传染性支气管炎病毒山东及北京分离株血清型及RFLP基因分型的比较研究

分离并鉴定出山东省不同地区的IBV分离株A、B、C、D和北京分离株F，利用中和试验分别对各分离株及标准株M41、T等进行血清分型。设计一对此物，分别对各毒株的S1基因进行RT－PCR扩增，扩增片段长约1700bp，利用其PCR产物进行HaeⅢ酶切，根据酶切图谱，进行基因分型。结果表明：A、C、D和M41酶切图谱相同，属Mass基因型，分别为900、400和300bp左右的片段；北京F株有4条酶切条带，与4／91基因型不同，分别为1000、300、200和小于100bp左右的片段；B株有4条酶切条带，理论推断与T株相似，分别为700、500、300和180bp左右的片段，可能为同一基因型。血清学分型结果与基因分型结果不符。     

我国鸡传染性支气管炎病毒地方分离株S1基因的RFLP基因分型的研究

采用RT－PCR方法分离得到了五个IBV地方分离株（HN2,HN4,JX1,SC2和SC4）的S1基因片段,并用限制性内切酶HaeⅢ对五个IBV地方分离株S1基因的cDNA进行RFLP分析。结果显示,五个IBV地方分离株S1基因cDNA的HaeⅢ带型与标准毒株M41和Beaudette相同。根据Kwon建立的RFLP分型标准,本试验的五个地方分离株应归属于马萨诸塞血清型。     

传染性支气管炎病毒我国地方分离株病原性和基因分型的比较研究

对来自国内部分地区的６个分离株及３个参考株,以蛋白酶Ｋ－ＳＤＳ法提取其基因组ＲＮＡ,经反转录－聚合酶链式反应扩增了预期的１．７ｋｂ纤糖蛋白Ｓ１基因ｃＤＮＡ。     

RT—PCR和RFLP对我国部分传染性支气管炎病毒分离株分型

用2 对引物分别对4 株传染性支气管炎病毒(IBV)标准毒株(Gray、M41、H120、MA5)和5 株国内地方分离株(KF8、18KF7、QF3、XF7、XF18)进行RT-PCR,结果均获得了与预期大小一致的片段。对此2 种PCR 产物进行了限制性片段长度多态性(RFLP)分析,分别用3 种限制性内切酶(HaeⅢ、HinfⅠ、PvuⅡ)进行酶切,根据不同的酶切图谱将测试的IBV 毒株分为不同的基因型。2 对引物的PCR 产物酶切分型结果基本一致。9 株IBV 毒株分为3 种基因型,即H120、M41、XF7、XF18、MA5 和KF8 属于Ⅰ型,Gray 属于Ⅱ型,QF3、18KF7 属于Ⅲ型     

鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株M基因的分子特征

本实验根据已经发表的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）M基因序列设计并合成一对引物，利用RT－PCR扩增得到了IBM新疆分离株LX4株（HA价为2^7)M基因678bp的片段，将该片段克隆到PUC18载体上，通过对所得到的重组质粒进行酶切分析，PCR鉴定，证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒。采用Sanger's双脱氧末端终止法对插入片段进行核苷酸序列测定，获得了IBV－LX4株M基因的核苷酸序列，利用DNASIS分析软件，将它与GENBANK中发表的15株国外参考毒株相比较，发现核苷酸的同源性（除D1466和DE072外）为85％－92％，氨基酸的同源性为83％－92％，与国内参考株（H52－GD）相比分别为90％和92％，确证我们得到的克隆片段为IBV－LX4株的M基因，且含有两个糖基化位点，9个高度保守的半胱氨酸，三个跨膜区域，与国外的报道一致。     

鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析

对2006-2009年从山西各地疑似传染性支气管炎的病例中分离到的7株IBV地方分离株的核蛋白基因片段进行序列测定及分析。结果发现,7株IBV地方分离株核蛋白基因有5株含有一个长1 230 bp的ORF,其余2株含有1 227 bp,编码410/409氨基酸残基组成的多肽,与常用疫苗株H120推导的氨基酸序列比对发现,存在基因突变现象。与GenBank中的34株国内外分离毒株核蛋白基因推导的氨基酸序列进行比较和分析,系统进化关系显示41株IBV毒株分属于4个群,至少有3个群在我国流行,7个分离株分布在第Ⅳ群中,第IV群大多来自我国的北方地区地方分离毒株,第Ⅱ群来自我国南方地区的部分地方分离毒株,从N基因推导氨基酸进化树上分析可见,我国的IBV地方分离毒株主要分布在第Ⅱ和第Ⅳ群中,具有较明显的地理区域性,可见IBV地方分离株在基因进化关系上形成了自己较为独立的进化群。     

2006-2008年山东鸡传染性支气管炎病毒分离株S1与N基因的分子特征

为了调查2006-2008年山东省鸡传染性支气管炎的分子流行病学特征,应用RT-PCR方法分别扩增了14株传染性支气管炎病毒地方毒株S1基因和N基因,并进行了基因克隆与测序工作.对此14株病毒的S1基因序列利用限制性内切酶HaeⅢ进行了限制性片段长度多态性(RFLP)分析,结果显示可以将IBV毒株分为3种不同的基因型.其中11个毒株与LX4毒株有相同的RFLP分型,2株病毒属于Mass基因型,1个毒株有特异的RFLP分型.并将这些分离毒株与11个参考毒株分别进行了基因与氨基酸系统进化树关系分析.S1基因分析结果显示将这些毒株分成3个基因型,与RFLP分析的分型结果一致.11株病毒同属于LX4类型的毒株,分离毒株核苷酸序列相互之间有95.4%～99.7%的同源性.基因Ⅱ型与疫苗株H120和M41的同源性很高.属于基因Ⅲ型的1个毒株形成了独特的基因型.N基因分析结果表明:12株病毒与LX4属于同一基因型,有着较高的同源性.另2株病毒与疫苗株H120同源性很高.以上分析结果表明:山东省IBV分离株存在较为广泛的基因突变、插入和缺失,同时,IBV毒株间的基因重组也可能是山东省IBV变异株产生的另一主要原因.     

鸡传染性支气管炎病毒中国地方流行株的分离与鉴定

对海南省和广西省的几个发生呼吸罗音、鸡群全群发病、死亡率不高的疑是鸡传染性支气管炎病（IB）的鸡群,进行了病毒分离和鉴定。结果分离到了4株IBV分离株（HaN-1/95、HaN-2/95、GX－1／98、GX-2/98）,并对分离病毒进行了病毒的致病性、病理组织切片、鸡胚矮小化、对NDV的干扰、电镜特征等生物特性鉴定及IBV基因组特异性3′末端非编码区的一段保守序列的RT－PCR和巢氏PCR鉴定。结果表明4株IBV分离株,均能产生呼吸困难、罗音等临床症状;病理组织切片,气管、肾脏等组织表现为上皮细胞受损、固有层充血、出血和淋巴细胞的浸润及组织坏死;对NDV－B1株有明显的干扰作用;其各自的传代物都有明显的致鸡胚矮小化作用;在透射电镜下观察到典型的冠状病毒粒子,多数近似为圆形,直径75-200nm,有囊膜,表面有一圈杆状纤突排列成花冠状,符合IBV的典型特征;基因组3′末端UTR的RT－PCR和巢氏PCR鉴定,4个分离株分别都扩增到293bp和172bp的特异目的片段,通过测序比较毒株间的核苷酸序列同源性在99％以上,与GeneBank中IBV H52等标准株的3′末端UTR的核苷酸序列高度同源。以上结果表明4株分离病毒都是IBV,为下一步的IBV分子流行病学的研究打下了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒地方流行株的分离与鉴定

