牛FABGL基因cDNA的克隆与序列分析

以中国西门塔尔牛肝脏组织为材料,运用同源序列克隆技术结合RT-PCR和RACE技术,对牛FABGL基因的cDNA进行了克隆与序列分析,并对推导的FABGL蛋白结构与性质进行了初步分析。结果表明,牛FABGL基因的cDNA序列长994 bp,包括780 bp的开放阅读框、16 bp的5′非翻译区和198 bp的完整3′非翻译区,由260个氨基酸组成。该基因cDNA核苷酸编码区序列与猕猴、人、猪和小鼠FABGL基因的相似性分别为89%,89%,87%和86%。推导的氨基酸序列与猕猴、人、猪和小鼠的相似性分别为89%,87%,89%和86%。以FABGL基因cDNA编码区序列构建的分子进化树研究结果表明,牛的FABGL基因在人、猕猴、猪、鼠等物种中,与猪的亲缘关系最近。牛的FABGL蛋白的三级结构包含2个跨膜结构—Cu toff模体,分别位于11~16位氨基酸和128~131位氨基酸处。     

牛ANGPTL3基因的电子克隆与序列分析

运用生物信息学方法,对牛ANGPTL3基因的cDNA进行了序列分析,并对推导的牛AN-GPTL3蛋白结构与性质进行了初步分析。结果表明,牛ANGPTL3基因的cDNA由1 566个核苷酸构成,包括1 380 bp的开放阅读框,80 bp的完整的5′非翻译区和106 bp 3′完整的非翻译区,编码460个氨基酸。该基因cDNA编码区序列与野猪、狗、黑猩猩、人以及恒河猴编码区序列的相似性分别为90%,88%,87%,87%和86%,而推导出的氨基酸序列与野猪、狗、黑猩猩、人以及恒河猴的相似性分别为86%,86%,83%,83%和80%。利用该基因编码序列翻译的氨基酸序列与野猪、狗、黑猩猩、恒河猴和人同源基因相应序列构建分子进化树,结果表明,牛的ANGPTL3基因在上述5个物种中,与野猪的分子进化关系最近。     

猪MBF1基因的克隆与序列分析

克隆了MBF1基因875 bp的c DNA序列和1 919 bp的基因全序列(登录号:EF 625885)。序列分析表明,猪MBF1基因序列与人、小鼠的相似性分别为89%和88%,氨基酸序列与人和小鼠的相似性分别为99%和97%,猪MBF1基因包含5个外显子和4个内含子,内含子的剪接方式都符合"GT-AG"法则;组织表达谱分析表明MBF1基因在心、肝、脾、肾、子宫中表达量较高,在胃和小肠中低表达。     

广西眼镜蛇Dmrt基因DM结构域克隆及序列分析

[目的]了解广西眼镜蛇Dmrt基因DM结构域特性,为探讨眼镜蛇性别决定和分化发育的分子机制及证实Dmrt基因家族在爬行动物进化中的保守性提供理论依据.[方法]以广西眼镜蛇为材料,采用简并PCR扩增克隆眼镜蛇Dmrt基因DM结构域,并分析其与人、猕猴、牛、小鼠、大绿蛙、中华蟾蜍、扬子鳄等相应Dmrt基因DM结构域的同源性及系统进化关系.[结果]克隆获得广西眼镜蛇Dmrt基因家族的两个成员,分别命名为Nn1 Dmrt和Nn2 Dmrt.经系统进化分析,发现两个Dmrt基因DM保守区核酸序列与人、猕猴、牛、小鼠、大绿蛙、中华蟾蜍、扬子鳄相应Dmrt基因保守区核酸序列的相似性均在74%以上,其推导氨基酸序列的相似性均在80%以上.[结论]Dmr基因DM结构域编码序列在不同物种中同源性较高,Dmrt基因家族在动物系统进化上具有高度的保守性.     

