玻璃化法冷冻保存牛体外受精胚胎

本研究探讨了玻璃化冷冻保存对牛体外受精胚胎冷冻后存活的影响。7日龄的胚胎在10％甘油＋20％丙二醇的玻璃化冷冻液中，室温下停温10min，其孵化率为86．6％，与对照的83．2％相比，无明显影响（P＞0．05）。然10％甘油＋20％乙二醇，25％甘油＋25％乙二醇及25％甘油＋25％丙二醇均明显降低胚胎的孵化率（P＜0．01）。7日龄胚胎经10％甘油及10％甘油＋20％乙二醇依次平衡5min后,再置于25％甘油＋25％乙二醇的冷冻液中，20s内投液氮玻璃化冷漠，冻后孵化率达80．8％，明显高于其它平衡方法。冷冻液为25％甘油＋25％乙二醇的胚胎冻后总孵化率为72．1％，明显高于25％甘油＋25％丙二醇的60．9％。这些结果表明：牛胚胎玻璃化冷冻保存的成功率在很大程度上取决于防冻剂的种类、浓度及平衡方法。     

咖啡因预处理解冻精液对牛体外受精的影响

用２．５ｍＭ咖啡因处理解冻牛精液１０ｍｉｎ，或５．０ｍＭ咖啡因处理３０ｍｉｎ，精子经离心后加入到不含咖啡因的受精液中进行体外受精，均获得较高卵裂率（分别为８９．１％、８９．９％）及囊胚率（分别为４４．４％、４５．９％），并且第７天一级囊胚数较多。     

牛胚胎体外培养体系的优化

将体外受精后的牛卵母细胞随机分组进行培养,比较了胎牛血清(FBS)和发情后7 d牛血清(E 7BS)、不同培养液(CR 1+3 m g/mL BSA、SOF+3 m g/mL BSA和SOF+0.1 m g/mL PVA)、共培养体系和不同培养液体积(0.1,0.5和2.0 mL)对胚胎发育的影响,优化了牛胚胎体外培养体系,并对该体系的稳定性进行了检验。结果表明,优化后的牛胚胎培养体系为:前48 h用CR 1+3 m g/mL BSA培养液,48 h后用CR 1+体积分数10%E 7BS培养液培养120 h,培养液体积为0.5 mL,并且采用共培养,受精后颗粒细胞保留48 h。用该培养体系培养的牛胚胎发育良好,平均囊胚率为44.9%,表明该优化培养体系较稳定。     

牛体外受精胚胎无血清培养的研究

以TCM199为基础液,对常规IVM/IVF牛早期胚胎进行了无血清（1mg/ml,PVA,聚乙烯醇）和有血清（20%FCS）培养的对比实验。通过在无血清培养液中加入9种添加物,初步筛选出了在5%CO#-2、95%空气、39℃、饱和湿度培养环境下的牛体外受精胚胎无血清培养体系为：TCM199+EDTA0.1mmol/L+I5μg/ml+T5μg/ml+S5ng/ml+EGF10ng/ml+牛磺酸7mmol/L+亚牛磺酸5mmol/L+PVA1mg/ml+青霉素100iu/ml+链霉素100mg/ml。无血清培养与有血清培养囊胚率（7.1%对14.3%）、扩展囊胚率（4.3%对7.1%）,均无显著差异(P > 0.05)。实验结果还表明,外源激素（雌激素和孕酮）对胚胎发育无促进作用;有血清组与无血清组胚胎的各发育阶段（桑椹胚、囊胚、扩展囊胚）细胞核数量无明显差异（P > 0.05）。     

