苹果MdGLRs家族基因生物信息学鉴定和表达分析

 利用生物信息学策略对苹果MdGLRs家族基因编码蛋白的氨基酸序列的基本特征、二级结构、跨膜区域、亲疏水性、基因亚细胞定位及保守结构域进行了预测和分析,与拟南芥AtGLRs家族的20个基因进行了氨基酸序列比对和进化树分析,并对这些基因在不同营养生长器官中进行了表达分析。结果表明,苹果MdGLRs家族包含32个基因,分为3个亚族,大部分基因编码800个氨基酸以上,多含有3个跨膜区域,二级结构主要以α–螺旋、无规则卷曲、折叠延伸链为主;亚细胞定位预测发现,MdGLRs蛋白主要定位在内质网和质膜上;MdGLRs蛋白的保守结构域是S1-M1-M2-M3-S2-M4;大多数基因在根、茎、叶中普遍都有表达,在叶中的表达量最高。     

结缕草转录因子基因ZjDREB1.2的克隆及胁迫下的表达分析

结缕草是一类多耐逆暖季型草坪草,但不耐低温。以日本结缕草‘Meyer’‘胶东青’和沟叶结缕草‘马尼拉’为材料,克隆获得了结缕草(Zoysia)一个新的DREB类转录因子基因,命名为ZjDREB1.2(GenBank登录号:KP696367.1)。结果表明:该基因开放阅读框长702bp,推测编码的蛋白质含233个氨基酸,平均分子量为25.2KDa,理论等电点为4.91。保守结构域预测显示ZjDREB1.2蛋白含有一个不完整的AP2结构域,结构域的上、下游均具有DREB1亚组特异性序列。系统进化树分析结果显示ZjDREB1.2蛋白属于DREB家族A-1亚组,与C4植物的同源基因遗传距离较近。在日本结缕草‘Meyer’中,ZjDREB1.2基因在低温、高盐和干旱胁迫2~12h内均上调表达,其中受低温诱导上调幅度最大。与沟叶结缕草‘马尼拉’相比较,低温胁迫72h后日本结缕草中ZjDREB1.2的表达量相对较高。酵母单杂交结果显示,ZjDREB1.2蛋白具有强的转录激活功能,但不表现出与DRE元件结合功能。暖季型植物中这种AP2结构域不完整DREB1基因的进化机制及功能值得研究。     

苹果细胞分裂素响应因子基因MdCRF4的分离与功能鉴定

以‘嘎拉’苹果(Malus × domestica‘Royal Gala’)为研究材料,利用同源克隆和PCR技术,分离了苹果细胞分裂素响应因子(cytokinin response factor)基因MdCRF4。该基因开放阅读框(ORF)为1077 bp,编码含有358个氨基酸的蛋白。保守结构域和系统进化树分析显示,MdCRF4蛋白包含一个保守的CRF结构域和一个保守的AP2/ERF结构域,与梨PbCRF4同源性最高。基因表达分析显示,该基因主要在苹果根和叶中表达并且响应细胞分裂素。EMSA试验显示MdCRF4原核表达蛋白能够绑定DRE(ACCGAC)序列。在‘王林’苹果愈伤组织中超表达MdCRF4,其花青苷积累显著增加,表明MdCRF4在调控花青苷积累中发挥重要作用。     

大蒜MADS-box基因AsPI的克隆及表达分析

B类MADS-box基因在调控显花植物的花瓣和雄蕊发育过程中发挥关键作用。为初步了解大蒜花发育的分子机制,以‘阿城紫皮’大蒜(Allium sativum)的花蕾为试材克隆了AsPI(Gen Bank登录号为KY272748)。AsPI的cDNA长939 bp,开放阅读框为615 bp,编码204个氨基酸。推导的氨基酸序列显示,AsPI编码的蛋白质包含高度保守的MADS结构域(1~57氨基酸)和保守的K结构(76~140氨基酸),AsPI蛋白具有PI亚家族特有的序列特征:MADS区特征丝氨酸残基、K区高度保守序列KHExL以及C–末端的PI基序。序列比对、功能域分析及系统发育分析结果表明,AsPI属于单子叶植物B功能基因PI亚家族。半定量和实时RT-PCR检测AsPI在大蒜不同组织器官中的表达模式,结果表明,在花蕾中高丰度表达,在花茎中表达量中等,在根、假茎、嫩叶、保护叶等营养器官中表达量极低甚至不表达。     