从山西各地区疑似鸡传染性支气管炎(IB)的病料中,分离到5株鸡传染性支气管炎病毒(IBV)分离株,并对分离病毒进行了病毒形态观察、对鸡新城疫病毒(NDV)的干扰、鸡胚致病性试验、动物回归试验、血凝特性试验、病毒理化特性测定等生物特性鉴定及IBV N基因特异性片段的检测.电镜观察,可见直径为60～120 am,有囊膜及纤突呈冠状排列的病毒粒子;对NDV有明显的干扰作用;分离株的传代物均有明显的致鸡胚矮小化作用;动物回归感染死亡鸡肾脏病变明显,表现肾脏肿大、花斑肾现象,输尿管内充塞大量尿酸盐;无直接血凝性,经1%胰酶处理后可凝集鸡红细胞;分离株对乙醚和氯仿敏感;采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对分离毒株进行扩增,结果均扩增出特异N基因核酸片段.     

PCR／PFLP鉴别伉禽白血病病毒

用PCR方法从禽白血病病毒（avian leukosis virus,ALY）亚群毒株RAV－1、RAV－2感染或未感染的SPF鸡胚成纤维细胞（CEF）分别扩增出1．2kb基因手段。RAV－1囊膜基因可初BglⅡ分为2条相近的600bp片段，RAV－2囊膜基因被BamHI分为2条约600bp片段，对照组基因片段（内源性病毒）不被BglⅡ和BamHI切割。结果显示，ALV囊膜基因PCR／RFLP可用于诊断禽白血病和鉴别不同的AVL毒株。     

上海地区鸡传染性支气管炎病毒S2基因的检测及分析

参考GenBank发表的传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）S基因序列，设计合成了1对引物，模拟PCR表明，该引物能扩增现已发表的所有IBV的S2基因部分核酸序列，扩增片段493bp。建立的RT—PCR检洲体系检测灵敏度达10～50ELD50，检出限量为0．1ng。采集上海地区12个鸡场疑似IBV禽样品34份进行检洲，阳性为32份，序列分析表明均为肾变型IBV S2基因片段，S2基因同源性较高（≥99％），与其他地区肾变型IBV也有较高同源性，而与腺胃型和呼吸型相比较，序列差异较大。进化分析表明，尽管IBV S2片段变异率明显低于S1基因，但二者表现相同的进化趋势，S2基因亦可反映出IBV的分子变异及毒株间的亲缘关系。     

鸡传染性支气管炎病毒血凝谱

用鸡传染性支气管炎病毒标准毒株Ｈ５２、Ｍ４１、Ｔ、Ｎ１１５、ＩＢＶ６２株及国内华中（ＨＺ）、华东（ＨＤ）、华南（ＨＮ）、华北（ＨＢ）、东北（ＤＢ）及西北（ＸＢ）等地方性分离株试验,研究ＩＢＶ血凝特性。结果表明,ＩＢＶ不直接凝集鸡、牛、兔、小白鼠、仓鼠、猪、鹅、马、绵羊及人的“Ｏ”型红细胞;１％胰蛋白酶３７℃作用ＩＢＶ４ｈ后,可凝集鸡、兔、小白鼠、仓鼠、鹅等动物红细胞;１０％乙醚３７℃作用ＩＢＶ２ｈ后,可凝集鸡、牛、小白鼠、仓鼠、鹅、绵羊及人的“Ｏ”型红细胞;１％卵磷脂酶Ｃ３７℃作用ＩＢＶ４ｈ后,可凝集鸡、兔、小白鼠、仓鼠、鹅等动物红细胞。     

