猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株ORF5基因在大肠杆菌中的表达

根据测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株(PRRSV GD)的序列,设计一对引物。用保存的PRRSV GD 的ORF5 的克隆产物pMD ORF5 质粒作为模板,扩增ORF5基因。将该片段定向插入到原核表达载体pBAD/gⅢC中,转化大肠埃希菌。重组质粒经PCR和酶切鉴定后,用阿拉伯糖诱导表达。用Western blotting鉴定表达蛋白,证明ORF5基因得到表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆与原核表达

通过PCR方法从重组质粒扩增得到猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)结构蛋白ORF5基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a,得到重组表达载体pET-32a-GP5,转化大肠埃希菌BL21.用不同浓度的IPTG分别于37 ℃诱导.经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为31.4 ku;薄层扫描分析显示,表达量占菌体总蛋白含量的28.8%.重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州爿离株ORF5基因原核表达的研究

通过对PRRSV贵州分离株（Guizhou-1）RNA的提取和RT-PCR方法扩增得到ORF5基因,成功构建原核表达载体pET-32a—ORF5,转化至宿主菌BL21（DE3）中,诱导蛋白表达,并对诱导表达蛋白的SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析,得到了约42．9ku左右的表达蛋白,与预期大小相...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州爿离株ORF5基因原核表达的研究

通过对PRRSV贵州分离株（Guizhou-1）RNA的提取和RT-PCR方法扩增得到ORF5基因,成功构建原核表达载体pET-32a—ORF5,转化至宿主菌BL21（DE3）中,诱导蛋白表达,并对诱导表达蛋白的SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析,得到了约42．9ku左右的表达蛋白,与预期大小相符,表明猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因在大肠杆菌中能表达,并具有一定的生物学活性。动物免疫试验表明纯化蛋白和包涵体均可刺激小鼠产生抗体,纯化蛋白的效果优于包涵体。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株ORF3基因的原核表达

通过 PCR方法从重组质粒 p GEM- ORF3扩增得到缺失 N端疏水序列的基因片段 d ORF3(deleting ORF3)。将d ORF3克隆至原核高效表达载体 p GEX- 4 T- 2 ,在 E.coli BL 2 1细胞中成功表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)重组蛋白GST- d ORF3,表达产物以包涵体的形式存在 ,表达量为 30 .6 % ,Western- Blot结果表明重组蛋白可被 PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究 PRRS病毒次要结构蛋白 GP3的免疫特性和功能奠定了基础     

贵州省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异分析

为了调查猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异情况,笔者收集了贵州省16家规模化养殖场153份疑似PRRS的样品,通过RT-PCR检测和ORF5基因序列的测定,结果表明:所有样品之间ORF5基因的同源性为98.7%～100%,氨基酸的同源性为98.5%～100%;与美洲型代表毒株VR-2332、国内标准毒株CH-1a和欧洲型代表毒株LV基因序列的同源性分别为89.2%～90%、94.8%～95.6%、59.7%～60.2%,氨基酸序列同源性分别为88.8%～89.3%、92.7%～94.2%、54.9%～55.3%,遗传衍化关系分析表明流行毒株属于美洲型.ORF5基因发生离散性变异,可以分为3个簇,与中国其他地区分离的高致病性PRRS病毒关系密切,而与早期分离的PRRS毒株关系疏远,说明猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因存在变异现象.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒山西分离株ORF5基因的序列分析

采用RT-PCR方法对2009—2011年山西省疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阳性病料进行克隆和测序,获得5个ORF5基因片段,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性分析。序列分析结果表明,5个ORF5基因序列之间核苷酸同源性为97.7%～98.5%,与欧洲型代表株LV、美洲型代表株VR-2332、2006—2007年国内分离的PRRSV变异株(JXA1、HuN、HUN4、HUB1)、2006年以前中国分离毒株(CH-1a、HB-1(sh)、HB-2(sh))和2个疫苗株(Resp PRRS MLV、MLV RespPRRS/Repro)核苷酸同源性分别为63.5%～64.0%、88.7%～89.2%、97.7%～99.3%、88.1%～96.7%和88.6%～89.1%;氨基酸同源性分别为56.1%～56.6%、87.8%～88.8%、96.6%～98.5%、85.9%～93.2%、86.8%～87.9%。结果表明山西地区的PRRSV流行毒株均属于美洲型,且毒株同源性很高,亲缘关系紧密。     

