HIV—2env基因在大肠杆菌和重组痘苗病毒中的表达

将编码人Ⅱ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－２）ｅｎｖｇｐ１２０（Ｅ１）和ｇｐ３６（Ｅ２）分别克隆到原核高效表达载体ｐＥＴ１７ｂ、ｐＢＶ２２０和真核表达载体ｐ１０、ｐ１６中,构建成８个重组质粒。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证明,在原核表达系统成功地表达了ＨＩＶ－２ｅｎｖ融合蛋白,表达的蛋白分子量分别为３５０００、７００００和５００００,而原核表达质粒ｐＥＴＥ１在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶的３５０００处可见明显的额外蛋白带。经薄层扫描测定,原核系统表达的Ｅｎｖ蛋白（ｇｐ１２０）相对含量为５．８％。在真核细胞中表达的Ｅｎｖ蛋白经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测分析,分子量分别为６００００、５７０００和４２０００。上述表达的Ｅｎｖ蛋白均能与ＨＩＶ－２阳性血清发生特异性反应。重组痘苗病毒可诱导小鼠产生抗ＨＩＶ－２Ｅｎｖ抗体     

HIV—1gag基因重组痘苗病毒的构建的高效表达

Ｇａｇ蛋白是２ Ｉ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）重要的结构蛋白，可诱导机体产生体液和细胞免疫应答。本试验将ＨＩＶ－１不同长度的长末端重复序列（ＬＴＲ）和全长的ｇａｇＯＲＦ置于痘病毒启动子控制下，经过同源重组、红细胞吸附试验筛选和间接免疫荧光试验鉴定，分离了６株重组痘苗病毒。免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）和免疫酶试验检测表明，６株病毒有表达ｇａｇ基因，其中以ｖ１６１．Ｇ△２的Ｇａｇ蛋白表达量最高     

HIV－1gag基因重组痘苗病毒的构建和高效表达

Ｇａｇ蛋白是人Ⅰ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）重要的结构蛋白，可诱导机体产生体液和细胞免疫应答。本试验将ＨＩＶ－１不同长度的长末端重复序列（ＬＴＲ）和全长的ｇａｇＯＲＦ置于痘病毒启动子控制下，经过同源重组、红细胞吸附试验筛选和间接免疫荧光试验鉴定，分离了６株重组痘苗病毒。免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）和免疫酶试验检测表明，６株病毒均能表达ｇａｇ基因，其中以ｖ１６ＬＧ△２的Ｇａｇ蛋白表达量最高，占细胞裂解物上清的５．１９％，相当于１４．７μｇ／１０６细胞，接近杆状病毒的表达产量。重组蛋白主要为ｐ５５ｇａｇ蛋白前体，但也有一部分被加工，生成成熟蛋白ｐ２４ｇａｇ、ｐ１７ｇａｇ及其中间蛋白。表达的重组蛋白可形成病毒样粒子（ＶＬＰ），并可诱导小鼠产生抗Ｇａｇ蛋白抗体     

不同启动子对重组痘苗病毒表达狂犬病病毒糖蛋白基因的影响

以血凝素（ＨＡ）基因为侧翼，将狂犬病病毒糖蛋白基因ｃＤＮＡ置于不同类型的痘苗病毒复合启动子下游，构建了４种表达质粒。重组表达质粒转染已感染ＷＲ株痘苗病毒的ＢＨＫ２１细胞，并通过鸡红细胞吸附试验，筛选、纯化出与表达质粒对应的４组ＨＡ－重组痘苗病毒：ｖＳＦＪ１－１０ＲＶｇｐ，ｖＳＦＪ２－１６ＲＶｇｐ，ｖＲＪ１－１０ＲＶｇｐ，ｖＲＪ２－１０ＲＶｇｐ。经间接免疫荧光试验（ＩＦＡ）鉴定，从４组重组病毒中每组各鉴定出１株阳性重组病毒。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测显示，重组病毒感染的ＢＨＫ２１细胞裂解物上清中有１种蛋白与抗ＲＶＧＰ的ＭｃＡｂ发生特异反应，分子量为６９０００。在重组病毒感染早期，ＲＶＧＰ的表达量以ｖＳＦＪ１－１０ＲＶｇｐ最高；而在感染晚期，则以ｖＳＦＪ２－１６ＲＶｇｐ最高。４株重组病毒免疫小鼠，均能够不同程度地诱导小鼠产生抗ＲＶＧＰ特异性抗体。     

