嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫后大鲵外周血免疫指标的变化

以福尔马林灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)作为免疫原(F-AH), 通过腹腔注射免疫健康大鲵(Andrias davidianus), 分别于免疫后的第1、4、7、14、21、28天采集血液样品, 进行大鲵外周血液的血细胞计数与白细胞组成分析, 测定吞噬细胞的吞噬活性以及血清中和抗体效价, 于免疫28 d后进行攻毒感染试验。结果表明, 与对照组相比, 在免疫后第4、7、14和第21天, 免疫大鲵外周血中血细胞数量显著增加, 其中, 红细胞和白细胞数量均于第4天达峰值, 分别为7.83×10⁷个/mL和6.74×10⁶个/mL; 嗜中性粒细胞百分比也在第4天达峰值, 为28.60%, 单核细胞百分比在第7天达峰值, 为10.53%; 吞噬细胞活性显著提高, 且吞噬百分比和吞噬指数均在第4天达到最高值, 分别为34.09%和3.73。随后, 淋巴细胞百分比和中和抗体效价显著增加, 均在第21天达峰值, 分别为75.30%和1︰426.67。攻毒感染实验结果表明, 免疫组的相对免疫保护率为69.23%。由此可见, F-AH免疫原能够通过促进血细胞数量的增加、吞噬细胞吞噬活性增强以及特异性抗体的产生等方式提高大鲵的免疫保护力。

     

嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫施氏鲟后的免疫应答反应与保护效果

为了研究嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫施氏鲟(Acipenser schrenckii Brandt,1869)后的免疫应答反应与保护效果,本研究采用福尔马林灭活法制备嗜水气单胞菌灭活疫苗。通过腹腔注射途径免疫健康施氏鲟,对施氏鲟外周血的红细胞和白细胞数量、白细胞组成、吞噬活性、吞噬指数、血清酸性磷酸酶活性、血清溶菌酶活性、血清中和抗体效价等免疫指标及疫苗保护效果进行测定。结果显示,免疫组红、白细胞数量迅速上升,于免疫后第4天达峰值,分别为(8.50±0.17)×10~8个/mL和(8.96±0.44)×10~6个/mL;单核细胞和嗜中性粒细胞分类百分比于第7天达峰值,分别为10.50%和15.53%,极显著高于对照组(P0.01),淋巴细胞分类百分比在第21天才达峰值73.51%;吞噬指数和吞噬百分比均于第4天达到最高值,分别为4.53和30%;血清中溶菌酶活性和酸性磷酸酶活性分别在免疫后第7天和第14天达到峰值,极显著高于对照组(P0.01);血清抗体效价于免疫后第21天达到峰值1:203,极显著高于对照组(P0.01)。攻毒感染实验结果表明,免疫组的相对免疫保护率为76.84%。由此可见,嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫施氏鲟后,能够显著诱导施氏鲟体内的免疫应答反应,增强鱼体的免疫保护能力。本研究为养殖鲟因嗜水气单胞菌感染引起疾病的免疫预防技术研究奠定了前期基础。     

白鲢对嗜水气单胞菌疫苗的免疫应答

用嗜水气单胞菌9120株制备了鱼类出血性败血症疫苗。用该疫苗分二组对白鲢进行免疫，检测免疫后白鲢血清中的抗体水平，其中加佐剂免疫组获得了较高滴度的凝集抗体，不加佐剂免疫组产生的凝集抗体滴度较低，但用间接血球凝集试验可以检出。     

嗜水气单胞菌疫苗免疫效果研究

选取对鲤鱼毒力强的嗜水气单胞菌菌株制成灭活疫苗,研究疫苗的免疫保护效应.采用甲醛灭活制备疫苗,分别对鲤鱼进行注射和浸泡试验,测定白细胞吞噬活性、淋巴细胞转化能力、血清、皮肤黏液的抗体效价及活菌攻毒后的免疫保护率.结果表明,受免鱼各项指标均明显高于对照组,注射组免疫保护率达90%,其中浸泡组各项略低于注射组.嗜水气单胞菌灭活疫苗对鲤鱼有显著免疫保护效应,可作为预防细菌性败血症感染的疫苗.     