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2004-2009年猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF5基因的变异情况,从浙江省各个地区采集了109份临床疑似病料,共检测到61份ORF5基因阳性,经序列测定得到可比序列11 7个.在核苷酸序列分析中,发现2004-2005年PRRSV ORF5序列之间同源性为83.6％～99.3％,2006年同源性最高达98.3～99.2％,2008-2009年同源性又有所降低.在氨基酸主要位点分析中,分离毒株的非中和表位27～～30位点与美洲株相比,2004-2006年大部分毒株的29 aa由A29-V29,而2007-2009年大部分毒株的29 aa又由V29-A29;在表位37～45 aa中,所有39位点处由L39”一I39;在表位80～197 aa中,从2004-2009年185 aa大部分都发生了变异,由V185-A185,第189位点由I189-L189.在蛋白生化特性分析中,发现与参考株VR2332 (AY150564)和CH la(AY032626)相比,浙江省PRRSV-GP5蛋白的第100～106位亲水性、表面可及性明显增加,抗原性指数也有所提高,而与参考毒株JX-06-2-EU480750相似.该试验结果说明随着时间的推移,PRRSV ORF5基因发生明显的变异.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6基因在毕赤酵母中的表达

根据酵母表达系统的密码子偏爱性、poly(A)信号以及外源基因mRNA5’端的二级结构等特性 ,对猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)ORF6基因进行简并改造和人工合成 ,然后以正确的读码框架插入到分泌型酵母高效表达载体pPICZαA的α因子信号肽编码序列 3’端 ,构建成酵母转移载体 ,用化学方法转化受体酵母菌GS115 ,经PCR和酶切鉴定证实 ,目的基因已整合到重组酵母菌染色体中。对重组酵母进行诱导表达 ,并通过SDS_PAGE和Westernblot分析进行筛选 ,获得了一株高效表达目的蛋白的重组酵母菌 ,该重组蛋白具有免疫学活性 ,其表达水平可达 2 .0g/L ,而未经改造的ORF6基因则不表达     

8株猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异分析

本研究拟初步了解中原地区近期猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况。对2011—2012年间从河南及周边省份发病猪场分离的8株PRRSV毒株Nsp2基因变异区进行RT-PCR扩增,同时对主要结构蛋白GP5基因进行克隆测序并与GenBank中登录的中国历年来流行的PRRSV代表毒株的GP5蛋白序列进行遗传进化分析,对主要氨基酸基序进行比对分析。结果表明,2011—2012年在中原地区分离的8株PRRSV分离株均为Nsp2缺失变异株,GP5基因与2006年中国高致病PRRSV代表毒株JXA1同源性较高。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株ORF6基因的克隆与原核表达研究

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF6基因序列,设计合成一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出PRRSV的ORF6基因(M基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF6重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF6基因序列进行分析。结果表明,ORF6基因的原核表达载体构建成功。ORF6基因推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为96.0%～100%,与LV株的同源性为79.9%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。将构建成功的重组质粒pET-ORF6转化BL21,诱导后经SDS-PAGE和Western-blot分析表明:克隆在HIS标签的膜基质蛋白基因与HIS获得了高效表达,表达的融合蛋白HIS-M分子量约为39kDa,并且有免疫学反应活性。     

猪生殖与呼吸综合征病毒HN6株ORF5基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

用RT—PCR方法从河南分离的1株（HN6）猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸中扩增缺失N端疏水序列的基因片段dORF5（deleting ORF5），并将其克隆到pMD18-T载体中测序，再亚克隆到原核表达载体pET-32a上。重组质粒转化大肠杆菌BL21，用不同浓度IPTG分别于37℃诱导，经SDS—PAGE分析，所表达的融合蛋白的分子质量约31．4ku，薄层扫描分析显示，表达量占菌体总蛋白含量的28．8％。Western—blotting结果表明，重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。证实，该蛋白可用于PRRSV的诊断。     

我国部分省区HP-PRRSV分离株ORF5基因遗传变异分析

参考GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV ) JXA1的ORF5基因序列,设计并合成了一对引物,对分离自云南、浙江、山东、辽宁、黑龙江、天津、湖南等7省12株PRRSV分离株进行RT-PCR扩增,获得约773 bp的DNA片段,将其分别克隆至pGEM-T Easy载体中,并进行测序.应用DNAStar软件分析序列,并与VR-2332、CH-la、MLV、LV、BJ4、HB1、HuB2、JXA1等毒株ORF5序列进行比较,结果表明,分离株间的核苷酸同源性为91.9%～100%,氨基酸同源性为90.1%～100%;在美洲株遗传关系上又分为明显的2个群:12株分离株与HB1、HuB2、JXA1、CH-la亲缘关系比较近,处于一个亚群;VR-2332、MLV、BJ4处于另一个亚群.说明高致病PRRSV为我国PRRS主要流行病毒.     

