苹果6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶Md6PGDH6基因的功能鉴定

【目的】探究苹果6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶Md6PGDH6基因的性质及其生物学功能。【方法】利用PCR技术得到MDP0000235230(Md6PGDH6)基因的全长,进行相关生物信息学分析,利用qRT-PCR技术研究其时空表达模式,利用农杆菌介导的转化方法获得Md6PGDH6转基因‘王林’愈伤组织,以及异源表达Md6PGDH6基因的拟南芥和烟草。【结果】MDP0000235230基因与拟南芥AT4G29120.1(At6PGDH6)归为一类,将MDP0000235230命名为Md6PGDH6基因。Md6PGDH6基因包含一个942 bp开放阅读框。在线网站预测发现,Md6PGDH6蛋白整体表现为亲水性。启动子分析发现,其含有分生组织、激素响应、环境因子和非生物胁迫响应顺式作用元件。Md6PGDH6基因在茎、果皮、果肉和种子中表达量较高,在根、叶和花中表达量较低。Md6PGDH6基因促进‘王林’愈伤组织、拟南芥和烟草的生长。【结论】Md6PGDH6在果肉中表达量较高,Md6PGDH6基因有助于‘王林’愈伤组织的生长。     

苹果MdDRB1的表达与功能分析

以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica‘Royal Gala’)为试材,扩增Md DRB1基因,分析其序列结构,同时原核诱导Md DRB1蛋白并观察其亚细胞定位。利用q RT-PCR检测Md DRB1在非生物胁迫下的表达量,通过遗传转化苹果苗鉴定Md DRB1在非生物胁迫中的功能。基因结构分析显示,Md DRB1具有2个内含子和3个外显子。亚细胞定位显示,Md DRB1主要定位于细胞核,少数定位在细胞质。原核诱导结果显示,Md DRB1融合蛋白以包涵体的形式存在。同时发现Md DRB1反义转基因愈伤中与抗性相关的mi RNA的表达水平上调。在PEG、ABA、盐和低温处理的材料中Md DRB1的表达水平明显上调。另外,Md DRB1过量表达明显提高了转基因苹果组培苗的抗性。推测Md DRB1在抗逆胁迫响应中有重要作用。     

苹果黄酮醇合成酶基因MdFLS1的克隆、生物信息学分析及催化活性鉴定

【目的】在‘嘎拉’苹果中克隆黄酮醇合成酶基因Md FLS1全长,对其进行生物信息学分析,研究其表达特点和催化活性。【方法】利用RT-PCR和PCR克隆Md FLS1的全长,测序后运用多种生物信息学手段对其序列进行分析,运用q RT-PCR的方法研究其表达模式,原核诱导获得Md FLS1蛋白,并利用高效液相色谱鉴定其催化活性。【结果】苹果Md FLS1基因包含1 014 bp完整的开放阅读框,编码337个氨基酸,理论等电点为5.48,预测分子质量为38.12 ku。苹果Md FLS1基因定位于基因组8号染色体上,属于α-酮戊二酸依赖性双加酶家族。系统进化树分析表明,FLS在不同物种间具有高度的氨基酸序列保守性;其中,苹果Md FLS1与甜樱桃Pa FLS亲缘关系最近。苹果Md FLS1蛋白整体表现为亲水性,α-螺旋和不规则卷曲是其最大的结构元件。分析苹果Md FLS1氨基酸序列发现其不含信号肽和转运肽,没有跨膜结构域,预测其定位于细胞质中。分析Md FLS1的启动子区域发现含有激素信号、生物和非生物胁迫响应顺式作用元件。Md FLS1在苹果不同组织中都有表达,在叶中表达量最高,在茎中表达量较低。原核诱导并纯化了MdFLS1蛋白,鉴定了Md FLS1的催化活性。【结论】Md FLS1的表达明显受高盐胁迫、低温、干旱和ABA的诱导,并且具有催化活性。     

