单管多重RT-PCR同时检测大豆种子中三种检疫性植物病毒

我国大豆年进口量持续增长,快速、准确地检测进境大豆种子中可能携带的病原物是防止检疫性有害生物入境传播和扩散的有效手段。菜豆荚斑驳病毒(BPMV)、烟草环斑病毒(TRSV)和番茄环斑病毒(ToRSV)均是被大豆种子携带的检疫性有害生物。本研究建立了在单一PCR管中同时检测这3种检疫性植物病毒及大豆内源基因Bd-30K的多重RT-PCR方法。研究结果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有较好的特异性和灵敏度,检测含BPMV、TRSV和ToRSV RNA的最低浓度分别为0.45、0.0093和0.004ng/μL,从大豆种子中同时检测3种病毒的最低RNA浓度为0.58ng/μL。     

烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的半巢式RT-PCR检测

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)和番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)是我国禁止入境的检疫性有害生物。采用半巢式RT-PCR方法对这两种病毒进行了检测,用Trizol快速提取病毒总RNA,并根据TRSV和ToRSV的外壳蛋白基因设计特异性引物,经过第一轮RT- PCR和第二轮半巢式PCR扩增,TRSV样本分别得到359 bp和206 bp特异性片段,ToRSV样本分别得到340 bp和219 bp特异性片段。半巢式RT-PCR扩增产物的测序表明,TRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在88%～97%的同源性,ToRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在96%～100%的同源性。研究显示,DAS-ELISA与RT-PCR的检测灵敏度相近,而半巢式RT-PCR的检测灵敏度比这两种方法高出10~3倍以上。     

利用实时荧光RT-PCR方法检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒

根据番茄环斑病毒和烟草环斑病毒各分离物CP基因的保守序列分别设计并合成1对引物和1条TaqMan荧光探针,分别建立了ToRSV和TRSV的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法具有更加灵敏、特异、快速和简便的特点,在口岸病害检疫中具有广泛的应用前景。     

烟草环斑病毒RT-Realtime PCR检测方法

烟草环斑病毒(Tobacco ringspotvirus,TRSV)是我国公布的二类检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大。受该病毒侵染的一些寄主植物出现隐症,并伴随病毒浓度降低,给检测工作造成困难。根据TRSV外壳蛋白基因序列设计合成了一对引物及一条MGB探针,优化了反应条件,建立了TRSV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法与常规的DAS-ELISA方法和RT-PCR方法相比,灵敏度分别提高了200倍和4倍,并且对不同寄主上的TRSV均有较好的检测效果。     

番茄环斑病毒单克隆抗体的制备及检测

将纯化的番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)制剂免疫BALB/c小鼠,末次免疫后第3天取其脾细胞与SP2/0细胞融合,采用选择性培养基、有限稀释法克隆和间接ELISA方法进行筛选,成功获得了2株分泌ToRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株并分别命名为1H8、1D4.用间接ELISA方法对所获得的2个杂交瘤细胞株进行亚型鉴定均为IgG1亚类.间接ELISA效价测定结果1H8为1:105,1D4为1:106.TAS-ELISA实验结果表明此2株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体均能与本研究室保存的从德国引进的番茄环斑病毒分离物、从美国ATCC引进的番茄环斑病毒分离物PV-100、PV-174、PV-239发生特异性反应,而不与同属其它3种病毒:烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)、南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)、马铃薯黑环斑病毒(Potato black ringspot virus,PBRSV)发生反应.     

4种大豆种传病毒多重RT-PCR检测

进境大豆携带的病毒主要有菜豆荚斑驳病毒(BPMV)、烟草环斑病毒(TRSV)、烟草条纹病毒(TSV)和南方菜豆花叶病毒(SBMV)等,均为大豆种传病毒,可随大豆种子实现远距离传播。本研究对这4种大豆病毒的外壳蛋白基因部分序列设计引物,并通过优化引物、模板浓度和扩增参数,在一个体系中成功对4种病毒进行了多重RT-PCR扩增,得到307bp、206bp7、17bp5、18bp共4条特异性条带,建立了能同时检测BPMV、TRSV、TSV和SBMV的多重RT-PCR检测体系。该方法快速、灵敏、简便,同时特异性强,在出入境检疫中具有广泛的应用前景。     

实时荧光RT-PCR一步法检测番茄环斑病毒

 根据番茄环斑病毒(ToRSV)各株系RNA1聚合酶基因的保守序列,设计并合成1对引物和1条TaqMan荧光探针,建立了对ToRSV的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法利用TaqMan荧光探针实时监测目的基因的扩增,实现RT-PCR扩增与探针检测同时进行,不需PCR后处理,消除了PCR产物的污染,不需电泳和EB染色,减少了检测步骤,节省了时间。这个方法具有"灵敏、准确、简便、快速"的特点适合于种传病害的快速诊断和口岸检验检疫运用。     

逆转录环介导等温扩增技术检测烟草环斑病毒的研究

 本研究采用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP),建立了一种快速、简便的烟草环斑病毒检测方法。根据TRSV外壳蛋白编码基因上的8个位点,共设计了6条引物,通过RT-LAMP扩增得到特征性的梯度条带。特异性试验表明,引物对TRSV的检测具有良好的特异性;灵敏度试验显示RT-LAMP比普通RT-PCR高10倍。通过反应温度和时间的优化,该方法只需在水浴锅中60℃等温扩增60 min,整个检测周期约1.5 h,结果采用SYBR green I染色显示,易于观察和判定。     