桂花C4H基因的克隆与表达特性分析

利用转录组测序获得的表达序列信息,结合RACE技术,从桂花（Osmanthus fragrans）花瓣中克隆到两个参与苯丙烷代谢第2步反应的肉桂酸–4–羟基化酶（C4H）基因。其ORF全长分别为1 518 bp和1 611 bp,各自编码505和536个氨基酸,命名为OfC4H1和OfC4H2（登录号分别为KR861466、KF254842）。系统进化树表明,OfC4H1与矮牵牛中的PhC4H1、PhC4H2等C4H蛋白聚为一类,属于Class Ⅰ类型;OfC4H2与金银花中的LjC4H等属于ClassⅡ类型。进一步的C4H蛋白序列多重比较发现,OfC4H1和OfC4H2蛋白具有该基因家族特有的保守结构域,在这些保守结构域中存在区别两类C4H蛋白的典型特征。利用Real-time PCR比较分析了OfC4H1和OfC4H2基因的时空表达模式,结果显示,OfC4H1在花瓣中的表达量最高;OfC4H2在花瓣中的表达量较低,在花梗、雌蕊和幼叶等组织中表达量较高。构建原核表达载体pET6xHN-C4Hs,转化Transetta（DE3）大肠杆菌并诱导表达的结果表明,目的蛋白能在原核表达系统中顺利表达,而且与预期大小一致,但因溶解度较低无法进行酶活性分析。     

薄壳山核桃MADS-box基因CiMADS9的克隆与功能分析

以薄壳山核桃（Carya illinoinensis）‘马罕’雄花为材料,利用获得的MADS-box基因保守片段设计特异引物,通过RACE技术克隆MADS-box家族基因的cDNA序列,命名为CiMADS9。该基因长为1 077 bp,开放阅读框（ORF）768 bp,编码255个氨基酸残基。生物信息学分析表明该基因具有典型的MADS-box结构域和半保守的K区,是MIKC型MADS-box基因。聚类分析分析表明该基因属于AGL15亚家族。实时荧光定量PCR结果表明,CiMADS9在生殖器官（雄花、雌花、幼果）中的表达量高于营养器官（叶、枝条）中的,并且在雄花中的表达量最大。将目的基因通过农杆菌介导法转化拟南芥,获得了转基因植株。与对照相比,转基因拟南芥中过量表达该基因使植株开花延期,基生叶增加。     

广叶绣球菌DASH型隐花色素同源基因Slcry1的序列与表达分析

用关键词"DNA photolyase (pfam 00875)"和"FAD binding domain of DNA photolyase (pfam03441)"搜索广叶绣球菌(Sparassis latifolia)闽绣1号菌株基因组,找到一个候选基因——隐花色素同源基因Slcry1,PCR扩增得到该同源基因cDNA全长1755 bp,基因组全长为2279 bp;利用PROTPARAM预测SlCRY1蛋白含有584个氨基酸,相对分子质量为65800,等电点为8.94;利用SMART和Pfam预测其保守结构域,发现SlCRY1蛋白(584个氨基酸)包含一个DNA光解酶(DNA Photolyase)结构域和一个FAD结合(FAD binding)结构域;用MEGA7软件中的邻位相连法构建系统发育树,发现SlCRY1属于光解酶/隐花色素蛋白家族中的DASH(Drosophila,Arabidopsis,Synechocystis,and Homo species)型隐花色素;最后用荧光定量PCR检测该同源基因在广叶绣球菌不同发育阶段及光照处理下的表达量:在约300 lx白色LED光照下,基因Slcry1表达量随光照时间延长而增加;不同发育时期,Slcry1基因的表达水平为子实体原基菌丝。实验结果揭示:SlCRY1属于DASH型隐花色素,其表达量受到光照的诱导,且随广叶绣球菌的生长发育而上升。     

萝卜RsCYP86MF 基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

 本研究通过设计保守的基因特异引物, 运用SMART RACE RT - PCR技术从‘圆白’萝卜中获得一个细胞色素P450基因, 命名为RsCYP86M F, 其cDNA全长1818 bp, 含有1581 bp的完整开放阅读框, 编码526个氨基酸, 该基因编码的蛋白序列与白菜的细胞色素P450基因编码的氨基酸序列同源性高达90% , 且有很高的功能区段保守性; 对其可能编码的蛋白质二级结构进行预测发现, 该蛋白质具有细胞色素P450典型的保守结构域FNAGPRLCIG, 及N - 糖基化位点等结构域。     

