物胁迫响应、光响应、组织特异性等相关元件;(3)构建RhRCA1启动子和萤光素酶融合的植物表达载体,在烟草叶片中瞬时表达,荧光成像结果表明RhRCA1启动子能强烈响应高温胁迫;(4)构建RhRCA1启动子和GUS融合的植物表达载体,转化拟南芥植株筛选至T3代,GUS染色结果显示,高温能显著诱导RhRCA1启动子在拟南芥子叶、成熟叶、茎、萼片、果荚等绿色组织中的表达。研究结果表明RhRCA1启动子是1个兼具高温诱导型和组织特异性的启动子,可应用于植物...     

柑橘CsTBL1启动子的克隆及其在转基因拟南芥中的活性分析

以奥林达夏橙[Citrus sinensis(L.)‘Olinda’]为材料,克隆了CsTBL1基因编码起始位点上游长度为2 361 bp的启动子序列。生物信息学预测表明,该启动子中含有多个与逆境应答相关的顺式作用元件。为进一步分析CsTBL1启动子的功能,构建了该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用浸花法转化拟南芥,对T3代转基因拟南芥进行GUS活性染色。结果显示,CsTBL1启动子在1～3 d龄幼苗所有组织中的活性都非常强,在7～20 d龄幼苗的子叶和根中的活性仍然较强,但在下胚轴中基本检测不到活性。在50 d龄幼苗中,只在叶、茎的毛状体以及还在生长的根中检测到GUS活性。转基因植株的GUS表达受到1–氨基环丙烷–1–羧酸(乙烯合成前体,ACC)、脱落酸(ABA)、甲基茉莉酸(MeJA)和水杨酸(SA)诱导。上述结果表明CsTBL1可能在植物发育和抗外界逆境胁迫中起到非常重要的作用。     

蓝猪耳启动子捕获系统的建立

为了分离基因启动子,构建了陷阱植物表达载体pHAHCA,用农杆菌介导的无启动子GUS方法转化蓝猪耳,经抗性筛选和PCR检测,获得82株转基因植株,转化率达12.5%.12株GUS染色呈阳性,其中10株GUS在叶脉表达,2株在茎和叶脉表达.对转基因植株进行盐胁迫处理,有1株根部出现GUS染色蓝色斑点.通过TAIL-PCR扩增和测序,获得5个T-DNA侧翼序列.     

AtGDPD-Like 6和AtGDPD-Like 7基因启动子表达特性及AtGDPD-Like 6蛋白定位

以野生型(Col-0)拟南芥为试材,采用RT-PCR法,研究AtGDPDL6和AtGDPDL7基因组织表达特性。以ProAtGDPDL6::GUS和ProAtGDPDL7::GUS转基因拟南芥为试材,采用GUS组织化学染色法,研究AtGDPDL6和AtGDPDL7基因启动子表达模式,并以Pro35S::AtGDPDL6-GFP转基因拟南芥为试材,采用激光共聚焦显微镜进行荧光观察,研究AtGDPDL6蛋白的细胞内定位。结果表明:AtGDPDL6基因在拟南芥花组织中特异表达;AtGDPDL7基因在花和角果中特异表达。AtGDPDL6和AtGDPDL7基因特异表达在拟南芥成熟的花粉囊和柱头中。AtGDPDL6蛋白定位于细胞膜和细胞壁区域。     

甜樱桃砧木PcMPK3基因启动子的克隆及对病原菌感染的响应

【目的】探明PcMPK3基因的表达调控规律。【方法】利用染色体步移技术从甜樱桃矮化砧木Gisela 6中克隆PcMPK3基因的启动子序列PcMPK3pro。利用Neural Network Promotor Prediction、softberry、PLACE和PlantCARE网站在线预测PcMPK3基因的基础启动子、转录起始位点和顺式作用元件。将PcMPK3pro定向替换植物表达载体pBI121-SN1的CaMV35S组成型启动子,构建重组表达载体pBI-PcMPK3pro:GUS,瞬时转化烟草叶片。【结果】结果表明,PcMPK3pro含有启动子核心元件TATA-box和CAAT-box等多种响应胁迫的顺式作用元件。受病原菌丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000,Pst DC3000)侵染,PcMPK3pro能驱动GUS报告基因表达且GUS酶活性显著提高。【结论】推测PcMPK3基因参与植物响应病原菌感染的胁迫过程。     

拟南芥抗病基因FLS2和LysM的亚克隆及其在番茄中的表达

 从拟南芥JAtYTAC基因组文库中完整地亚克隆了FLS2和LysM 两个抗病基因, 亚克隆的DNA 片段中分别包含各自的启动子、内含子和终止子。利用农杆菌介导的方法分别将这两个基因转化番茄品种‘Moneymaker’, 转基因植株经PCR 初步筛选后再分别提取总RNA 进行RT-PCR, 以验证其是否在‘Moneymaker’中表达。试验结果表明, FLS2和LysM 均能成功地在‘Moneymaker’中表达, 说明番茄的转录系统不仅能识别这两个抗病基因的启动子并起始转录, 还能正确识别并剪切这两个基因的外显子和内含子。据此推测, 拟南芥和番茄这两个远缘物种的转录机制存在相对保守的成份, 这为探索在这两个物种间R基因的功能及其下游信号通路的保守性提供了有价值的参考。     

异源表达拟南芥赤霉素2–氧化酶基因对矮牵牛形态发育的影响

拟南芥赤霉素2–氧化酶基因AtGA2ox1在矮牵牛（Petunia hybrida）中过量表达导致转基因植株开花延迟,株形明显矮化,花冠变小,花冠表皮细胞变小,但花色变化不明显。施用多效唑对矮牵牛花冠的影响与过量表达AtGA2ox1一致。用拟南芥茎特异性表达基因At3g56700的启动子驱动AtGA2ox1在矮牵牛中表达时,转基因植株的表型变化在株系间存在明显的差异,但外源基因在茎中的表达量都明显高于叶和花中的,果实和种子的发育未受影响,通过对转基因后代的筛选可以获得株形矮化,其它性状的发育受影响较小的转基因株系。