烟草(云烟87)NBS-LRR类同源抗病基因克隆及分析

[目的]克隆并分析烟草NBS-LRR类抗病基因的同源序列(RGAs),为采用同源克隆技术挖掘烟草抗病基因提供理论参考.[方法]从基于NBS-LRR类抗病基因保守序列设计的简并引物中筛选扩增效果较好的引物用于扩增烟草RGAs,采用DNAMAN 6.0翻译成氨基酸序列,并与已知的其他植物抗病基因进行聚类分析.[结果]克隆获得6条与参比抗病基因具有高度同源性的烟草RGAs,大小在500 bp左右,但仅有4条RGAs具有连续的开放阅读框(ORF)及编码NBS功能结构域的核苷酸序列,命名为TRGA-87-1~TRGA-87-4.这4个烟草RGAs编码的氨基酸序列均含有NBS类抗病蛋白的多个典型保守基序,与已知的多种植物抗病基因编码的氨基酸序列均具有较高的相似性,其中,与烟草相关抗病基因编码的氨基酸序列相似性最高,为97.00%~100.00%,与其他植物的抗病基因编码氨基酸序列相似性为29.00%~53.00%,这些序列可分为3个亚类,其中TRGA-87-2与烟草N和亚麻L6聚为一类(TRGAⅠ),属于TIR-NBS-LRR类;TRGA-87-3和TRGA-87-4与水稻Xa-1和番茄Mi聚为一类(TRGAⅡ),属于non-TIR-NBS-LRR类,TRGA-87-1与拟南芥RPM1聚成一类(TRGAⅢ),属于non-TIR-NBS-LRR类.[结论]同源扩增技术可用于烟草中抗病基因的克隆、功能分析及定位等研究.     

海南普通野生稻STK类抗病基因 同源序列的分离与分析

根据植物STK 抗病基因的保守区域设计简并引物,以海南普通野生稻基因组DNA 为模板进行PCR 扩增,通过T/A 克隆、测序和序列分析, 共获得5 条具有连续ORF 的STK 抗病基因类似物（RGAs）序列,核苷酸序列间的相似性系数为37.82%耀99.25%,相应氨基酸序列间的相似性系数为31.28%耀98.86%。氨基酸序列结构分析表明,它们都具有STK 保守结构域,与已克隆的STK 类抗病基因有不同程度的相似性,为进一步克隆海南普通野生稻中的STK 类抗病基因提供依据。     

梭梭HaACT基因片段的克隆和3’UTR序列分析

【目的】以克隆HaACT基因为出发点,为进一步分析其表达特点奠定基础。【方法】根据NCBI上已发表的藜科其他植物肌动蛋白(Actin)序列的保守区设计一对简并性引物,以梭梭(Haloxylon ammodendron)同化枝为材料提取总RNA,采用RT-PCR法和3’RACE技术克隆了HaACT基因部分片段及3’UTR序列。【结果】得到HaACT基因片段1 107 bp,该序列编码257个氨基酸,3’UTR序列长度为416 bp。使用NCBI和DNAMAN软件对3’UTR序列进行了同源性分析。HaACT基因3’UTR序列与CaACT基因3’UTR序列的相似性高达93%,与BvACT基因3’UTR序列相似性为92%,与GhACT基因3’UTR序列相似性最低,为86%。【结论】HaACT基因与其他植物Actin基因可能具有相似的调控机制。     

银杏CONSTANS基因的克隆与序列分析

利用1对简并引物,从银杏中克隆得到CONSTANS基因的cDNA片段,命名为GbCO。GbCO长855bp,编码285个氨基酸。核苷酸和蛋白质序列多重比较结果显示,GbCO与其他植物的CO基因的核苷酸与蛋白质序列均高度同源。GbCO编码的蛋白质与挪威云杉、海岸松和长白松的CO氨基酸相似性分别为60%、53%和52%。CO系统进化树显示,GbCO与其他裸子植物亲缘关系较近。该研究通过克隆GbCO基因,可为利用转基因技术缩短银杏童期提供基因资源,也为进一步了解银杏开花的分子调控机理奠定基础。     

Cloning and sequence analysis of DM domain of Dmrt gene in Guangxi Naja naja atra

[目的]了解广西眼镜蛇Dmrt基因DM结构域特性,为探讨眼镜蛇性别决定和分化发育的分子机制及证实Dmrt基因家族在爬行动物进化中的保守性提供理论依据.[方法]以广西眼镜蛇为材料,采用简并PCR扩增克隆眼镜蛇Dmrt基因DM结构域,并分析其与人、猕猴、牛、小鼠、大绿蛙、中华蟾蜍、扬子鳄等相应Dmrt基因DM结构域的同源性及系统进化关系.[结果]克隆获得广西眼镜蛇Dmrt基因家族的两个成员,分别命名为Nn1 Dmrt和Nn2 Dmrt.经系统进化分析,发现两个Dmrt基因DM保守区核酸序列与人、猕猴、牛、小鼠、大绿蛙、中华蟾蜍、扬子鳄相应Dmrt基因保守区核酸序列的相似性均在74％以上,其推导氨基酸序列的相似性均在80％以上.[结论]Dmr基因DM结构域编码序列在不同物种中同源性较高,Dmrt基因家族在动物系统进化上具有高度的保守性.     