苹果MLP家族基因鉴定及非生物胁迫响应分析

在苹果中鉴定了13个Major Latex Protein(MLP)家族基因Md MLP。序列比对及构建蛋白同源模型发现,Md MLP蛋白含有Bet_v1典型的Gly-rich loop区域结构,且为MLP家族特有的Gxxxxx G结构。经多物种MLP系统发育及共线性比较分析,Md MLP与其他蔷薇科物种MLP具有相似基因结构和蛋白质保守结构域。q RT-PCR分析表明,Md MLP在‘新疆1号’苹果14个器官组织中均有不同程度的表达,对ABA、Na Cl、PEG、低温(4℃)和高温(40℃)有一定响应,且同一亚族基因表达情况呈现相似趋势。String构建蛋白互作网络发现,Md MLP可能通过与PRSP、SNRK1/2、b HLH等应激、ABA相关转录蛋白互作,参与苹果对非生物胁迫的防御。     

苹果MLP家族基因鉴定及非生物胁迫响应分析

在苹果中鉴定了13个Major Latex Protein(MLP)家族基因Md MLP。序列比对及构建蛋白同源模型发现,Md MLP蛋白含有Bet_v_1典型的Gly-rich loop区域结构,且为MLP家族特有的Gxxxxx G结构。经多物种MLP系统发育及共线性比较分析,Md MLP与其他蔷薇科物种MLP具有相似基因结构和蛋白质保守结构域。q RT-PCR分析表明,Md MLP在‘新疆1号’苹果14个器官组织中均有不同程度的表达,对ABA、Na Cl、PEG、低温(4℃)和高温(40℃)有一定响应,且同一亚族基因表达情况呈现相似趋势。String构建蛋白互作网络发现,Md MLP可能通过与PRSP、SNRK1/2、b HLH等应激、ABA相关转录蛋白互作,参与苹果对非生物胁迫的防御。     

苹果MdCBL家族基因表达分析及MdCBL1的功能鉴定

利用生物信息学的方法,对10个苹果MdCBLs家族蛋白的功能域进行预测,并与拟南芥AtCBLs家族的10个蛋白进行了系统进化分析,同时对苹果MdCBLs基因进行了系统的命名。利用qRT-PCR,检测了苹果MdCBLs基因在不同组织的表达及对非生物胁迫(包括盐、低温、ABA、干旱)的响应,结果表明,MdCBLs在苹果不同组织及非生物胁迫中起重要作用。另外,通过遗传转化苹果愈伤组织鉴定了MdCBL1在盐胁迫中的功能,MdCBL1过量表达明显提高了转基因愈伤组织的盐胁迫抗性。     

苹果Trihelix转录因子家族生物信息学鉴定与基因表达分析

利用生物信息学方法在苹果全基因组中鉴定了Trihelix转录因子基因,对基因结构、染色体的定位,以及其对应蛋白的理化性质、保守基序和进化关系等进行了分析;同时基于基因芯片表达数据和q RT-PCR分析,明确了苹果Trihelix在不同组织和逆境胁迫下的差异表达情况。通过分析,共鉴定得到了39个苹果Trihelix转录因子,其蛋白质的大小介于227～917 aa,分子量介于25.751～101.294 k D,等电点介于4.78～9.80。根据进化关系将其分为5个亚族,分别为GT-1、GT-2、GTγ、SIP1和SH4,亚族内部分成员的基因结构相似。基于MEME程序分析苹果Trihelix转录因子家族的保守基序与聚类分析结果具有较高的一致性。启动子上游1kb区域顺式作用元件分析表明Md Trihelix1、Md Trihelix19在CGTCA-motif上,Md Trihelix6、Md Trihelix13在ABRE上,Md Trihelix2、Md Trihelix7、Md Trihelix14和Md Trihelix16在GT1-motif上的响应均较高。基因芯片表达发现,Trihelix38、Trihelix14、Trihelix9和Trihelix11在花、果实、叶、茎、根、种子和幼苗中几乎不表达,其余35个基因在多种组织中均存在一定水平的表达,对花和果实表达上调的基因中除Trihelix36属于GT-1亚家族外,其余都属于GT-2亚家族和SIP1亚家族成员。通过q RT-PCR分析,检测到33个Md Trihelix在响应逆境胁迫应答方面表现出多样性。     