铜对牛卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎发育的影响

研究了氯化铜对牛卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎发育潜力的影响。培养液中铜的浓度以原子吸收光谱法测定。培养液中铜的浓度为0(对照组)、0.46和0.68 mg·L-1。结果表明,试验组在卵母细胞成熟和受精卵发育至2细胞率与对照组差异不显著(P>0.05),但试验组较对照组显著提高了桑椹胚和囊胚的发育率(P<0.05)。在卵母细胞体外成熟培养的0~22 h、受精卵培养的0~48 h、48~96 h、96~144 h和144~192 h,0.46 mg·L-1试验组培养液中铜浓度分别下降了4.3%、8.7%、26.0%、28.3%和30.4%,0.68 mg·L-1试验组培养液中铜浓度分别下降了2.9%、7.4%、23.5%、25.0%和27.9%。培养液中铜对牛早期胚胎培养至桑椹胚和囊胚有重要的作用,早期胚胎发育48 h后对培养液中微量元素铜的需求明显增加。     

维生素B12对牛冷冻精液精子质量的影响

牛精液冷冻前于精液然释中添加ＶＢ１２为试验组,不添加ＶＢ１２的对照组。冷冻结果表明：试验组冻精解冻后精子活力,顶体完整率分别对照组提高１６．１１％,１５．９％,精子畸形率与ＧＯＴ活性明显下降;精子存活时间处长。说明ＶＢ１２在牛精液冷冻中对牛了形态结构具有保护作用。     

牛体外受精胚胎冷冻保存的研究

本研究在国内条件下对牛体外受精胚胎的冷冻保存进行了系统研究。胚胎在含４．０ｍｏｌ／Ｌ乙二醇的ＰＢＳ中停留１５￣２０ｍｉｎ,对其随后卵化无明显影响（７２．２％比８２．４％,Ｐ〉０．０５）;当乙二醇的浓度升高到５．０ｍｏｌ／Ｌ和６．０ｍｏｌ／Ｌ时,胚胎的孵化率明显下降（２５．０％和３．２％,Ｐ〈０．０１）。在胚胎的常规冷冻保存试验中,当冷冻液为１．８ｍｏｌ／Ｌ乙二醇加０．２０ｍｏｌ／Ｌ蔗糖时,－７℃值     

不同冻精处理方法和添加咖啡因对牛体外受精的影响

【目的】为了探讨不同冻精处理方法以及添加精子活力激活剂并孵育不同时间获能对体外受精及受精卵发育的影响。【方法】研究对体外受精前的牛冷冻精液分别采用直接离心法、上游法和Percoll法3种方法处理,并对处理后的精液分别用含2.5mM或5.0mM咖啡因的获能液(BO液 10μg/ml肝素钠)在培养箱内预先孵育10min或30min进行获能,不同处理的精子经体外受精后。【结果】结果表明:(1)3种冻精处理方法(直接离心洗涤法、上游法、Percoll法)对精子处理获能,IVF后受精卵的卵裂率(依次为51.58%、52.83%、53.20%)均无显著差异(P>0.05);桑椹胚、囊胚发育率Percoll法处理组(16.66%、10.18%)与上游法处理组(17.85%、16.07%)以及Percoll法处理组与直接离心洗涤法组(8.77%、7.01%)均无统计学差异(P>0.05),同时实验结果还表现出上游法处理组比Percoll处理组的桑囊胚率有所提高,且上游法处理组与洗涤法处理组在桑、囊率上出现了显著差异(P<0.05)。(2)获能液中添加咖啡因组比非添加组(对照组)卵裂率和桑囊胚率有所增加,其中添加5.0mM咖啡因组精子孵育30min的获能效果最佳,卵裂率、桑囊率达到68.59%、28.50%。【结论】以上结果表明上游法处理牛冷冻精液稍优,更有利于以后的受精卵发育;添加咖啡因能提高精子活力,且高浓度的咖啡因维持精子高活力持续时间较长。     

添加β-巯基乙醇对牛体外受精胚胎体外发育的影响

在牛基础培养液中,添加50μmol/Lβ-巯基乙醇(β-ME)可显著提高牛体外受精(IVF)后胚胎的桑椹胚、囊胚率以及囊胚内细胞团数;并且以受精卵发育至4～8-细胞时期的添加效果为最佳。     