重组痘苗病毒TTVAC7理化特性

探讨重组痘苗病毒TTVAC7的理化特性,对重组痘苗病毒活载体疫苗的规模化生产、保存、运输和净化具有一定的指导意义。将重组痘苗病毒TTVAC7和天坛株痘苗病毒VTT经热、酸、碱、乙醚、氯仿、胰蛋白酶、紫外线照射及超声波破碎处理后,接种于BHK-21细胞,通过测定TCID50观察上述理化因子处理前后TTVAC7和VTT毒价的变化,并分析这些理化因子对TTVAC7和VTT的影响。结果显示,TTVAC7经55℃作用15min,VTT经55℃作用30min即可完全被灭活;在pH值3~9的范围内,pH值的变化不会引起TTVAC7和VTT病毒滴度的显著变化;紫外线垂直距离10、30cm照射病毒液60min,不能完全灭活病毒粒子;对氯仿敏感;经1%胰蛋白酶37℃处理60min,TTVAC7和VTT的病毒滴度下降2个滴度以上;对乙醚不敏感;经40、80Hz的非接触式超声处理60min,TTVAC7和VTT的病毒滴度下降低于2个滴度。结果表明,重组痘苗病毒TTVAC7和天坛株痘苗病毒VTT理化性质相似,均不耐高温,耐酸、碱、乙醚、紫外线及超声波,对氯仿和胰蛋白酶敏感。     

重组辛德毕斯病毒E基因痘苗病毒的构建

为了构建表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒,本研究通过基因重组的方法将辛德毕斯病毒E基因及绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因分别连接至痘苗病毒转移载体pSTK,酶切鉴定得到阳性重组质粒pSTK-SINE-EGFP。采用脂质体转染的方法,将该重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染BHK-21细胞,通过同源重组获得重组痘苗病毒。利用EGFP筛选阳性重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP,收集感染重组痘苗病毒的BHK-21细胞,SDS-PAGE电泳检测辛德毕斯病毒E基因在细胞中的表达情况,Western blot分析表达产物的免疫原性。结果证明辛德毕斯病毒E基因能在重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP中获得表达,且表达产物具有良好的免疫原性。表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒的成功构建,为研制辛德毕斯病毒活载体疫苗奠定了基础。     

金刚烷胺在禽流感病毒M2基因原核表达中的作用

禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)为正粘病毒科A型流感病毒，其基因组是由8个分节段的单股负链RNA组成，分别编码8个不同功能的蛋白，PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M1和M2及非结构蛋白NSl1和NS2。M2基因位于AIV基因组的第7个节段上，包含14～39和728～995两个部分，其初始转录产物在剪切40～727位的内含子后，拼接成成熟的mRNA后翻译成M2蛋白。M2蛋白是禽流感病毒的跨膜蛋白，具有H^ 离子通道的功能，     

重组痘苗病毒载体研究进展

通过同源重组将外源基因插入到痘苗病毒基因组内,以痘苗病毒为载体使外源基因在动物细胞内表达以获得目的蛋白,从而达到免疫接种的目的.痘苗病毒有宿主范围广、允许插入外源基因片段长、可通过多种途径进行接种、能诱导体液和细胞免疫反应及易于增殖生产等优点,在疫苗研制中得到了广泛的应用.以痘苗病毒作为载体表达狂犬病病毒糖蛋白研制成的狂犬病疫苗已经在野生动物狂犬病控制中发挥了巨大的作用,用痘苗病毒研制的艾滋病病毒疫苗也已经进入了临床试验.     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。     

鸡贫血病病毒VP2基因在大肠杆菌中的表达及其特性

将鸡贫血病病毒（chicken anaemia virus,CAV)VP2基因克隆入表达性载体PGEX-5X-3，在大肠杆菌以谷胱甘肽转移酶（GST）融合蛋白的形式获得了表达。以此表达产物免疫小鼠，制备抗CAV VP2的多克隆抗体。通过对CAV感染的MSB1细胞作间接免疫荧光试验（IFA）检测，结果为阳性，这表明表达产物保留了CAV相关的抗原特性，本研究为进一步探索CAV VP2的生物学特性奠定了基础。     