岷江百合蛋白激酶基因lilyABC1的克隆及在非生物胁迫下的表达特性分析

以野生型岷江百合（Lilium regale Wilson）为材料,克隆岷江百合蛋白激酶基因lilyABC1,分析其在非生物胁迫下的表达特性,为百合抗逆育种提供候选基因。结果表明：lilyABC1基因全长cDNA序列为2 333 bp,其开放阅读框（ORF）为2 007 bp。该基因编码668个氨基酸,预测lilyABC1蛋白分子量为74.84 kD,等电点为5.46,含有一个高度保守的结构域--STYKc。lilyABC1基因在岷江百合的叶片、鳞片、花蕾组织中均有表达,表达量依次为叶 > 花蕾 > 鳞片,其中不同时期的花蕾中的表达量基本一致。lilyABC1的表达受到NaCl、低温、高温以及黑暗胁迫的诱导,对PEG-6000的模拟干旱处理不敏感,表明lilyABC1基因可能对岷江百合适应高盐、低温和黑暗等非生物胁迫具有一定作用。     

三褶虾脊兰CtARF57和CtIAA12基因克隆及功能分析

以三褶虾脊兰(Calanthe triplicata)不同发育时期的花瓣距为试材，基于转录组测序数据，通过克隆获得生长素信号转导途径中CtARF57和CtIAA12基因全长序列，并进行生物信息学分析，探究园林花卉三褶虾脊兰生长素相关响应因子(ARF和Aux/IAA)的表达特性及功能，以期揭示三褶虾脊兰花瓣距的发育机理。结果表明：cDNA全长为3 054 bp和1 124 bp,分别编码911、177个氨基酸。2个基因氨基酸序列与铁皮石斛同源基因的相似性较高，均超过84%。保守结构域分析表明CtARF57蛋白具有B3结构域、Auxin＿resp结构域和Aux/IAA结构域；CtIAA12具有Aux/IAA蛋白的DomainⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ特异性结构域。实时荧光定量PCR结果显示，其转录水平受到生长素的诱导，不同时期基因表达水平差异明显，2个基因均在三褶虾脊兰花瓣距发育最后一个时期表达量最高，前2个时期表达量较低，与转录组FPKM值趋势一致。综上所述，初步推测2个响应因子基因参与生长素信号传导途径并调控园林花卉三褶虾脊兰花瓣距的形态建成和生长代谢过程。     

‘黄金梨’缺铁黄化叶片受GA3诱导复绿的机理研究

以‘黄金梨’缺铁黄化植株与正常植株为试材,于生长期黄化植株叶面喷施50、100、200和400 mg·L^-1 GA₃溶液,测定叶片中Fe、GA₃、GA₄、IAA和JA含量,对叶绿体进行了电镜显微结构观察,并运用荧光定量PCR技术分析了Fe代谢与GA信号转导相关基因的表达量。结果表明,外源GA₃处理后9 d,黄化叶均有不同程度复绿,叶脉复绿明显,叶身部分复绿,其中400 mg·L^-1 GA₃处理后12 d黄化叶复绿最明显。处理后9和12 d缺铁黄化叶片Fe含量显著高于清水处理对照。外源GA₃能诱导黄化叶片内FER1、FER2、FER3、FRO2、IRT1和FD1的表达,其中12 d各处理FER2和IRT1基因的表达量分别是对照10倍和40倍以上,说明外源GA₃促进了叶片内铁的贮藏、还原与转运相关基因的表达。外源GA₃处理显著提高了叶片中内源GA₃和G...     

普通白菜1，5- 二磷酸核酮糖羧化/ 加氧酶小亚基基因BcrbcS 的克隆及表达分析

利用RACE 技术,从普通白菜抗霜霉病品种苏州青叶片克隆到1,5- 二磷酸核酮糖羧化/ 加氧酶小亚基（ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit,BcrbcS）基因的全长cDNA 序列。采用qRT-PCR 分析该基因在普通白菜不 同组织的表达模式。利用SDS-PAGE 技术分析了该基因的原核表达特征。序列分析结果表明,BcrbcS 基因的cDNA 序列全 长为733 bp,其中开放阅读框长度为543 bp,共编码181 个氨基酸,分子质量为20.3×10³ Da,理论等电点为8.23。氨基酸 同源系统进化分析表明,普通白菜BcrbcS 基因与同科植物的进化关系相近。实时定量分析结果表明,BcrbcS 基因在普通白 菜叶中表达最强;在SA 和NaCl 处理下,BcrbcS 基因表达量均在处理24 h 后达到峰值。原核表达载体经IPTG 诱导表达出分 子质量约为20×10³ Da 的融合蛋白。     