薏苡丙酮酸脱羧酶1(PDC1)基因片段cDNA克隆与分析

参考水稻、玉米的PDC1蛋白保守序列以及甘蔗的PDC基因片段,设计1对简并引物,从薏苡中克隆了PDC基因片段.经测序和在NCBI数据库进行序列相似性搜索,结果表明,该序列与甘蔗PDC基因同源性为96%,与玉米PDC3和水稻PDC2同源性分别为94%和90%,推测该序列为薏苡PDC1基因片段.     

猪HK2基因的克隆及序列分析

为克隆猪己糖激酶2基因,分析其生物功能,采用已报道的人及小鼠HK2的cDNA序列为依据,利用电脑克隆策略获得的ESTs设计引物,扩增新的猪HK2基因cDNA序列。将PCR产物克隆测序,分析获得的核苷酸序列及其编码蛋白的特性,分离的开放阅读框全长2754bp,编码917个氨基酸,与人和小鼠的核苷酸序列同源率分别为90%和87%,与人和小鼠的氨基酸序列同源率分别为96%和94%,利用生物信息学软件分析出此蛋白的理化特性并预测了其蛋白结构,为进一步开展猪HK2基因的结构功能、表达调控的相关研究奠定了基础。     

猪干扰素IFNE1基因克隆及重组表达载体的构建

依据电子延伸序列设计一对克隆引物,用RT-PCR法从猪胃组织扩增出猪干扰素epsilon1(IFNE1)基因的完整编码区并进行序列分析;再根据克隆的序列设计一对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出EcoRI/XhoI酶切位点的猪IFNE1片段,插入原核表达栽体,转化至宿主菌,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白.结果表明,克隆的猪IFNE1基因包含完整的开放阅读框架,长为586bp.ORF为582bp,编码193个氨基酸,与人、小鼠的同源性分别为83.6%和69.2%,推测的氨基酸序列与人、小鼠的同源性分别为76.2%和55.2%,表达的融合蛋白分子量约为47kD.     

猪L-Myc基因的分子克隆及在细胞重编程中的应用

【目的】克隆猪L-Myc基因,并在蛋白水平表达的情况下探索其在细胞重编程中的作用,为深入研究猪L-Myc基因替代c-Myc诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）奠定基础。【方法】先通过NCBI序列比对,采用RT-PCR克隆猪L-Myc基因cDNA,生物信息学分析猪L-Myc基因与人和小鼠的同源性,构建融合表达载体pEGFP/L-Myc-C1,通过载体转染和免疫印记检测猪L-Myc基因cDNA的蛋白水平表达;再将L-Myc基因装入逆转录病毒载体中,分别使用不同的转录因子诱导猪胎儿成纤维细胞（porcine embryo fibroblast,PEF）,通过形态变化和碱性磷酸酶（AP）染色验证猪L-Myc基因在细胞重编程中的作用。【结果】①获得了1 113 bp的猪L-Myc基因cDNA,编码364个氨基酸,理论分子质量为40 kD;②生物信息学分析显示猪L-Myc基因与人和小鼠高度同源;③免疫印记检测结果说明猪L-Myc基因cDNA能够在蛋白水平表达;④细胞诱导试验和AP染色结果显示转录因子Oct4、Sox2、Klf4和L-Myc（OSKL）组合诱导的细胞阳性克隆率明显高于Oct4、Sox2和Klf4（OSK）组合的阳性克隆率。【结论】获得了猪L-Myc基因,并且该基因在蛋白水平表达且在细胞重编程过程中起到了重要的作用。     

猪泛素C端水解酶L1基因的克隆与序列分析

从人泛素C端水解酶L1(UCH_L1)基因出发,在dbEST数据库中同源搜索,找到1条与人UCH_L1基因编码氨基酸同源性较高且在香猪背最长肌中表达的EST(BM194679).通过电子克隆和进一步RT-PCR试验验证,获得猪UCH_L1基因全长cDNA序列,其全长 1 105 bp,开放阅读框(ORF)位于60～728 bp,编码223个氨基酸.同源性分析结果表明,与人、鼠UCH_L1基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为91.2%和86.5%,蛋白质序列同源性均为96.6%.对该基因编码蛋白的结构和功能预测显示含有2个典型的疏水性区域,不含有信号肽,存在1个UCH_L1(pfam01088)保守结构域和多个磷酸化位点,属UCH_L1蛋白家族,故将该基因命名为猪泛素C端水解酶L1基因(登录号AY495532).     