7个苹果KNOX转录因子基因克隆、表达和蛋白互作分析

【目的】KNOTTED1 like homeobox(KNOX)蛋白在植物生长发育等多个生物学过程中发挥着重要作用。以紫弘富士为材料，分离了多个苹果（Malus domestica）KONX基因，研究其结构域、进化分析、组织表达、非生物胁迫响应及其与MdOFP相互作用情况。【方法】使用RT-PCR技术克隆获得7个MdKNOX基因并进行生物信息学分析。利用Array技术检测MdKNOX基因在苹果不同组织中的表达模式。使用RT-qPCR技术检测MdKNOX基因在盐胁迫和渗透胁迫下的表达模式。通过Y2H实验检测了MdKNOX蛋白与MdOFP蛋白的互作情况。【结果】测序结果表明，获得了7个KNOX转录因子cDNA:MdKNOX1、MdKNOX2、MdKNOX5、MdKNOX10、MdKNOX13、MdKNOX16和MdKNOX22(GenBank登录号：MG021644～MG021650)。结构域分析表明，获得的7个MdKNOX蛋白序列均含有MEINOX、HD和ELK结构域。进化分析表明，MdKNOX1、MdKNOX2和MdKNOX5属于KNOXⅡ亚组；MdKNOX10、MdKNOX13、Md...     

苹果MdCYP707A家族基因表达分析和MdCYP707A1的功能鉴定

对苹果Md CYP707A家族4个成员的蛋白序列进行比对,并进行保守结构域分析发现,MdCYP707A家族成员都含有细胞色素P450单加氧酶结构域。利用荧光定量PCR检测其在苹果不同组织(根、茎、叶、花、果实、种子)中的表达,4个基因在种子中的表达量最高,并且在果实发育不同时期的表达量有明显差异。在苹果种子吸水膨胀和层积过程中的表达分析表明,MdCYP707A家族成员参与了种子萌发过程中ABA的降解。通过检测MdCYP707A基因对不同非生物胁迫(干旱、盐、渗透胁迫)和对ABA的响应,初步认为其在种子萌发中有重要作用,其中,MdCYP707A1对ABA的响应最为明显。另外,利用农杆菌介导的遗传转化的手段,鉴定了MdCYP707A1基因在苹果愈伤组织和拟南芥中的功能,过表达MdCYP707A1能够降低对非生物胁迫的抗性,说明其可能参与ABA的降解过程,同时在拟南芥中异源表达MdCYP707A1能够提高拟南芥种子的萌发率。     

过表达苹果多肽激素基因MdCEP1促进花青苷积累

以‘王林’苹果(Malus×domestica‘Orin’)愈伤组织为试材,初步探讨苹果多肽激素Md CEP1(C-TERMINALLY ENCODED PEPTIDE1)在调控花青苷合成方面的作用。分析显示Md CEP1位于苹果第15号染色体,只有1个外显子。蛋白序列比对显示不同物种中CEP结构域非常保守。启动子分析表明,Md CEP1启动子序列包含多个顺式作用元件,包括与分生组织有关的CAT-box元件、赤霉素响应元件(P-box)、光响应元件(MNF1)和与类黄酮合成相关的MYB类蛋白结合位点(MBSI)。通过农杆菌介导的遗传转化获得Md CEP1转基因苹果愈伤组织,进一步分析发现过表达Md CEP1能够明显促进愈伤组织花青苷积累,并且促进花青苷合成相关基因的表达。Md CEP1在拟南芥中异位表达,同样能够促进拟南芥中花青苷的积累,并且促进拟南芥花青苷合成相关基因的表达。研究结果表明,Md CEP1能够正调控苹果花青苷的合成。     

苹果己糖激酶基因MdHXK1的克隆与表达分析

从‘嘎啦’苹果中克隆了己糖激酶基因MdHXK1(基因序列号:MDP0000309677)全长,测序发现其包含长为1 497 bp完整的开放阅读框,编码499个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为54.05k D,等电点为5.76。系统进化树分析表明,HXK1在不同物种间具有高度的序列保守性;其中,苹果MdHXK1与中国白梨Pb HXK1亲缘关系最近。功能域分析表明,MdHXK1蛋白含有两个保守的激酶域。Southern blotting结果表明,MdHXK1在苹果基因组中有一个拷贝。亚细胞定位预测表明,MdHXK1主要定位于细胞质。分析MdHXK1基因启动子序列发现含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdHXK1在苹果的茎和花中表达量较高;在苹果果实发育期间,MdHXK1基因的表达、MdHXK1葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累水平都呈现先升高后降低的趋势,MdHXK1基因的表达明显受盐、低温和ABA的诱导。原核诱导并纯化了MdHXK1蛋白,为后续MdHXK1蛋白的功能鉴定奠定基础。     