烟草环斑病毒粒体细胞间传播过程的电镜观察

 本文对烟草环斑病毒(TRSV)接触感染大豆叶片细胞后的细胞传毒过程进行了连续观察。研究结果表明:①TRSV粒体是以整体病毒颗粒的形式进行细胞间传播的。②TRSV粒体通过细胞壁的胞间连丝和类似吞噬过程进入细胞。③TRSV粒体装配、成熟后,贮存在液泡中。     

从进境印度尼西亚辣椒种子中截获番茄环斑病毒

本文利用DAS-ELISA方法从印度尼西亚进境的辣椒种子中初步筛选出疑似感染有番茄环斑病毒(ToRSV)的样品,利用IC-RT-PCR(immune capture RT-PCR)扩增特异性片段,进而对扩增的PCR产物进行了测序和序列比对,确认我们在进境的辣椒种子中检出了我国关注的检疫性有害生物——番茄环斑病毒。此前该病毒未有在印度尼西亚辣椒上危害的报道,是系统内首次在蔬菜种子上截获该病毒。     

番茄褐色皱果病毒SYBR GreenⅠ实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用

根据番茄褐色皱果病毒（tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV）外壳蛋白（coat protein,CP）的保守基因序列设计1对特异性引物,建立了基于SYBR Green I的ToBRFV实时荧光RT-PCR检测方法,并对其进行了特异性、灵敏度检测,对自然感染ToBRFV的番茄、辣椒种子进行了检测验证。结果表明,构建的实时荧光RT-PCR检测ToBRFV阳性的番茄种子总RNA和重组质粒标准品的检测低限分别为0.2 ng/μL和50.0拷贝/μL,均为普通RT-PCR检测灵敏度的100倍;对番茄花叶病毒（tomato mosaic virus,ToMV）、番茄环斑病毒（tomato ringspot virus,ToRSV）、番茄黑环病毒（tomato black ring virus,TBRV）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus,TSWV）、辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）和烟草环斑病毒（tobacco ri...     

电化学酶联免疫分析检测烟草花叶病毒和烟草环斑病毒

以邻苯二胺 (OPD)底物为例 ,用抗原直接包被法 (DAC -ELISA)同线性扫描极谱法 (LSV)相结合 ,检测烟草花叶病毒 (TMV)的提纯液 ,检出限可达 0 2 5ng/ml,TMV粗提液的最高稀释比为 1 :1 0 2 4 0 0 ;检测烟草环斑病毒 (TRSV)提纯液 ,检出限为 1 0ng/ml,粗提液的最高稀释比为 1 :1 0 0 0 0 ,该方法的灵敏度比DAC -ELISA光度法提高了 5倍以上     

应用IC-RT-PCR方法检测番茄环斑病毒

以番茄环斑病毒阳性样品为研究材料,根据GeneBank(核酸序列数据库)中的序列设计特异性引物进行IC-RTP-CR(免疫反转录聚合酶链式反应,下同)扩增,获得产物克隆到pMD18-T载体中,经测序后与目标序列(ToRSVL19655)比较,核苷酸同源性为87.3%。通过实验建立了检测该病毒的IC-RT-PCR方法。该方法对其他样品核酸提取困难而抗体较容易制备的病毒检测同样具有借鉴意义。     

侵染昆明玫瑰的李坏死环斑病毒的鉴定及其分子检测

采集昆明地区种植的花叶症状明显的玫瑰样品,运用现代分子生物学技术与常规技术相结合的方法,初步鉴定引起玫瑰花叶病的主要病毒病原为李坏死环斑病毒.该病毒引起玫瑰植株的系统花叶、畸形和皱缩等症状;电镜下病毒粒体为球形,直径为22～23nm;ELISA检测发现该病毒在植株芽、花粉和顶部叶片的浓度最高;同时,根据外壳蛋白的保守区利用Primer 5.0设计该病毒的特异引物,对该病毒进行分子检测,得到450bp的预期DNA片断,并在此基础上,进行了巢式RT-PCR的分子检测,表明巢式RT-PCR的检测能力最强.并通过序列的同源性分析得知该病毒的外壳蛋白与已知PNRSV的同源性为98.0%,进一步证明了该病毒为李坏死环斑病毒.     

<Emphasis Type="Italic">Tobacco ringspot virus</Emphasis> persists in the shoot apical meristem but not in the root apical meristem of infected tobacco

We analysed the kinetics of virus distribution in Tobacco ringspot virus (TRSV)-infected tobacco. Infected plants developed asymptomatic leaves above the symptomatic leaves that exhibited ringspots. We detected virus in the shoot apical meristem (SAM). Time-course immunohistochemical microscopy showed that TRSV continuously distributed in the centres of the SAM and in leaf primordia. In contrast, TRSV infection was transient in the root meristem. In western blot and RT-PCR analyses, TRSV infection occurred only within and around the ringspot tissues of the symptomatic leaf; however, TRSV was not or hardly detected in the asymptomatic leaves of inoculated tobacco plants. These results indicate that TRSV persists in the SAM, but that TRSV infection is transient in the root meristem and asymptomatic leaves.