在毕赤酵母中利用口蹄疫病毒(FMDV)2A实现dTomato和串联MagaininⅡ基因的共表达

抗菌肽(antibacterial peptides)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的多肽,是天然免疫的重要组成部分.为了提高抗菌肽的表达量以及很方便地检测抗菌肽的表达情况,本研究利用口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV) 2A将荧光蛋白dTomato基因和3个串联的MagaininⅡ基因融合到一个开放阅读框中(open reading frame,ORE),融合的基因被置于pPIC9K载体醇氧化酶基因(AOX1)启动子的下游,构建分泌型重组酵母表达载体pPIC9K-dTomato -2A-3M,将线性化的重组酵母表达载体通过电击法转入毕赤酵母(Pichia pastoris )GS115中,经G418筛选和PCR鉴定得到阳性转化子,然后将其转至摇瓶,在30℃、0.5％甲醇的条件下进行诱导表达,连续诱导3d.SDS-PAGE电泳图谱显示,在31 kD(dTomato)和9.5kD(3M)处有蛋白条带出现,在荧光显微镜下观察酵母表达上清发出红色荧光,对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌试验结果表明,重组抗菌肽串联的MagaininⅡ具有明显的抑菌效果.结果表明,由2A连接的融合基因(荧光蛋白dTomato和串联的MagaininⅡ)在毕赤酵母中成功的进行了表达,FMDV 2A在其C端剪切多聚蛋白,得到dTomato和串联的MagaininⅡ两个独立而有活性的蛋白,为小分子抗菌肽的表达提供一个高效的检测方法.     

益母草抗菌蛋白LJAMP2的表达及抗菌活性分析

LJAMP2是一种分离自益母草(Leonurus japonicus Houtt.)种子的非专一性脂转移蛋白类抗菌蛋白.将编码成熟的LJAMP2蛋白的基冈(GenBank Accession No.AY971513)插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pas-toris)表达载体pPIC9K中;重组质粒pPIC9K-LJAMP2经线性化后,用电转化法导入毕赤酵母菌株GS115(his-/mut+)中.转化子用含1.75 mg/mL G418的YPD平板筛选获得多拷贝Mut+转化子.将1%甲醇诱导LJAMP2表达后的发酵液,经进一步浓缩、凝胶过滤脱盐、CM FF阳离子交换色谱和反相HPLC进行纯化,获得纯度90%以上的LJAMP2菌株诱导24 h即有LJAMP2的表达,诱导168 h表达量达到最高;表达的LJAMP2蛋白对黑曲霉(Aspergillus niger)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、镰刀菌(Fusarium graminearum)真菌表现出抑制活性.     

拟南芥Alpha-dioxygenase2(AtDOX2)在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

为了获得具有生物活性的拟南芥(Arabidopsis thaliana)alpha-dioxygenase2(AtDOX2),将其对应基因AtDOX2编码区克隆到酵母表达载体pPIC9k中,获得重组表达载体pPIC9k-AtDOX2,将线性化的重组载体电击转化入毕赤酵母(Pichia pastoris)表达菌株GS115,经G418筛选、PCR鉴定和甲醇诱导时间优化,获得重组AtDOX2的高效表达菌株GS115/pPIC9k-AtDOX2。SDS-PAGE分析结果显示,0.5%甲醇诱导96h重组蛋白表达量最高,其表达量占胞外总蛋白的15%。重组AtDOX2的表观分子量约为70kD,经Ni-NTA柱亲和层析可获得纯度大于80%的重组蛋白。2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)法测定结果表明重组蛋白具有过氧化物酶活性,且其活性受Ca2+和Mg2+激活,受EDTA、咪唑和Mn2+抑制;2,4-二硝基苯肼(2,4-DNP)法测定结果显示,重组AtDOX2具有双加氧酶活性,Ca2+对其双加氧酶活性也有激活作用。结果说明利用酵母表达系统获得...     