猪瘟病毒E2基因在昆虫细胞中的分泌表达及活性检测

猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）E0和E2囊膜糖蛋白是CSFV主要保护性抗原蛋白，均能诱导机体产生CSFV的中和抗体，保护机体免受强毒的攻击。尤其是E2糖蛋白，既是人们研究CSFV新型疫苗的主要对象，也是建立CSFV血清学检测方法的首选抗原，同时还是研究CSFV抗原变异的主要区域。鉴于E2基因在CSFV感染、复制和免疫方面的重要作用，因此一直是猪瘟病毒研究的热点。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因在家蚕中的表达

传染性法氏囊病病毒（IBDV）能引起以淋巴细胞衰竭为特征的抑制性疾病。IBDV的主要结构蛋白VP2蛋白是主要的宿主保护性抗原，在VP2上的点突变是造成IBDV抗原漂变的主要原因。为研究VP2作为IBDV亚单位疫苗的潜力，本实验将IBDV JD1株的VP2基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，将重组载体pBacPAK-VP2与病毒Bm-Bac-PAK6的线性化DNA共转染家蚕培养细胞，获得重组病毒BacPAK-VP2。DIG点杂交表明重组病毒基因组中含有VP2基因。重组病毒感染家蚕5龄幼虫后，用ELISA、SDS－PAGE和Western blotting检测蚕血淋巴中重组VP2蛋白的相对表达量及免疫反应性。结果表明重组VP2蛋白具有免疫反应性，感染后5－6d在蚕血淋巴中的表达量最高。     

猪瘟病毒E2(gp55)基因在昆虫细胞中的表达

将除去3'端跨膜区的猪瘟病毒E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,获得重组质粒pFBHT-E2,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2基因的重组载体质粒rBacmid-E2,以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒,命名为rvBac-E2.经SDS-PAGE和Western-blot及ELISA等方法检测,结果表明,此E2基因在昆虫细胞中正确表达,表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应.     

痘苗病毒高效表达载体的构建研究

构建了能使重组痘苗病毒在感染早期和晚期高效表达外源基因的痘苗病毒载体，表达效率高于迄今报道的任何一个痘苗病毒载体。应用这种新型痘苗病毒载体表达氯化乙酰转移酶（ＣＡＴ），１０６感染细胞中的最高表达量达６０μｇ左右，占细胞总蛋白的１８％。在病毒感染早期，突变型Ｐ７．５启动子表达ＣＡＴ的量比天然的Ｐ７．５启动子高７倍。     

鸡传染性腔上囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

为了深入研究鸡传染性腔上囊病病毒（IBDV）VP2基因的结构和功能,利用Bac-to-Bac系统研制出含有VP2基因的重组杆状病毒rBac-VP2,将rBac-VP2感染Sf9细胞,并用抗IBDV VP2特异性单克隆抗体经间接免疫荧光试验检测,证实感染重组病毒Sf9细胞能高效表达IBDV VP2基因产物;Western-blotting分析结果表明,VP2基因表达产物的分子质量约为40 ku.     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒SC株gag基因分子克隆与原核表达

克隆山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV)的群抗原基因gag,并通过原核表达系统对gag进行表达研究。参照GenBank中收录的山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)gag基因序列设计1对特异引物,以地方性鼻内腺癌(ENA)山羊鼻内分泌物中病毒RNA为模板,RT-PCR扩增获得目的片段,并将产物连接到pMD18-T载体获得阳性克隆(pMD18-gag)并测序。根据gag基因的ORF设计1对表达用引物进行亚克隆,并将ORF重组到pET-32,重组质粒转化至宿主菌Rostta中,用IPTG诱导表达,对表达的蛋白用SDS-PAGE分析,纯化表达产物,通过ELISA初步分析产物的反应原性。结果显示:克隆获得长2 249 bp的核酸序列(GenBank:HM104174),含有完整的ORF,与已报道的ENTV-2 gag基因的同源性高达87%,氨基酸水平上的同源性高达96.4%。表达产物大小约87 ku,与理论推理一致。采用ELISA方法检测表达产物未能与ENA阳性血清发生特异性反应。结果表明:gag基因在原核系统pET-32/Rostta中得到表达,表达产物与ENA阳性血清不具反应原性。     