卵丘细胞对牛体外受精效果的影响

[目的]探索卵丘细胞对牛体外成熟卵母细胞体外受精效果的影响.[方法]试验采用体外成熟后卵母细胞脱除卵丘细胞组、部分脱除组及不脱除组.[结果]与卵丘细胞共培养时,部分脱除组的卵裂率及囊胚率(74.4％±4.1、53.7％±5.1)好于不脱除组(72.7％ ±5.1、52.4％±3.5),差异不显著(P＞0.05)、两者都好于全部脱除组(39.6％±4.5、l8.8％±4.6),差异显著(P＜0.05),且都显著优于对照组.卵丘细胞与褪黑素两者联合使用时,效果最佳.部分脱除组的卵裂率及囊胚率(79.8％±3.7、56.5％±5.1)好于不脱除组(78.2％±2.6、55.8％±4.6),差异不显著,两者都好于完全脱除组(48.3％±5.5、22.7％±4.3)及对照组,且差异显著(P＜0.05).[结论]该研究对奶牛和肉牛的生产提供了技术支持.     

牛体外受精胚抗冻性原因初探

 采用M 199、SOFaa(aa :aminoacids)和SOF对牛体外受精卵进行发育培养 ,比较了这 3种条件下培养出来的囊胚冷冻存活率 ,并采用脂肪颗粒染色法初步分析了影响胚胎抗冻性的原因。 3个处理组的冷冻存活率分别为78.5 %、46 .4%和 17.3%,三者间存在极显著差异 (P <0 .0 1)。孵化率分别为 41.9%、2 3.2 %和 0 ,三者间存在显著差异 (P <0 .0 5 )。 7枚经M199培养的囊胚均呈现均匀的小脂肪颗粒 (直径 2 .5 μm左右 ) ,SOFaa培养的 11枚胚胎中有 1枚呈不均匀的大脂肪颗粒 (直径 6 .3μm左右 ) ,其它 10枚呈均匀的小脂肪颗粒 ,而SOF组则有 84.6 %(11/13)的胚胎呈大脂肪颗粒。由此可见 ,3个处理组的胚胎冷冻存活率与小脂滴胚比率相一致。这一结果表明 ,脂滴大小与胚胎抗冻能力具有一定的相关性 ,小脂滴胚较大脂滴胚具有更强的抗冻能力 ;发育培养过程中使用不同的培养液以及氨基酸的添加能影响胚胎内脂滴的大小 ,从而影响胚胎的抗冻能力。     

精液质量对猪胚胎体外生产的影响研究

以猪鲜精、冻精进行体外受精试验.结果表明:用劣质鲜精(活力≤0.5、畸形率>30%)进行体外受精后,所获卵裂率与优质鲜精组(活力>0.8、畸形率<15%)差异不显著(51.0%对53.6%),但16-细胞胚发育率较优质鲜精组明显降低(28.9%对47.4%).用不同精卵比(A组12 000∶1、B组6 000∶1和C组3 000∶1)的冻精进行体外受精发现, A组卵裂率(37.5%)和16-细胞胚发育率(34.4%)均明显低于B、C组,后2组卵裂率和16-细胞胚发育率无明显差异(54.3%对54.2%,48.5%对45.7%).以活力较高(>0.5)的冻精进行体外受精后,所获卵裂率和16-细胞胚发育率与鲜精组无明显差异(54.3%对51.1%,48.2%对45.4%);而Ⅱ组(冻精活力≤0.4)的体外受精卵裂率虽与Ⅰ组(冻精活力>0.5)和对照组无显著差异,但16-细胞胚发育率仅为37.0%,明显低于Ⅰ组的48.2%和对照组的45.4%.试验结果表明:精液质量会影响体外受精胚胎的后续发育能力.     

不同培养系统对牛体外胚胎发育的影响

本研究通过体外不同成熟液、不同受精液、不同培养液、不同气象条件对牛体外受精的效果进行了比较,实验表明:自配的成熟液、受精液、培养液对卵母细胞卵裂率、囊胚率、孵化率与进口的试剂相比没有差异(P0.05);后期培养时低氧对胚胎发育没有影响。因此,用自配的成熟液、受精液、培养液以及含5%CO2的普通气体完全可以用做胚胎的体外生产,极大的降低了生产成本。