正交优化多重PCR反应体系检测3种食源性致病菌的研究

[目的]建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的快速、敏感、特异的多重PCR检测方法。[方法]根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的IpaB基因、志贺氏菌的ipaH基因,设计3对特异性引物进行多重PCR检测,利用正交设计对多重PCR反应体系的镁离子、Toq酶、dNTP、引物的浓度在4个水平上进行L16（4^4）优化试验,并确定该检测方法的特异性与灵敏度。[结果]3对引物能特异性扩增出210、280、393bp的目的条带。利用FTA滤膜提取模板DNA,采用建立多重PCR同时对3种食源性致病菌进行检测具有较高的灵敏度,灵敏度金黄色葡萄球菌为3．5×10^2 cfu／ml、沙门氏菌为2．2×10^2 cfu／ml、志贺氏菌为1．0×10^2 cfu／ml。[结论]该检测方法准确、快速、高效,为同时检测食品中多种致病菌奠定了基础。     

三种常见食源性致病菌的多重PCR快速检测

为建立对3种食源性致病菌—大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的快速、敏感、特异的多重PCR诊断检验方法,本研究设计了上述3种菌的特异性PCR引物,通过单一、双重及三重PCR反应检测,并对人工感染的饮料和面包2种食品进行验证.结果表明,3种食源性致病菌的单一、双重和三重PCR均成功扩增出目的片断,没有非特异性扩增.人工感染食品的PCR检测也获得了目的菌的特异性片段,并且结果稳定.本研究所建立的多重PCR反应系统具有较好的特异性和灵敏性,为食品中常见致病菌的检测提供了一种快速、简便、可靠的方法,具有重要的理论意义及实践意义.     

食源性致病菌快速检测技术研究进展

食品安全问题日益受到各国政府和人民的普遍关注。由食源性致病菌引起的食源性疾病是影响食品安全的最主要因素之一。对在食源性致病菌快速检测中应用前景广阔的多重PCR技术、生物芯片技术、酶联免疫法、免疫胶体金技术、蛋白芯片技术及生物传感器技术进行了概述,为食源性致病菌快速检测体系的建立提供依据。     

食品中4种致病微生物的多重PCR快速检测技术研究

传统微生物检测方法耗时长、灵敏性差,难以满足食品安全快速检测要求,建立和完善食品中致病微生物快速检测技术具有重要的现实意义。本研究针对沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌,根据其特异基因设计出4对引物,通过对食品样品进行梯度离心处理、改良异硫氰酸胍法提取基因组DNA和多重PCR（multiplex　PCR）条件的优化,建立了这4种食源性致病微生物的多重PCR检测方法。通过人工污染检测和市场样品检测,同时进行传统方法验证,结果表明：该检测方法简单、快速、准确、灵敏度高,只需经过增茵4～8h其最低检出限可达1cfu／mL,具有较强的实际应用价值,可广泛应用于食品卫生检测和临床检验等领域。     

4种食源性致病菌的PCR-SSCP检测技术研究

采用细菌的16S rDNA保守区引物作为通用引物,对常见食源性致泻大肠埃希氏菌(Diarrheogenic Escherichiacoli)、沙门氏菌(Salmonellae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)进行PCR扩增,产物及其XmnI酶切后产物进行单链构象多态性分析。试验结果显示,4种食源性致病菌的PCR产物经XmnI酶切后进行单链构象多态性分析可以相互区别。因此,PCR-SSCP技术可以方便地用于检测食源性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌。     

食品中4种致病微生物的多重PCR快速检测技术研究

传统微生物检测方法耗时长、灵敏性差,难以满足食品安全快速检测要求,建立和完善食品中致病微生物快速检测技术具有重要的现实意义.本研究针对沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌,根据其特异基因设计出4对引物,通过对食品样品进行梯度离心处理、改良异硫氰酸胍法提取基因组DNA和多重PCR(multiplex PCR)条件的优化,建立了这4种食源性致病微生物的多重PCR检测方法.通过人工污染检测和市场样品检测,同时进行传统方法验证,结果表明:该检测方法简单、快速、准确、灵敏度高,只需经过增菌4～8 h其最低检出限可达1 cfu/mL,具有较强的实际应用价值,可广泛应用于食品卫生检测和临床检验等领域.     