嗜热子囊菌光孢变种cbh1基因的cDNA克隆及在毕赤酵母的高效表达

以嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)总RNA为模板，通过RT-PCR克隆出外切纤维二糖水解酶基因cbh1片段，采用RACE方法获得全长cDNA克隆，其全长为1 710 bp，编码一种由457个氨基酸组成的单肽，推导的氨基酸序列中1～19位为信号肽序列，GenBank的登录号为AY840982。将该片段克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达重组质粒pPIC9K/cbh1，转化毕赤酵母GS115，所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，筛选出一重组子GSp-15,经144 h诱导后，外切纤维二糖水解酶表达量为1.17 mg/mL，产酶活力为20.3 U/mL。     

斑点叉尾鮰铁调素成熟肽在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性

铁调素(hepcidin)是一种在动物肝脏中特异表达的碱性小分子抗菌肽,在机体免疫系统中发挥重要作用,被认为是抗生素的理想替代品。本研究根据毕赤酵母(Pichia pastoris)偏爱性密码子人工合成斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)hepcidin成熟肽基因(mCH)。通过PCR方法在mCH的5’端和3’端分别引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点,扩增到的目的片段与表达载体p PIC9K连接构建重组表达载体p PIC9K-mCH后,转化至毕赤酵母GS115细胞;以不同浓度梯度的G418筛选高拷贝转化子,1.0%甲醇、30℃、pH6.0诱导表达72 h,获得重组体mCH。结果显示,斑点叉尾鮰hepcidin成熟肽区域含25个残基,8个保守的半胱氨酸残基位于成熟肽的羧基端,表明该区域对hepcidin的抗菌活性具有重要作用。Tricine-SDS-PAGE分析显示,分泌表达的重组体mCH的分子量约为3 800D,通过阳离子交换层析获得纯化的mCH。抑菌实验表明,重组体抗菌肽mCH对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)有抑菌活性。本研究首次实现了斑点叉尾鮰hepcidin成熟肽在毕赤酵母中的重组DNA表达,为其产业化制备提供了重要的基础资料。     

抗菌肽模式肽PGYa的分子设计、克隆及在毕赤酵母中的分泌表达

在α-螺旋抗菌肽序列比较和两亲性分析的基础上,提取序列模板,计算机辅助（螺旋轮法）设计出新型抗菌肽模式肽PGYa(Peptide以Gly开头,以Tyr-NH2结尾),然后选用毕赤酵母偏爱密码子,设计合成了PGYa基因（rPCR法）。所合成的基因全长为94bp,并在其N端引入kex2裂解位点,以保证表达抗菌肽具有天然N端。基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型酵母表达载体pPICZα-A-PGYa。在AOX1 (醇氧化酶)启动子调控下,PGYa蛋白获得分泌表达,其表达量达到132 mg/L。初步抑菌（E.coli DH5α）活性显示：PGYa有较好的抗菌活性。     

犬白细胞介素2在毕赤酵母中的诱导表达及生物活性的测定

以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞总RNA为模板，通过RT-PCR方法扩增出犬IL-2成熟蛋白基因，将目的片段连接到pMD18-T载体，测序结果显示，扩增片段与GenBank上发表的序列一致。然后将目的片段连接到酵母表达载体pPICZa-A上，得到重组酵母犬IL-2表达载体pPICZaA-CaIL-2，经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。PCR方法筛选重组酵母菌，甲醇诱导表达，SDS-PAGE结果显示表达上清中有大小约20kDa的目的条带，比实际分子量略大，推测蛋白可能发生糖基化。MTT法测定生物学活性结果表明，重组犬IL-2能够极显著促进犬外周血淋巴细胞增殖。证明酵母表达的犬重组IL-2具有良好的生物学活性。     

经改造的猪IGF-Ⅰ基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

采用酵母偏爱密码子合成5条编码猪胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)基因的引物,利用重叠PCR技术获得含210bp猪IGF-Ⅰ成熟蛋白基因的拼接产物。将该基因插入分泌表达载体pPIC9K中,转化巴斯德毕赤酵母菌(Pischia pastoris)。经表型鉴定、PCR分析及G418筛选得到Muts型多拷贝整合菌,以1.5%甲醇诱导培养后,经SDS-PAGE检测表达产物,在7.5kD处出现一特异蛋白条带,目的蛋白表达量达410mg/L。Dot blot检测表明,重组蛋白可与抗IGF-Ⅰ多克隆抗体反应。     