一株肾型鸡传染性支气管炎病毒的初步分离鉴定

从哈尔滨市某肉鸡养殖场疑似传染性支气管炎的病死鸡中分离到1株肾型IBV,并对其进行鸡胚矮小化、血凝性、电镜下特征、新城疫干扰试验、致病性等生物学鉴定和N基因的RT-PCR鉴定。结果表明,该病毒分离株在鸡胚上传至第四代(F)4开始出现死亡或侏儒胚;病毒不凝集鸡红细胞;透射电镜下可见多呈球形、直径约80～120nm的病毒粒子,具有冠状病毒的典型形态特点;该病毒可干扰新城疫LaSota株在鸡胚中的增殖;将分离毒第4代尿囊液接种于6日龄雏鸡,7d后开始出现死亡,死亡率高达67%(6/9),病死鸡剖解后可见肾脏明显肿大、苍白,具有传染性支气管炎的典型病变;分离毒第5代尿囊液经N基因特异性RT-PCR获得大小约438bp的目的片断。初步确定所分离病毒为肾型IBV。     

PCR结合分子杂交法检测鸡传染性支气管炎病毒

利用逆转录－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）特异性扩增鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）基因组中Ｍ基因和Ｎ基因之间一段核酸片段。以ｐＵＣ１９质粒载体将此片段克隆，用ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切此重组质粒，回收克隆片段后，制成生物素标记的核酸探针。用ＲＴ－ＰＣＲ及生物素核酸探针法分别对ＩＢＶ，ＩＢＤＶ，ＩＬＴＶ，ＭＤＶ及ＮＤＶ进行检测，结果证明该方法为ＩＢＶ特异性检测方法。对人工感染ＩＢＶ的ＳＰＦ鸡口腔棉拭样品进行跟踪检测，证明本方法能在ＳＰＦ鸡接毒后１～１０ｄ内检出ＩＢＶ。     

PCR-RFLP方法在蛔虫种间鉴别上的应用

研究应用PCR－RFLP方法初步鉴别了4种不同蛔虫。从猪蛔虫、人蛔虫、犬弓首蛔虫及鸡蛔虫中分别提取基因组DNA，通过PCR扩增得到长度分别约为450bp、450bp、530bp、550bp的PCR产物。经与国外报道相比较，确认完整扩增出4种蛔虫的第二内部转录间隔区（ITS－2）片段。PCR产物经限制性内切酶HaeⅢ和Hinf I酶切鉴定，通过产生的特异性片段首先可以区分犬弓首蛔虫与鸡蛔虫。通过对4种蛔虫的基因组DNA进行扩增，得到长度分别约为980bp、980bp、1050bp、1070bp的PCR产物。经与国外报道相比较，确认完整扩增出4种蛔虫的ITS－1、ITS－2及5.8S核糖休DNA。PCR产物经限制性内切酶HaeⅢ酶切鉴定，通过产生的特异性片段可以区分出猪蛔虫与人蛔虫。通过PCR－RFLP分析，初步推测猪蛔虫与人蛔虫仍为两个独立虫种，但尚需进一步研究确认。     

陕西省鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从临床表现呼吸道传染病的20个发病鸡群中先后分离出18株病毒,通过鸡胚感染、血清学试验、分子生物学试验、动物回归试验证明其中13株是冠状病毒科的鸡传染性支气管炎病毒,3株为新城疫病毒,2株为H9禽流感病毒。该13株中的BJ2、FF2、YL2、B01、G5、YX、WH、WG分离毒具有很强的嗜肾性和致病力,这8个陕西流行株的血清型与W118毒株相同,而与IBVGray株、W93株有一定的差异。结果表明,陕西地区主要流行鸡肾型传染性支气管炎,且流行株具有强致病力。     

禽流感、新城疫、传染性支气管炎三联没乳剂灭活疫苗的研制

以禽流感病毒（AIV）H5N4株，新城疫病毒（NDV）LaSota株与传染性支气管炎病毒（IBV）M41株为抗原研制了AI－ND－IB三联油乳剂灭活疫苗，并对疫苗的物理性状，安全性，免疫效力，保存期及抗体消长规律进行了检测，结果表明，疫苗在免疫后3周后6个月内，对AIV－H5N4，NDV－北京株的攻击均获全部保护，在免疫后52周内，免疫鸡箅清中AIV－N5N4，MDV，IBV的HI抗体也保持较高的水平，疫苗在4℃保存15个月，其免疫力没有下降。