四种植物生长调节剂对野生水栒子种子发芽的影响

采用不同浓度的吲哚丁酸（IBA）、赤霉素（GA₃）、6-苄氨基嘌呤（6-BA）、乙烯利等4种生长调节物质对水枸子种子进行发芽培养研究。结果表明:4种生长调节物质均可显著提高种子的发芽率和发芽势,吲哚丁酸（IBA）、赤霉素（GA₃）、6-苄氨基嘌呤（6-BA）、乙烯利促进水栒子种子发芽的最佳浓度分别为50、150、20、250 mg/L,综合比较认为20 mg/L的6-BA处理对水栒子种子的处理最好。     

生长调节剂对麻疯树成花及营养物质的影响

运用正交实验设计,用不同水平的6-苄氨基嘌呤（6-BA）+赤霉素（GA₃）+肥种处理麻疯树茎尖,研究外源物质对麻疯树花芽分化及树体内营养物质的影响。结果表明:各处理对麻疯树成花数量有显著影响,6-BA（2 mg/L）+GA₃（50 mg/L）+肥种（氮）为最优促花组合,正交实验设计中以6-BA（0.5 mg/L）+GA₃（50 mg/L）+肥种（氮）的促花效果较好;GA₃是影响麻疯树成花的主要因子。处理促进营养生长和生殖生长,二者交错进行。处理株叶片内氮、可溶性糖、淀粉、C/N比、钾的含量和变化趋势均呈增加-降低-再增加的S型模式。磷的含量在早期达到最大,之后便持续下降。叶片内钾在最高含量是最低含量的4.8倍,变幅最大,磷和钾呈极显著正相关。枝条生长与叶片内可溶性糖含量显著负相关。     

莴苣叶裂性状的遗传定位

以叶片全缘(entire)莴苣PI491070和叶裂(lobed)莴苣PI536760为亲本构建F_2代分离群体,F_2代性状分离调查结果显示叶裂性状为单基因显性性状。利用BSR-seq方法对莴苣叶裂性状进行快速遗传定位,将控制叶裂性状的基因定位在3号染色体的60~140 Mb之间。通过1 159株F_2群体的隐性单株进行分析最终将目的基因定位在116.24~118.15 Mb之间,物理距离大约为1.91 Mb。该区域包括24个候选基因,其中基因LG3316063编码锌指蛋白,在两亲本中有1个碱基的差异并导致了氨基酸的改变。从莴苣资源库中随机挑选5种叶裂植株检测该基因差异SNP位点都为G,7种无叶裂植株该基因SNP都为T,推测该基因可能是控制叶裂形成的候选基因。     

芥菜开花抑制因子SVP表达分析及其与FLC互作的调节位点鉴定

为阐明芥菜开花抑制因子SVP基因的表达特性及其与FLC蛋白互作的调节机制,从‘青叶芥’中克隆了SVP基因。定量PCR分析表明：低温春化途径和长日照光周期途径中SVP在叶片和茎尖均有表达。营养生长初期表达量较低（茎尖和叶片中平均相对表达量分别为0.56和0.35）,生殖生长早期则显著增加（春化途径的茎尖和叶片分别为0.60和1.27,光周期途径的茎尖和叶片分别为0.49和1.42）。茎尖中SVP对低温春化的反应比光周期敏感;而叶片中SVP对光周期的反应比低温敏感。酵母双杂交和 β–半乳糖苷酶活性测定显示：SVP蛋白I域突变体SVP^E90L以及K域突变体SVP^K104C和SVP^H106I均会削弱SVP/FLC₂蛋白的互作,但不会导致相互作用消失。SVP蛋白K域突变体SVP^R137L能完全破坏SVP/FLC₂的互作,但SVP^R137L仍然能与芥菜FLC₁、FLC₃、FLC₄和FLC₅相互作用,说明SVP/FLC₂的蛋白互作受到SVP第137位氨基酸的特异性调控。序列比对发现：芥菜FLC₄和FLC₅氨基酸序列完全相同,它们与FLC₃仅有1个变异位点;FLC₂与FLC₁、FLC₃、FLC_4-5之间分别有28、19、18个变异位点;FLC₂与FLC₁、FLC₃、FLC₄或FLC₅均不相同的位点有11个。推测FLC₂与FLC家族其他成员之间的变异位点很可能对SVP^R137L/FLC₂特异性调控有贡献。     