猪CISD1基因电子克隆与验证

对通过抑制差减杂交技术所筛选的猪前脂肪细胞诱导分化后差异表达的CISD1基因的EST序列为探针进行电子克隆,用克隆序列设计引物,通过RT-PCR、克隆测序、同源比对证实所获序列为猪CISD1基因的mRNA序列,并将序列提交到Genebank,登录号为GQ913654。所获猪CISD1基因的mRNA序列全长为631 bp,CDS包含321 bp,由其编码的CISD1蛋白包含106个氨基酸残基,理论等电点为9.20,属脂溶性不稳定蛋白。猪CISD1蛋白的1~23位氨基酸可能是信号肽,53~91位氨基酸形成CDGSH锌手指域,为该蛋白的重要功能域,猪CISD1蛋白的三级结构与人CISD1蛋白相似度为89.333%。     

猪Sirtuin3基因的克隆与进化分析

从猪十二指肠肠道组织提取总RNA,采用RT-PCR方法克隆了猪Sirtuin3基因,并与GenBank中的9个其他物种的核酸序列进行了同源性分析,采用邻接法构建了分子系统进化树。结果表明克隆的猪Sirtuin3基因长999bp,编码332个氨基酸,前21个为信号肽;猪Sirtuin3与牛、人的同源性最高,分别为86．3％、79．6％,分子进化树也表明猪的Sirtuin3与牛、人的亲缘关系最近。     

猪脂肪诱导转录物的克隆与组织分布

本试验研究了猪脂肪代谢的重要功能基因——脂肪诱导转录物(FIT)。根据Genebank提供的电子延伸序列和内标β-actin基因序列设计引物,分别以脂肪和肌肉组织mRNA为模板,经反转录和PCR反应,克隆得到了FIT1基因和FIT1mRNA3’UTR区。对测序结果进行序列分析表明,猪FIT1基因的cDNA序列,全长为1 310bp,ORF为400~1 272bp,编码290个氨基酸。同源分析结果表明,猪FIT1基因与Genebank上已登录的牛、人、大鼠和小鼠的核酸序列同源性分别为93.2%、92.1%、87.4%和88.1%,氨基酸序列的同源性分别为96.6%、97.2%、94.8%和95.5%。在此基础上,进一步研究了组织分布,显示结果为在肌肉和脂肪组织FIT1有明显分布,而在其它组织分布量很低。     

三元杂交猪IL-18全基因的序列测定及分析

白细胞介素-18（IL-18）又称γ干扰素诱导因子（IGIF）,研究表明IL-18是一种重要的新型免疫佐剂分子。为探讨猪IL-18的免疫佐剂作用,该研究根据已发表的猪IL-18基因序列,设计并合成1对特异性引物,从猪脾脏中直接扩增得到猪IL-18全基因,并进行克隆和序列测定、分析。     

猪神经介素B和受体基因的克隆与组织分布

基于电子延伸序列,克隆并分析了猪神经介素B(NMB)和受体(NMBR)基因。猪NMBcDNA克隆片段长度为567 bp,开放阅读框架长度为366 bp,编码121个氨基酸。NMBR cDNA克隆片段长度为1 194 bp,开放阅读框架长度为1 173 bp,编码390个氨基酸。同源分析表明,猪NMB的核酸序列与牛、人、小鼠和大鼠的同源性分别为87.1%,85.2%,78.1%和76.6%,氨基酸序列的同源性分别为81%,74.4%,70.2%和70.1%;NMBR的核酸序列与牛、人、小鼠和大鼠的同源性分别为91%,89%,84.2%和83.6%,氨基酸序列的同源性分别为92.3%,90.3%,86.9%和86.4%。组织分布结果显示,猪NMB在多种组织均有分布,NMBR仅分布在大脑。克隆的猪NMB和受体基因分别注册GenBank(EU375564和EU670045)。