细胞密度对猪圆环病毒2型效价检测结果的影响

为了解猪圆环病毒2型效价在检测过程中不同猪肾细胞(PK15)细胞密度对检测结果的影响,优化猪圆环病毒2型效价检测方法,提高猪圆环病毒2型效价检测结果的准确性,试验将消化后的PK15细胞稀释成细胞密度分别为3×10~4个/m L、5×10~4个/m L、7×10~4个/m L、9×10~4个/m L的细胞悬液,用于稀释猪圆环病毒2型样品,并将各组样品稀释1×10~4、1×105、1×1063个稀释度的细胞毒液,接种于96孔细胞板培养,72 h后用间接免疫荧光法测定病毒效价。结果表明:各不同密度PK15细胞检测的猪圆环病毒2型效价结果偏差很小,不超过0.1个效价,但细胞密度高的检测结果比密度低的高一些。说明不同密度细胞对病毒效价的检测结果影响很小,在猪圆环病毒2型效价检测过程中可以忽略细胞密度对病毒效价检测结果的影响,如果需要查找影响病毒效价检测结果偏差的原因,可以从其他因素去考虑分析。     

猪圆环病毒体外高效增殖研究进展

猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus diseases, PCVDs)主要通过疫苗产品进行预防,病毒增殖水平与疫苗研发密切相关,随着新发病原PCV3和PCV4的出现和广泛流行,对于实现此类病毒体外高效增殖,已经成为开展相应病毒病原学、发病机制及其疫苗研究方面的瓶颈。鉴于4种猪圆环病毒(PCV)在基因组结构、复制机制等方面的相似性,现对其中已实现体外培养的PCV2,在促进其病毒增殖方面的方法和研究进展进行总结和概括,以期进一步提升现有PCV2增殖水平,并对实现PCV3或PCV4的体外培养提供助力,从而促进PCV疫苗的研发和相关病原学与发病机制的深入研究。     

糖基化位点突变对猪圆环病毒2型增殖的影响

为提高猪圆环病毒(PCV)的滴度,以本实验室已成功分离的1株PCV2d流行毒株PCV2RC160307为模板,通过融合PCR突变其Rep蛋白上的1个N-糖基化位点,并成功构建自身环化感染性克隆HT-PCV2,转染ST细胞,盲传至F8代后,通过PCR、间接免疫荧光(IFA)及过氧化物酶单层试验(IMPA)进行验证,并通过IMPA测定TCID50发现,拯救成功的HT-PCV2病毒滴度为105.2×TCID50/0.1mL,较分离的流行毒株RC160307及未糖基化位点突变的感染性克隆H-PCV2的病毒滴度有所提高。此种方法为PCV2复制机制的进一步研究疫苗的研制及其疾病的预防奠定基础。     

不同接毒方法对猪圆环病毒2型增殖的影响

本试验对比了不同的接毒方法,观察猪圆环病毒2型的繁殖情况.试验分为同步接毒(A组、B组)和异步接毒(C组、D组):同步接毒A组为在消化分装好的细胞悬液中同步接入5%(V/V)的PCV2种毒,B组为在消化分装好的细胞悬液中同步接入3%(V/V)的PCV2种毒,24 h后再接种2%种毒;异步接毒C组为在生长良好、 培养24 h的单层细胞中接种5%(V/V)的PCV2种毒,D组为在生长良好、培养48 h的PK15单层细胞中接种5%(V/V)的PCV2种毒.四组均在接种后培养72 h收获,进行病毒含量检测.试验结果显示:A组的病毒含量为107.0~7.25TCID50/mL,B组病毒含量为106.75~7.0TCID50/mL,C组的病毒含量为106.4~6.5TCID50/mL,D组的病毒含量为106.25~6.5TCID50/mL.试验结果表明,采用同步接毒法的病毒含量明显高于异步接毒法,在细胞悬液中同步一次性接入5%种毒,病毒的增殖量最高.     