PRRSV BJ-4株ORF5基因的原核表达与重组蛋白的纯化

为成功表达猪繁殖与综合征病毒(PRRSV)结构蛋白GP5，通过PCR方法从重组质粒pGEM-ORF5扩增得到缺失N端疏水序列的基因片段dORF5(deleting ORF5)。将d ORF5克隆至原核高效表达载体pGEX-4T-2，在E.coli BL21细胞中成功表达了重组蛋白GST-dORF5，表达产物以包涵体的形式存在，表达量为20．8％。Western-Blot结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。利用融合肽进行亲和层析得到高纯度的重组蛋白，为进一步研究PRRS病毒结构蛋白的结构和功能奠定了基础。     

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2014-2016年浙江地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）ORF5基因变异情况,试验通过RT-PCR方法对从浙江省各地区采集的PRRSV阳性病料进行ORF5基因扩增,应用DNAStar和Mega 5.1软件对所测序列进行同源性和遗传变异分析。结果显示,54株2014-2016年浙江分离株ORF5序列之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.1%~100%和80.6%~100%,与经典株VR2332核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.8%~90.4%和81.6%~90.0%,与高致病PRRSV毒株JXA1核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.5%~99.5%和83.1%~99.0%。系统进化分析表明,54个毒株均为美洲型毒株,属于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ 3个不同的基因亚型,其中基因亚型Ⅲ和Ⅳ毒株是浙江省近年来新出现的毒株。氨基酸序列分析结果显示,54个毒株在GP5蛋白的信号肽区域、非中和抗体表位的氨基酸序列变异较大,而在中和表位氨基酸序列变异较小。本研究结果表明,浙江地区PRRSV流行出现了新形势,多种基因亚型共同存在,其中以基因亚型Ⅰ毒株为主。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BD株的分离及GP4基因的克隆

从河北保定分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经过两代盲传后,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为BD株.根据GenBank公布的PRRSV JXA1株0RF4基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增完整ORF4基因,将扩增产物连接到pMD19-T 载体并转化克...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是严重危害养猪业的病原,论文概述了PRRSV的生物学特性和基因组的结构及编码的结构蛋白,综述了PRRSV新型疫苗、反向遗传技术和分子诊断的研究进展,为PRRS的预防和诊断提供科学依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是目前养猪业中一种严重的病毒性传染病,引起猪严重繁殖障碍和呼吸道疾病。该病的病原体属于动脉炎病毒属,是一种不分节段的单股正链RNA病毒,含有8 个开放阅读框(ORFs),ORF1 编码非结构蛋白,ORF2~ORF7 编码结构蛋白。其中ORF7 编码的核衣壳(N)蛋白和ORF6编码的非糖基化基质(M)蛋白为优势结构蛋白。猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组存在广泛的遗传变异性,M蛋白和N蛋白在所有的毒株之间相对比较保守,可作为血清学诊断的靶抗原。文章就猪繁殖与呼吸综合征病毒在分子生物学方面的研究情况做作一综述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因原核表达载体的构建与鉴定

本试验旨在构建能表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的重组质粒。用疑似患猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病猪的脾脏、肺脏病料提取RNA,根据PRRSV ORF5基因设计1对引物,进行RT-PCR扩增,将ORF5目的基因克隆到pMD19-T载体中,得到pMD19-ORF5重组菌。根据测序结果和表达载体特点,设计1对带有NcoⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物,扩增目的片段(dORF5),将其分别与pProEXHTb载体、pNZ8149载体连接,得到HTb-dORF5/DE3和pNZ8149-dORF5/NZ3900重组菌,分别用IPTG和Nisin诱导,再进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果显示,HTb-dORF5/DE3重组菌在1.5 mmol/L IPTG诱导时表达量最高,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,在约22 ku处有特异性条带,且具有反应原性;pNZ8149-dORF5/NZ3900重组菌在20 ng/mL Nisin诱导时表达量最高,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,在约19 ku处有特异性条带,间接免疫荧光试验有特异性绿色荧光。本研究成功构建重组质粒HTb-dORF5和pNZ8149-dORF5并获得表达,这为进一步研制预防PRRS疫苗奠定坚实基础。