巴斯德毕赤酵母新型分泌表达载体构建

巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPICINU是利用来源于克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus)的菊粉酶基因信号肽DNA序列（ISP）构建的。表达实验结果表明，带有分泌表达载体pPICINU的β-1，3－1，4葡聚糖酶基因重组菌，具有与带有表达载体pPIC9K(带有α因子信号肽）的β-1，3－1，4葡聚糖酶基因重组菌相同的分泌效率。     

源于厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2的xynA在毕赤酵母中的高效表达及其酶学性质分析

β-D-1,4-内切木聚糖酶(endo-1,4-β-D-xylanase,xynA,EC.3.2.1.8)简称β-木聚糖酶(β-xylanase),是木聚糖降解酶系中最重要的成员,广泛用于饲料、食品、造纸和生物能源等领域.厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2 xynA具有潜在的开发价值,但是其异源表达的活性较低.本研究根据毕赤酵母(Pichia pastoris)对基因密码子偏好性,对厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2的xynA进行密码子优化.通过全基因合成技术合成优化后的xynAm,并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点,构建重组质粒pPIC9K-xynAm,电击转化至毕赤酵母GS115菌株中,以29℃、0.5％甲醇诱导表达,获得重组xynA,并对该酶的酶学特性进行了研究.结果表明,在摇瓶水平条件下,诱导表达108 h时重组β-木聚糖酶活性达到最大值,为612 IU/mL.在10L发酵罐中诱导表达96 h后,xynA的活性为3 515 IU/mL,比活性为2 411 IU/mg;菌体培养湿重、干重和培养上清总蛋白质的浓度分别为324、156和2.25 g/L.非变性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)凝胶电泳显示,重组木聚糖酶的分子量约为42.7 kD.酶学性质分析表明,重组β-木聚糖酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH 6.0,在温度为30～50℃、pH 4.0～10.6之间该酶具有较好的稳定性,其Km=27.86 mg/mL,Vmax=277.78 mg/(mL· min).底物特异性分析表明,重组xynA可水解低粘度阿拉伯木聚糖、高粘度阿拉伯木聚糖、燕麦木聚糖、桦木木聚糖和4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸-D-木聚糖,但不降解大麦(Hordeum vulgare)β-葡聚糖和地衣多糖.10 mmol/L的Co2+和K+对该酶的活性略有激活作用,Mn2+、Fe2+和SDS对该酶活性有一定的抑制作用.本研究为进一步工业化应用来源于厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2的β-内切木聚糖酶奠定了基础.     

家蝇防御素抗菌肽Des-hf突变体的抑菌活性

采用PCR定点突变技术,将家蝇(Musca domestica)防御素抗菌肽成熟肽段的基因(des-hf)第32位氨基酸残基由甘氨酸(G)突变为带正电荷的精氨酸(R),构成第一个突变体des-hf-MU1;采用同样的方法在des-hf基因的C端加上6个带有正电荷的赖氨酸(K),构成第2个突变体des-hf-MU2.采用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统对上述2个突变体进行表达.抗菌特性表明,抗菌肽突变体对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有较好的抑菌活性.琼脂孔扩散法检测des-hf-MU1和des-hf-MU2的抑菌效价比des-hf分别提高了2.4和8.0倍.酸稳定性试验显示,抗菌肽突变体在pH值为5～6时活性最高,热稳定性试验显示des-hf-MU1和des-hf-MU2 100℃加热10 min后仍具有抑菌活性.显示了两抗菌肽突变体具有良好的应用前景.     

植物源天然产物的抑菌作用、机理及在食品保藏中的应用

食源性致病菌引起的食品安全问题严重威胁着人们的身体健康,已经广泛引起人们的关注,因而如何安全有效地抑制食品中致病菌的生长成为食品领域中的研究热点.研究表明,植物源天然产物具有来源广泛、抑菌谱广、与化学防腐剂相比副作用小等特点,可作为一种天然防腐剂运用于食品中.本文综述了植物源天然产物对食源性致病菌的抑菌活性、机理以及在...     