无血清悬浮培养PK-15细胞及其对猪圆环病毒2型增殖的影响

【目的】 建立基于无血清悬浮培养PK-15细胞生产猪圆环病毒2型（PCV2）疫苗的工艺,提高PCV2疫苗生产效率,降低PCV2疫苗生产成本。【方法】 首先采用直接驯化法对贴壁生长的PK-15细胞进行无血清悬浮培养驯化,并在无血清悬浮培养体系下,采用连续传代的方法考察驯化成功的PK-15细胞的传代和生长稳定性。研究不同感染复数（MOI）（0.10、0.05、0.01和0.001）和不同PK-15细胞接种密度（CDI）（1.0×10⁶、3.0×10⁶、5.0×10⁶/mL）对PCV2增殖的影响,同时对感染病毒前后的细胞培养液中葡萄糖、氨基酸及代谢副产物乳酸和氨进行初步分析。【结果】 贴壁PK-15细胞经过30 d的直接驯化可以快速适应无血清悬浮培养,且驯化过程中细胞平均比生长速率由0.1 d^-1增加到0.6 d^-1;悬浮PK-15细胞可以至少连续稳定传15代,连续传代过程中平均比生长速率在0.6 d^-1附近波动,且细胞活率始终>90%;以1.0×10⁶/mL接种,第4天可达到峰值活细胞密度6.2×10⁶/mL,并可维持1 d,第4天前活率均>90%,此后快速下降;病毒增殖最佳工艺参数为：感染复数为0.05,细胞接种密度为1.0×10⁶/mL,最终收获时病毒滴度可达10^6.2TCID₅₀/mL;对细胞感染前后的代谢分析发现,病毒感染后细胞对葡萄糖和多数氨基酸代谢快于感染前,且感染组在感染后72 h附近出现葡萄糖和谷氨酰胺耗竭并伴随代谢副产物乳酸和氨快速积累,之后细胞改变代谢途径并利用乳酸。【结论】 30 d的直接驯化可以获得悬浮PK-15细胞株,PK-15细胞可用于PCV2增殖,结果可为大规模无血清悬浮培养PK-15细胞生产PCV2疫苗提供一定理论和实践基础。     

猪圆环病毒

猪圆环病毒病是近年来备受关注的一种在世界各地广泛存在的慢性疾病,是一系列疾病的总称。自1974年Tischer1等首次发现猪圆环病毒（Porcine circovirus ,PCV）以来,随着对PCV研究的深入,根据猪圆环病毒的致病性及其基因组差异又可将其分为无致病性的猪圆环病毒1型（PCV-1）和有致病性的猪圆环病毒2型（PCV-2）。PCV-1对猪无致病性,但能产生血清抗体,在猪群中普遍存在,接种2日龄与9日龄的猪无临床症状。PCV-2对猪有致病性,主要导致一种以断奶仔猪呼吸急促或困难、腹泻、贫血、明显的淋巴组织病变和进行性消瘦为特征的新的疾病,     

检测猪圆环病毒方法的研究进展

自1974年,德国学者Tischer从多株连续传代的PK-15细胞中发现了圆环病毒（PCV）以来,圆环病毒迅速席卷全球,给养殖业造成巨大损失。经研究发现,圆环病毒属于圆环病毒科、圆环病毒属,为已知的最小的动物病毒之一。PCV有两种型,即PCV1和PCV2。PCV1从长期持续污染的猪肾PK-15细胞中分离得到,     

猪圆环病毒和猪瘟病毒对猪免疫功能的影响

目前猪病毒性免疫抑制病是规模化猪场最常见的疾病之一,严重影响猪群的健康,已经给世界养猪业造成了巨大的经济损失。引起猪免疫抑制的病原复杂多变,不同的猪场病因可能完全不同,从而给疾病的诊断与防治带来了很大的困难。多年的研究表明,该病因可能包括猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流感病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型     