多重PCR检测三种重要食源性致病菌方法的建立及应用

 【目的】建立快速检测奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌3种食源性致病菌的多重PCR方法。【方法】根据奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因（ureR）、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因（invA）和单核细胞增生李斯特氏杆菌编码溶血素O(LLO)的 hlyA基因,分别设计3对特异性引物,对单基因PCR和单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对单管多重PCR扩增条件,如引物浓度、Tm值、模板量等的优化,建立快速检测奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌的稳定的单管多重PCR方法。【结果】针对奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌3种食源性致病菌所设计的3对引物分别能扩增出374、724和215 bp的目的条带,具有高度特异性,反应条件优化后,3种目的菌在105 CFU/mL均可同时扩增出较清晰条带(奇异变形杆菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌在104 CFU/mL浓度下仍然可见到条带),比单基因PCR低一个稀释度,并且人工模拟试验和市售食品试验检测结果稳定。【结论】该方法操作简单、快速、特异性强和灵敏度高,能够实现对奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌3种食源性致病菌的快速诊断检测和监控。     

PCR和ELISA在食源性致病菌检测中的应用

阐述了PCR和ELISA这两种技术在食源性致病菌检测中的研究,并对这两种方法特点与应用进行了探讨。     

多重PCR检测四种食源性病原弧菌

【目的】建立在扩增内标存在下同时快速检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌4种食源性致病菌的五重PCR方法。【方法】以细菌16S rRNA基因为扩增内标靶序列,针对溶藻弧菌gyrB基因、副溶血弧菌collagenase基因、创伤弧菌vvhA基因、霍乱弧菌ompW基因,分别设计特异性引物,建立多重PCR体系,对其灵敏度和特异性进行评价,并将建立的五重PCR应用于弧菌的筛选。【结果】建立的多重PCR检测体系对混合模板中副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的灵敏度达10 CFU/mL,霍乱弧菌的灵敏度达105 CFU/mL,经特异性评价证实其特异性好,并能有效指示PCR反应的假阴性,将建立的多重PCR应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够快速、灵敏、准确地检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌4种食源性致病菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,适用于食品中常见致病性弧菌的快速筛检。     

奶牛乳房炎6种主要致病菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

为了同时检测奶牛乳房炎中的6种主要致病菌,本试验分别针对金黄色葡萄球菌的nuc基因、无乳链球菌的ef-tu基因、绿脓杆菌的eta基因、停乳链球菌的16srRNA基因、致病性大肠杆菌的Phoa基因、牛支原体的opp D/F基因设计合成了6对特异性引物.在建立并验证单一PCR的基础上,构建多重PCR反应体系,对其反应体系进...     

四种转基因玉米多重PCR检测方法的建立

为建立能同时检测4种转化体的多重PCR方法,选择进口转基因玉米最为常见的4种转化体Bt11、Bt176、MON810和MON863,利用国家标准中现行有效的转化体检测引物作为多重PCR检测体系引物,对多重PCR退火温度和引物浓度等进行优化。结果表明,多重PCR方法的适宜退火温度为58℃,适宜引物终浓度(μmol/L)配比为0.4∶0.4∶0.4∶0.4,通过建立快速、准确、高效的多重PCR为进口转基因玉米检测提供有价值的参考。     

冰鲜鸡肉中致病菌三重PCR检测方法的建立

【目的】建立在鸡肉生产一线具有较强操作性,并可同时检测沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157的三重PCR方法。【方法】利用该3种致病菌的特异性基因invA、HlyA、rfbE设计3对引物,在确定方法特异性和抗干扰能力的基础上,用优化后的反应体系对反应灵敏度进行测定,模拟并检测在鸡肉中常见腐败菌和鸡肉基质对检测方法的干扰影响作用下,在前增菌程序的辅助下该方法的实际样品检测灵敏度。【结果】该方法特异性和抗干扰能力强,3种致病菌测序结果的同源性分别达到100%、99%和99%,反应体系的最佳退火温度为51℃,灵敏度试验中3种致病菌同时检出的检测线达到103 CFU/mL,单重的灵敏度达到101 CFU/g,模拟实际样品检测中,经过20 h的前增菌后,三者同时检出的灵敏度达到101 CFU/g,单重PCR的灵敏度达到100 CFU/g;对60份屠宰线上的鸡胴体样品和32份超市鸡肉样品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157的检出率分别为20%、3.3%、21.7%(屠宰线样品)和25%、21.9%、6.25%(超市样品)。【结论】成功建立了可同时检出鸡肉中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157的三重PCR方法,可为生产一线的致病菌检测提供参考。     