EMS诱变的‘里格尔87-5’番茄M_2群体突变体表型及其抗坏血酸研究

构建番茄突变体库对于丰富遗传变异、发掘基因资源具有重要意义。利用1%的甲基磺酸乙酯(EMS)处理‘里格尔87-5’加工番茄种子12 h,对M_2代材料进行农艺学性状与生物学性状鉴定,对部分M_3代材料进行遗传稳定性验证。在M_2代筛出典型突变体,包括早衰、矮化、圆果、低抗坏血酸、黑斑、绿茎、簇生等突变单株。对240个M_2代家系中共1 023个单株全生育期田间表型进行观察鉴定和果实品质测定,共发现90个变异单株,其中13个突变单株同时出现两个或两个以上变异性状,共50个变异性状,总的单株变异频率(突变株/总株数)为8.80%。叶、茎、花、果实和植株发生的变异株数分别为27、7、17、56和21,性状变异频率分别为2.64%、0.68%、1.66%、5.47%和2.05%。其中矮化突变体分子鉴定表明,curl-3基因外显子中C变成T,氨基酸由L变成F,喷施油菜素内酯不能恢复其正常生长,表明curl-3突变导致油菜素内酯信号传导受阻。curl-3突变体叶片与果实中抗坏血酸含量下降,并伴随着叶片中氧化态与还原态抗坏血酸比值增加,这可能与抗坏血酸氧化酶基因AO表达量和AO酶活性增强有关。     

日光温室早春黄瓜叶片喷施赤霉素对生长和生理及产量的影响

以日光温室早春茬‘中农26’黄瓜为试验材料,分别用10、50、100和200 mg·L~(-1)的赤霉素(GA_3)溶液喷施叶片,以清水处理为对照,研究不同浓度GA3对生长、生理特性、产量及品质的影响。结果表明,与对照相比,喷施GA_3处理可促进黄瓜生长。在试验浓度范围内,黄瓜株高,茎粗,叶片数,根系活力,色素含量,净光合速率(P_n)以及氮(N)、磷(P)、钾(K)、钙(Ca)、镁(Mg)、铁(Fe)等矿质元素含量均以50 mg·L~(-1)处理最高,其中Pn比对照增加22.44%;叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量分别比对照增加27.16%、24.22%和29.24%。同时,喷施GA3处理提高了黄瓜坐果率,从而使单株结果数和产量增加,其中50 mg·L~(-1)处理的产量为18.22 kg·m-2,比对照增加24%,且喷施GA3改善了黄瓜品质。喷施GA3可减轻早春日光温室亚适宜温光环境对黄瓜生长的不利影响,以50 mg·L~(-1)效果最好。     

菜豆豆荚发育过程中内源激素与细胞壁代谢的关系

细胞壁代谢严重影响鲜食菜豆(PhaseolusvulgarisL.)的食用品质。以‘大白棒’豆荚为试材,研究其4个发育阶段内源激素含量、细胞壁主要成分及酶活性的变化,并分析其内源激素与细胞壁代谢的关系。结果表明,豆荚发育过程中GA3和6-BA含量呈下降趋势,乙烯(ET)生成速率和茉莉酸(JA)含量呈先降后增趋势;豆荚在花后前10d以增长为主,花后10d后以增粗为主;花后前10d蔗糖合成酶(SuSy)促进蔗糖合成,随着SuSy活性和纤维素酶(Cx)活性的下降,蔗糖含量降低,纤维素含量升高;花后5 d时G木质素在木质部沉积,花后10 d时G木质素和S木质素均在韧皮部沉积,逐渐增多并向两边扩散,S木质素仅在韧皮部沉积;花后5 d时苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性高,为木质素生物合成提供底物,随后肉桂醇脱氢酶(CAD)活性增加,促进木质素合成;超氧化物歧化酶(SOD)活性增加促进O₂^-向H₂O₂转化,与增加的过氧化物酶(POD)催化木质素的氧化聚合;多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性、共价性果胶(SSP)和水溶性果胶...     

GA3对葡萄果实淀粉积累及代谢相关酶活性的影响

以3a生全球红葡萄为试材,研究了用不同浓度的赤霉素（GA₃）在花前、花后2次处理葡萄果穗后,测定其对葡萄果实淀粉积累规律以及淀粉代谢酶活性的影响。结果表明:GA₃处理增加了葡萄果实可溶性糖积累速率,蔗糖合成酶（SS）活性增加,以20mg/L GA₃处理最为显著;经GA₃处理的果实前期淀粉含量有不同程度的增加,总淀粉酶、α-淀粉酶活性增大,而对β-淀粉酶无明显影响。因此,GA₃与淀粉积累调控机理之间存在密切的联系。