热应激对嵌合猪圆环病毒1-2在PK-15细胞中增殖的影响

为提高表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的重组猪圆环病毒1型(PCV1)疫苗株(嵌合猪圆环病毒1-2,PCV1-2)在细胞内的增殖水平,本研究采用PK-15细胞,应用活细胞计数、间接免疫荧光及Taq Man荧光定量PCR等方法测定不同热应激温度和持续时间处理后细胞生长和病毒增殖的情况。结果显示,PK-15细胞可耐受41℃和43℃的培养环境,并且与常规培养方法相比43℃条件下热应激处理12 h可显著促进PCV1-2在细胞内的增殖,其病毒效价可达10~(6.0)TCID(_50)/m L以上。另外,热应激处理后病毒核酸拷贝数的动态变化表明,热应激对PCV1-2复制的影响主要在接毒后24 h至48 h内显现。本研究确定了促进PCV1-2增殖的热应激条件,为提高PCV1-2疫苗产量提供了方法。     

SYNGR2影响猪圆环病毒2型体外增殖的研究

宿主的Synaptogyrin-2(SYNGR2)蛋白影响猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的感染能力。本研究旨在研究宿主因子SYNGR2对PCV2在细胞水平增殖的影响,并进一步对SYNGR2影响PCV2体外增殖的机制进行探究。本研究利用基因敲除、过表达、定点突变等手段,在PK15细胞上研究SYNGR2基因敲除及其p.Arg63Cys点突变对PCV2增殖的影响。为探究SYNGR2参与PCV2感染的具体机制,作者对SYNGR2基因敲除的细胞及野生型对照细胞进行转录组测序,筛选SYNGR2功能相关的基因及通路,根据差异表达基因进行表达模式聚类分析,并通过实时荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)验证差异表达基因的表达情况。结果显示,SYNGR2基因敲除或p.Arg63Cys点突变显著降低PCV2对PK15细胞的感染能力,对敲除细胞过表达不同基因型的SYNGR2,PCV2的增殖能力均恢复。转录组差异表达基因分析结果显示,SYNGR2的功能主要是参与膜成分及囊泡等被膜细胞器的组成。对差异表达基因肌球蛋白VIIA与Rab互作蛋白(...     

应用PCR技术检测猪圆环病毒

根据已报道的PCV-2序列,设计1对特异性引物,建立PCR检测方法,并用所建立的方法对送检的25头病猪进行检测,结果阳性检出率为28%。这表明安徽地区猪群中存在PCV-2感染。     

猪圆环病毒核酸检测技术研究进展

猪圆环病毒(Porcine Ci rcovirus,PCV)包括PCV1、PCV2和PCV3以及新鉴定的PCV4。其中PCV1无致病性,PCV2主要引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)等猪圆环病毒相关疾病,PCV3多见于皮炎肾病综合征(PDNS)和繁殖障碍症状的猪群,PCV4首次鉴定于患有呼吸道症状、肠炎和PDNS的病猪。由于猪圆环病毒通常造成PMWS、PDNS以及PRDC等猪圆环病毒相关疾病,因此,了解这些疾病的临床特征是初步诊断PCV感染的基础。实验室检测方法常作为临床上确诊PCV感染或PCV与其他猪病原体鉴别诊断的有力工具,越来越多的检测方法对临床上检测PCV提供了更多的选择。因此,本文就猪圆环病毒实验室核酸检测方法进行汇总,以期对临床上选择合适的方法检测圆环病毒提供参考。     

猪圆环病毒免疫学检测技术研究进展

为了更好的掌握猪圆环病毒（Porcine Circovirus,PCV）快速、准确的检测鉴定方法,现就近年来国内外研究的实验室免疫学检测PCV抗原和抗体的技术,包括：免疫组织化学、夹心ELISA、免疫荧光方法、胶体金免疫层吸法等,进行综述,以期对临床快速诊断和防控提供一定的参考。     

猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型二重PCR检测方法的建立

为建立同时检测PCV3和PCV2的二重PCR方法,分别以PCV3和PCV2基因组的保守区域设计2对特异性引物,片段大小分别为649,295 bp。将反应条件进行优化,构建PCV3和PCV2的二重PCR检测方法。检测结果表明该方法能特异性扩增PCV3和PCV2,且无法扩增其他猪常见病毒;PCV3和PCV2的最低检出限分别为508,412 copies/μL。临床样品检测结果显示,PCV3和PCV2阳性率分别为2.1%(3/145),62.1%(90/145),PCR产物经测序证实为PCV3。本研究建立的二重PCR方法具有速度快、特异性强和灵敏度等优点,可以用于PCV3和PCV2的检测和流行病学调查。     

猪圆环病毒PCR检测方法的建立

猪圆环病毒PCV属于圆环病毒科,根据国外已经报道的猪圆环病毒的序列,设计了下面的一对引物,上游引物和下游引物(upper:5'-TTTTTATCACTTCGTAATGGTTTTT-3'lower:5'-GGCCCCCTTCCTCCGTG-GATTGTTC-3'),提取DNA,对PCV-2进行PCR试验.然后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳.结果显示,从美国进口的种毒中扩增出了长为1768bp的基因片段.本试验可以从病料或全血中检测出PCV,且该方法能区分PCV-1和PCV-2,快速、敏感、特异性强,适合于PCV的检测.     

猪圆环病毒病的PCR检测分析

猪圆环病毒(PCV)的聚合酶链反应(PCR)实验用于猪血清和组织中PCV的检测、诊断和流行病学调查。该检测试验是利用离心柱内惰性大分子膜提取病料DNA作为模板,中温时在TaqDNA聚合酶作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,沿模板合成一条新链。每个环节包括高温变性、低温退火和中温延伸三个过程,使特异DNA片段的拷贝数放大1倍。经过35次循环,最终使扩增DNA片段放大了数百倍。将扩增的产物进行电泳,经染色后,在紫外灯照射下,肉眼可见到DNA片段的扩增带。分别利用PCV1和PCV2阳性对照进行检测,PCV-1阳性对照出现652bp扩增带和PCV-2阳性对照出现1154bp扩增带,阴性对照无带出现(引物带除外)时实验结果成立。从该实验中充分了解检测过程中的每一个步骤以及注意事项,充分掌握PCR检测的要点,同时更加全面地了解猪圆环病毒的知识。     

猪圆环病毒2型的PCR检测

为了了解猪养殖场猪圆环病毒2型感染的情况,应用建立的猪圆环病毒2型PCR方法,对采自广东省的7个养猪场的样品进行了检测,结果为7个养猪场阳性检出率为100％,其中腹股沟淋巴结、全血、血清的阳性检出率分别为85．71％、72．86％、37．14％。结果表明,7个猪养殖场都存在猪圆环病毒2型的感染,其中腹股沟淋巴结的阳性检出率最高,其次为全血。     

猪圆环病毒的血清学检测及分析

猪圆环病毒病是猪的免疫抑制性疾病。笔者对西青地区2013-2015年连续三年随机采集的猪血清进行了血清学检测,并进行了分析。     

运用PCR检测猪圆环病毒的研究

设计和合成了一对引物，建立PCR反应，用于检测猪圆环病毒。结果表明，PCR对猪圆环病毒细胞毒，病毒基因克隆具有较好的特异性和灵敏性，提示用PCR试验检测猪圆环病毒是一种较好的方法。     

四川猪圆环病毒Ⅱ型的检测

据文献资料设计一对引物,初步建立了检测猪圆环病毒II型(PCV-2)核酸片段的PCR方法。从可疑病料中扩增出了预期长度为473bp的DNA片段,用另一套引物证实了PCR产物的特异性。首次证实了四川地区猪群中存在PCV-2感染,为进一步研究打下了基础。