石榴果皮中抑菌活性物质提取工艺优化(简报)

为了研究石榴果皮中抑菌活性物质的提取工艺,以金黄色葡萄球菌做指示菌,以抑菌圈直径为活性追踪指标,在单因素试验的基础上通过二次回归正交旋转组合设计进行工艺参数优化.结果表明,对石榴果皮抑菌活性物质提取效果的影响大小顺序为:乙醇浓度、提取温度、液固比,提取时间;其最佳提取工艺条件为乙醇浓度60%,液固比10:1,提取温度60℃,提取时间4h.在此优化条件下,石榴果皮提取液抑菌圈直径为16.30 mm.     

不同颜色蚕豆种皮酚类物质组成及抑菌活性研究

为了提高蚕豆加工副产物的综合利用率,筛选天然多酚抑菌剂的功能原料,本试验以5种不同颜色蚕豆种皮为研究对象,比较不同颜色蚕豆种皮中酚类物质的含量、组成及抑菌活性的差异,初步探讨蚕豆种皮中发挥抑菌活性的多酚物质种类。结果表明,5种不同颜色蚕豆种皮中总酚含量为165.94~8 487.62 mg·100g^-1,总黄酮含量为11.26~209.01 mg·100g^-1,花色苷含量为1.08~65.64 mg·100g^-1。紫红蚕豆种皮总酚、花色苷含量最高,黑蚕豆总黄酮含量最高。没食子酸和原儿茶酸为蚕豆种皮中的主要酚酸物质,儿茶素、杨梅素、根皮素及槲皮素为主要的黄酮类物质,矢车菊素、矢车菊素-3-葡萄糖苷、飞燕草素和飞燕草素-3-葡萄糖苷为主要花色苷类物质,且深色蚕豆种皮具有较的高酚类物质含量。抑菌活性结果表明,深色蚕豆种皮对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制能力较强,且总酚、总黄酮含量与沙门氏菌抑菌活性呈显著正相关(P<0.05),而花色苷含量与大肠杆菌抑菌活性呈显著正相关(P<0.05),没食子酸及矢车菊素是发挥抑菌作用的主要物质。综上,深色蚕豆种皮含有丰富的酚类化合物,且具有较高的抑菌活性,本研究为蚕豆种皮综合加工利用提供了一定的理论基础。     

热辅助超声波处理对猕猴桃浊汁的杀菌效果及品质影响研究

针对热杀菌猕猴桃浊汁中营养成分损失严重的问题,本试验对不同热辅助超声波处理工艺参数对猕猴桃浊汁理化特性的影响及杀菌效果进行研究,并优化最佳工艺参数。以猕猴桃浊汁为样品,选取猕猴桃浊汁的理化指标及杀菌率为响应值,以超声功率、超声时间、温度为因素,进行响应面试验,在筛选猕猴桃浊汁理化特征指标的基础上,建立杀菌率及猕猴桃浊汁理化特征指标模型并优化得出最佳工艺参数。结果表明,猕猴桃浊汁的理化特征指标为叶绿素保存率、PPO活性、△E值、糖酸比;最佳工艺参数为:超声功率420 W、超声时间30 min、温度60℃,在此条件下,猕猴桃浊汁的叶绿素保存率为30.99%、PPO活性为19.48 U·mL^-1、△E值为4.43、糖酸比为6.17、杀菌率为95.68%。本研究为热辅助超声波技术应用于猕猴桃浊汁的加工提供了理论依据和技术指导。     

枯草芽孢杆菌SO113分泌蛋白的抑菌作用及抗菌蛋白的分离纯化

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)SO113对水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）有强烈的抑菌作用（表现出一透明抑菌圈）。培养液上清中加入60％饱和度的硫酸铵沉淀所得的蛋白粗提液对热稳定，对链霉蛋白酶E不敏感，对蛋白酶K部分敏感，对中国各稻区白叶枯病菌的7种致病型都有强烈的抑杀作用，蛋白粗提液100℃加热15min后脱盐，经DEAE0－Sepharose Fast Flow柱层析得3个未分开的抗菌活性峰，示吸附部分经CM－Sepharose Fast Flow柱层析，得到1个主活性峰，由于B.subtilis SO113的分泌蛋白对水稻白叶枯病菌表现出良好的广谱抗性以及丰富的抗菌活性峰，因此对其进一步的研究和设法隆编码抗菌蛋白的基因都具有重要意义。     