6 - 磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6PGDH) 的克隆与甜瓜属异源四倍体的分子验证

 根据已发表的黄瓜6 - 磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase ) 基因6PGDH的cDNA序列(GenBank登录号: EU815934) 设计引物, 扩增了甜瓜属异源四倍体新种及野生种和栽培黄瓜‘北京截头’的6PGDH基因片段, 测序结果表明3个种的6PGDH基因片段序列表现出高度的一致性,长度均为1 098 bp包含936 bp编码311个氨基酸的阅读框和162 bp的3′非翻译区末端, 片段内无内含子存在。利用DNAMAN软件检测到异源四倍体新种与野生种和栽培黄瓜‘北京截头’氨基酸的差异位点有3个, 碱基差异位点有22个, 差异位点的遗传分布符合孟德尔遗传学定律, 从而在分子水平证实了异源四倍体新种是野生种和栽培黄瓜‘北京截头’的杂交后代。     

杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因PbCBL2的克隆和功能初探

 类钙调磷酸酶B亚基蛋白（Calcineurin B-like protein,CBLs）是植物中一类重要的钙离子传感器,参与调控植物生长发育及逆境胁迫响应过程。为了探明杜梨CBLs家族成员PbCBL2的序列特征和表达模式,以杜梨（Pyrus betulaefolia Bunge）幼苗为试材,运用EST搜索结合RACE技术、染色体步移法对PbCBL2的cDNA、DNA和启动子进行克隆,采用半定量RT-PCR和原核表达研究该基因在非生物胁迫下的表达模式。结果表明,PbCBL2基因cDNA序列长681 bp,编码一个含有226个氨基酸残基的蛋白。基因组DNA序列长1 927 bp,包括8个外显子和7个内含子,启动子序列包含光反应元件、厌氧诱导必需顺式作用元件、赤霉素反应元件和水杨酸响应顺式作用元件。PbCBL2编码的多肽具有植物类钙调磷酸酶B亚基蛋白结合Ca²⁺所必需的4个EF手型结构和1个典型的植物钙调磷酸酶A亚基结合位点。未经处理的杜梨幼苗（对照）根和叶中未检测到PbCBL2的表达,PbCBL2的表达受NaCl、PEG6000、甘露醇和ABA诱导上调。PbCBL2转入大肠杆菌BL21（DE3）后,能够明显减轻NaCl、甘露醇和PEG6000对该菌株的生长抑制。PbCBL2基因具备植物CBLs基因家族的固有特征,对盐碱、干旱、渗透胁迫和ABA处理均存在转录响应,大肠杆菌转入该基因后能够提高对盐胁迫和渗透胁迫的耐受能力。     

MdMYB73的分子克隆及其在苹果愈伤组织和拟南芥幼苗中的盐抗性功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个MYB转录因子基因(序列号:MDP0000894463)。该基因包含长为729 bp完整的开放阅读框,编码243个氨基酸,预测其蛋白质分子量为26.34 kD,等电点为9.29。系统进化树分析表明,这一MYB转录因子与拟南芥AtMYB73同源序列相似性最高,因此将其命名为MdMYB73。功能域分析表明,MdMYB73蛋白含有保守的R2R3-typeMYB绑定域。荧光定量PCR分析表明,MdMYB73在苹果的各个组织均有表达,在叶片和花中表达相对较高;MdMYB73的表达明显受盐胁迫的诱导。将异位表达MdMYB73的拟南芥幼苗进行抗盐鉴定,结果表明MdMYB73负调控拟南芥盐胁迫抗性;同时,AtSOS1,AtSOS3和AtNHX1抗盐相关基因的表达水平显著降低,表明MdMYB73可能负调控SOS反应,影响拟南芥抵抗高盐胁迫过程。将MdMYB73基因遗传转化苹果愈伤组织,抗盐表型分析表明,MdMYB73过量表达也明显降低了转基因愈伤组织对盐胁迫的抗性。     