食源性沙门氏菌PCR检测体系的建立及评估

为建立食源性沙门氏菌实时定量PCR检测体系,实现快速检测。根据GenBank数据库鼠伤寒沙门氏菌的invA基因序列(AE008832)设计引物,建立沙门氏菌实时定量PCR检测方法,通过标准曲线的建立和对40份牛奶和40份生肉进行检测评估检测体系的灵敏度和特异性。结果显示标准曲线相关系数为0.999,检出底限约8个细菌/反应。40份牛奶和40份生肉检测阳性率分别为2.5%和5%,与传统细菌分离检测结果完全相符。实时定量PCR检测沙门氏菌具快速、灵敏的优点,适宜于食品中沙门氏菌污染的调查及监测。     

鸡4种主要RNA病毒病多重感染复合PCR检测方法的建立

依据Gen Bank中注册的禽流感病毒(AIV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)基因组核苷酸序列,通过序列比对获得AIV、IBV、NDV、IBDV的相对保守序列。根据每种病毒的保守序列利用生物学软件分别设计3对特异性引物,4种病毒共设计12对引物,并对12对引物进行模拟筛选,获得匹配最佳的4对引物。对获得的最佳匹配引物进行单项PCR验证,优化复合PCR反应条件,确定最佳的退火温度、引物浓度和Taq DNA聚合酶使用量;经特异性、敏感性及简化PCR试验,最终建立了简易复合PCR检测方法。结果表明,建立的检测方法可同时扩增出4条大小与设计相符的特异性片段,即IBV(146 bp)、NDV(215 bp)、IBDV(345 bp)、AIV(435 bp);建立的复合PCR方法具有较强的敏感性和特异性,能检测出100 pg AIV、IBV、IBDV的cDNA和100 fgNDV的cDNA;将三温热循环改进为二温热循环,即将退火和延伸过程合为一步(62℃),大大缩短了反应时间。     

春夏季养殖罗非鱼体内食源性致病菌分析

[目的]为罗非鱼食源性致病菌的预警和防治提供理论基础。[方法]以2008年2～7月广东省不同区域罗非鱼养殖场为调查对象,定期采样分析罗非鱼体内及养殖环境中食源性致病菌的分布情况。[结果]春季罗非鱼养殖环境中共鉴定出8种致病菌,鱼体内共鉴定出6种致病菌;夏季罗非鱼养殖环境中共鉴定出13种致病菌,鱼体内共鉴定出12种致病菌;致病性嗜水气单胞菌、致泻大肠埃希菌、霍乱弧菌是养殖罗非鱼体内的主要食源性致病菌;夏季食源性致病菌的种类与数量多于春季。[结论]罗非鱼食源性致病菌的分布与养殖区域、水温及溶氧量等具有密切关系。     

食源性致病菌基因组DNA的高效提取方法

研究高效提取食源性致病菌DNA的方法,以适用于变性高效液相色谱基因分型法的高通量快速检测.试验采用沸水浴法、酚/氯仿-CTAB法、chelex100法和酶解吸附膜法分别提取沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、空肠弯曲菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、肠出血性大肠杆菌O157∶ H7、创伤弧菌中主要的食源性致病菌基因组DNA.并对基因组DNA的纯度和产量进行测定,通过定性、定量分析,确定了适用于食源性致病菌快速检测的DNA提取方法--酶解吸附膜法.     

病原菌"活的非可培养状态"检测技术研究进展

细菌培养技术一直是检测病原菌的常规方法,然而该法对进入“活的非可培养状态”（VBNC）状态的病原菌常常造成漏检。应用经典方法、荧光染料染色直接检测法以及分子生物学检测方法不但可以提高VBNC病原菌的阳性检出率,还可以正确地认识传染病起因,从而为传染病的预防监控奠定基础。     

多重PCR鉴定猪链球菌2型毒力菌株

为了鉴定猪链球菌2型毒力菌株,根据猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的荚膜多糖基因(capsular polysaccharide 2J,cps2J)、溶菌酶释放蛋白基因(muramidase-released protein,mrp)、毒力相关序列orf2基因(virulent-associate sequence orf2)设计合成3对引物,建立三重PCR检测方法,并对PCR扩增产物进行测序、酶切、特异性及敏感性实验。结果显示:26株SS2致病菌株均同时扩增出这3个目的片段,5株其他血清型猪链球菌(SS1,SS7,SS9)及13株非猪链球菌的其他猪源链球菌(兰氏B群、C群和D群)均未扩增出cps2J和mrp片段,检测结果与菌株的已知毒力因子背景完全相符。26株SS2的扩增片段经HincⅡ酶切鉴定,与预期结果一致。以SS2四川株ZY05719为模板的三重PCR产物(cps2J,mrp,orf2)测序结果与GenBank上相关序列比较,同源性分别为99%、100%、94%。该PCR敏感极限是600个细菌/每个反应。本试验所建立的三重PCR,特异性强,敏感性好,可用于实验室的快速诊断。