低共熔溶剂提取核桃青皮多酚工艺优化及其抑菌活性

为了充分利用核桃副产物,减少环境污染,该研究以核桃青皮为研究对象,分别采用不同pH值(3、7、10)水溶液、50%乙醇溶液和低共熔溶剂(尿素/氯化胆碱:DES-UC,草酸/氯化胆碱:DES-OC)提取多酚。首先在温度80℃、液料比25 mL/g、低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvents, DESs)配位剂摩尔比1.0的条件下提取60 min筛选出DES-OC提取效果较好;随后在单因素试验考察的基础上,采用响应面分析法确定了DES-OC提取核桃青皮多酚的优化工艺参数:草酸/氯化胆碱摩尔比1.0、温度85℃、时间62 min、液料比50 mL/g,在此条件下多酚提取量为50.87 mg/g。另外,通过对核桃青皮多酚提取混合溶剂抑菌活性试验的研究,发现DES-OC与核桃青皮多酚混合后对大肠杆菌(E.coli)的抑菌效果较佳,金黄色葡萄球菌(S.aureus)次之,最后为黄青霉(P.chrysogenum)。以上试验结果可为研究开发天然抑菌剂、保鲜剂等提供理论基础,拓宽核桃青皮加工利用途径的同时也为提取农产品副产物中生物活性成分提供新思路。     

鲤鱼精蛋白的提取与抗菌稳定性研究

该文研究了采用超声波技术提取鲤鱼抗菌精蛋白的工艺条件和抗菌稳定性。实验结果表明：采用超声波技术提取鱼精蛋白硫酸用量少,提取时间短。用1.0A强度的超声波和5%的硫酸溶液提取鱼精蛋白,提取时间20 min,能得到较高活性的鲤鱼抗菌精蛋白。并进一步研究了pH值、温度、金属离子和蛋白酶对鲤鱼精蛋白抗菌活性的影响。     

西藏“灵菇”乳的发酵与抑菌机制研究（简报）

根据发酵过程中菌粒中主要微生物数量与发酵乳中主要营养物和产物含量间的关系,分析探讨了西藏"灵菇"乳的发酵机制;考察了不同发酵时期所得发酵乳对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑菌活性,结合化学物质模拟试验揭示了发酵乳的抑菌机制。结果显示,发酵前期,菌粒中的各微生物由于向乳中扩散及生长延滞,数量稍有减少;随着发酵的进行,菌粒中乳酸菌和酵母菌的数量一直处于相对稳定的水平,但醋酸菌含量呈明显的先升后降趋势;在整个发酵过程中,菌粒中的乳酸菌数量一直处于最高水平,其次为酵母菌,醋醋菌数量最少;乳酸是西藏“灵菇”发酵乳中的主要抑菌活性物质;乙酸和乙醇的存在对低浓度乳酸的抑菌活性有增效作用,但当乳酸浓度较高时,这种增效作用减弱。西藏“灵菇”发酵乳的总抑菌效果是微生物与其代谢产物的共同作用结果。     

不同海拔高度和竹龄对黄甜竹叶精油成分及其生物活性的影响

为探究海拔和竹龄对黄甜竹叶精油品质的影响,本研究采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）测定不同海拔高度下新叶和老叶精油的化学成分,并分别采用平板抑菌法和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法测定各竹叶精油的抑菌效果和抗氧化活性。结果表明,黄甜竹叶精油中的成分以烷类、醇类、萜烯类和芳香族化合物为主,中高海拔有利于萜烯类化合物的合成和积累,新叶精油中的醇类、萜烯类和芳香族化合物含量高于老叶。各竹叶精油对干腐病菌（Fusarium）和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）均有抑制效果,海拔越高竹叶的抑菌效果越好,新叶精油的抑菌效果强于老叶。各竹叶精油均表现出较高的抗氧化活性,表现为低海拔>中高海拔、新叶>老叶。本研究结果为黄甜竹叶资源的开发提供了数据支撑和新的利用方向。