柑橘转录因子基因CitMYB22的分离、表达及亚细胞定位分析

以‘资阳’香橙(Citrus junos‘Ziyang’)为材料,利用RT-PCR技术,分离到1个MYB基因,CitMYB22。比对分析发现,CitMYB22含有两个内含子,开放阅读框(ORF)为696 bp,可编码231个氨基酸残基的多肽。氨基酸聚类和结构分析表明,CitMYB22属于MYB类转录因子家族中的R2R3-MYB亚家族。进化树分析表明,CitMYB22与拟南芥参与逆境响应的R2R3-MYB亚家族成员At MYB15的同源性最高。克隆CitMYB22的ATG上游2 500 bp内启动子顺式元件,预测其含有多个与植物逆境和激素应答相关的顺式作用元件,如HSE、SARE和MBS等。亚细胞定位结果显示CitMYB22蛋白定位在细胞核中。实时定量结果表明,CitMYB22在叶、花中的表达量明显高于根和幼果,且在外源脱落酸、水杨酸、甲基茉莉酸、1–氨基环丙烷基羧酸以及高盐、脱水和4℃低温等非生物逆境胁迫下,均被诱导上调表达,推测CitMYB22可能与‘资阳’香橙的抗逆性相关。     

森林草莓6mA甲基转移酶基因鉴定及功能分析

通过生物信息学手段，鉴定出森林草莓（Fragaria vesca）基因组中两类可能的6mA甲基转移酶基因5个（3个MT-A70、2个DAMT基因）。对细菌、真菌、动物和植物中的6mA甲基转移酶基因的系统进化分析及染色体定位表明，森林草莓MT-A70基因可分为3个亚家族，且在动、植物分化前就已经存在：两个DAMT基因由物种特异的串联重复产生，且结构变化快，推测其在进化历程中功能发生了分化。转录组数据及实时定量荧光PCR分析显示，各个基因均具有时空表达特异性和非生物胁迫响应。其中1个DAMT基因表达量在果实中较高且随果实成熟上调，推测可能参与调控果实成熟。此外，这5个基因在冷胁迫下表达水平有不同程度下调：而在热胁迫下各基因表达量变化显著不同。由此推测6mA甲基转移酶基因可能参与了森林草莓的生长发育和对冷、热胁迫的响应。     

蜡梅CpAGL6基因启动子的克隆及功能初步分析

利用hiTAIL-PCR法,从蜡梅（Chimonanthus praecox）基因组中克隆到花发育相关基因CpAGL6翻译起始位点上游1 266 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子序列中存在启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。为进一步分析CpAGL6启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用农杆菌介导法转化烟草。对转基因烟草进行GUS组织化学染色及GUS酶活性定量检测,结果显示,CpAGL6基因启动子能够驱动GUS基因在转基因烟草的叶、茎、花中表达,并且在不同花期表达强度存在差异,在根中几乎不表达。转基因植株经黑暗、赤霉素和4 ℃低温处理后,GUS酶活性均有所增加。结果表明,CpAGL6启动子主要驱动GUS报告基因在花器官和绿色器官组织中表达,推测其在抵抗非生物胁迫中具有重要作用。     

垂丝海棠MhMYB114-Like的克隆及其在苹果愈伤组织中的抗缺铁功能鉴定

从苹果砧木垂丝海棠(Malus halliana Koehne)中克隆得到了MhMYB114-Like基因(序列号:LOC103405832).该基因包含全长为602 bp的完整开放阅读框,编码200个氨基酸,蛋白质等电点为9.38.系统进化树分析表明,MhMYB114-Like与野草莓该家族蛋白亲缘关系最近.分析Mh...     

苹果MdNAC143的克隆及其在苹果愈伤组织的抗盐功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个NAC转录因子基因MdNAC143(序列号:MDP0000334047),其开放阅读框为924 bp,编码308个氨基酸,预测蛋白质的分子量为35.59 k D,等电点为6.32。结构域分析表明,MdNAC143蛋白N端含有保守的NAC结构域。酵母双杂交结果表明MdNAC143的全长及C端具有转录激活活性。荧光定量PCR分析表明,MdNAC143在苹果的各个组织均有表达,其中在叶片和花中表达相对较高;MdNAC143的表达明显受盐胁迫的诱导。将MdNAC143遗传转化‘王林’苹果愈伤组织,进行抗盐表型鉴定后发现,MdNAC143在愈伤组织中过量表达后能明显提高对盐胁迫的抗性。