鹅细小病毒VP2基因在大肠杆菌中的表达及纯化

将鹅细小病毒 (GPV) VP2基因插入原核表达载体 p PROEX- HTb,获得重组表达质粒 p PROEX- HTb- VP2。将其转化大肠杆菌 DH5α,用 IPTG诱导表达 ,表达菌体蛋白中可产生与预期大小相符的约 72 0 0 0的蛋白。以光密度扫描对该表达产物进行定量分析 ,表达产物约占菌体总蛋白的 14 %。经 His- tag金属螯合层析纯化 ,获得纯度较高的 6 His- VP2融合蛋白。 Western- blot结果表明 ,所得蛋白与鹅抗 GPV高免血清有较好的免疫反应性 ,说明在 VP2的 N端融合 6个组氨酸不影响其与特异抗体结合的活性。     

禽流感病毒HA基因在S2细胞中的表达与鉴定

根据GenBank中发表的禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)序列设计了1对引物并分别引入NotⅠ和NcoⅠ酶切位点,用PCR方法扩增AIV HA基因片段。回收目的基因片段,并用NotⅠ/NcoⅠ限制性内切酶消化,经纯化后,将其定向克隆入果蝇表达载体pMT/B/V5中,构建重组表达载体pMT-HA。测序验证正确后,用脂质体转染法与辅助质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,通过Blasticidin(杀稻瘟素)进行加压筛选,获得了抗性细胞S2-HA。提取S2-HA细胞的基因组DNA,PCR检测目的基因在果蝇S2细胞中的整合与表达。用终浓度500μmol/L的硫酸铜溶液诱导表达,收集无血清的细胞表达上清,样品浓缩后进行SDS-PAGE及Western Blotting检测。结果表明,成功构建了重组表达载体pMT-HA,转染细胞经10 mg/L的Blasticidin筛选及鉴定后获得了稳定表达HA的果蝇S2细胞株。     

马传染性贫血病毒阿根廷流行毒株前病毒gag和gp90基因在马体内的变异分析

为建立美洲马传贫毒株和我国弱毒疫苗株鉴别诊断PCR，对接种马传贫阿根廷流行毒株后马4个发热期（23、40、51和70d）外周血单核细胞前病毒DNA gag基因和gP90基因的核苷酸序列进行了监测，经过序列分析发现4个发热期中前病毒gag基因核苷酸序列变化不明显，变异率在1％之内，表明前病毒gag基因在马体内比较保守，可以作为设计鉴别诊断引物的区域；gp90区的基因变化比较大，核苷酸序列变异率在8％～10％之间，通过对几个发热期核苷酸序列推导氨基酸的分析，可以划分出A1、A2、A3和A44个可变区，但其中A1和A4变异都很稳定，在马体发病的整个过程中均只发生1次变异，而A2区第3个发热期变异后，在第4个发热期又回复了突变。对马传染性贫血病毒阿根廷代表毒株前病毒gag和gp90基因核甘酸序列的动念检测结果表明，马传贫病毒在马体整合为前病毒之后比较稳定，这就为建立PCR鉴别诊断方法提供了依据。     

禽成髓性白血病病毒p27和gag基因的克隆

禽成髓性白血病是由禽成髓性白血病病毒引起的一种禽白血病（Avian Leukosis)。禽成髓性白血病病毒的gag基因具有高度保守性，其编码的群特异性抗原p27是禽白血病病毒所共有的主要核心蛋白，可做为禽白血病的诊断抗原。本实验采用AMV感染鸡胚成纤维细胞（CEF），提取感染细胞总RNA，用随机引物反转录成cDNA，根据已经发表的AMV BAI－A株序列设计两对针对p27基因和gag基因的特异性引物，分别进行PCR，成功地扩出p27基因和gag基因，其片段分别为793bp和2．1Kb。以gag基因的PCR产物为模板，采用p27的特异性引物也成功扩出p27片段。分别将p27,gag基因与pGEM－TEasy载体进行连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，提取质粒，进行酶切鉴定。对含有p27基因的质粒进行测序，结果证明成功克隆了p27基因，间接证明了2．1Kb的片段是gag基因。p27和gag基因的成功克隆为该病的探针诊断和gag基因的表达提供了基础。