蜂胶佐剂对异育银鲫嗜水气单胞菌灭活疫苗的免疫增强试验

本文就蜂胶佐剂对鱼类细菌性疫苗的免疫增强作用进行了首次评价。试验以异育银鲫嗜水气单胞菌灭活疫苗为对象,比较了蜂胶佐剂、铝胶佐剂和无佐剂三种疫苗对银鲫的免疫效果。经抗体监测表明,免疫接种后第2周,蜂胶佐剂组银鲫已检测到血清抗体,随后抗体效价迅速上升,第4周达到峰值2^5：铝胶佐剂组和无佐剂组第3周检测到抗体．铝胶佐剂组第5周达到峰值2^5,无佐剂组第4周达到峰值2^4。银鲫免疫后第5周进行攻毒保护试验,发现蜂胶佐剂组、铝胶佐剂组和无佐剂组的免疫保护率分别为77．3％．65．0％和56．3％。试验结果表明,蜂胶佐剂能有效增强异育银鲫细菌性灭活疫苗的免疫保护力。     

嗜水气单胞菌灭活苗对林蛙免疫效果的初步研究

用分离于患红腿病的长白山中国林蛙的嗜水气单胞菌,采用热灭活的方法制成嗜水气单胞菌灭活苗,通过不同的途径免疫接种林蛙,通过测定受免林蛙血清中凝集抗体效价,探讨林蛙对热灭活的嗜水气单胞菌菌苗的免疫应答状况.结果表明,受免林蛙血清中凝集抗体效价可达到27,明显高于对照组.通过检测免疫林蛙的免疫保护率发现受免林蛙中口服免疫组、浸泡免疫组、腹腔注射组、肌肉注射组的免疫保护力可达71%、76%、59%、47%.     

大鲵嗜水气单胞菌全菌灭活苗的初步研制

腹水病为人工饲养的大鲵的主要疾病之一,其主要致病菌为嗜水气单胞菌.嗜水气单胞菌是一种条件性致病菌,能引起多种动物的疾病,该病原菌涉及面广,传播迅速,发病率和致死率均很高,给人类和养殖业造成了严重的危害。     

嗜水气单胞菌灭活疫苗对虹鳟免疫力和抗病力的影响

为研究嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)灭活疫苗对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)(250 g±12 g)免疫力和抗病力的影响,给试验鱼腹腔注射0.2 mL的灭活嗜水气单胞菌悬液(1.0×108cfu/mL)。分别在注射前(0 d)和注射后7、14、21、28、35、42 d取样,测定血液白细胞吞噬活性、血清溶菌酶(LZM)活力、补体C3含量以及头肾和脾脏中IgM、IgT基因表达情况。结果表明:注射嗜水气单胞菌疫苗能显著提高白细胞吞噬率(PP)和吞噬指数(PI)、LZM活力和补体C3含量,注射后21 d达峰值,PI、LZM和补体C3在42 d仍显著高于对照组。免疫后21 d头肾和脾脏中IgM基因上调表达,35 d达峰值(分别上升24倍和26倍),42 d下降但仍极显著高于对照组。头肾和脾脏中IgT的上调表达比IgM弱得多,头肾35 d达峰值(上升6.2倍),脾脏28 d达峰值(上升6.1倍)。免疫42 d后嗜水气单胞菌攻毒结果表明,嗜水气单胞菌灭活疫苗对虹鳟有较高的免疫保护作用,免疫保护率达到71.43%。     

银鲫对嗜水气单胞菌灭活菌苗的免疫应答研究

以绵羊红细胞为载体,建立了检测银鲫血清抗体的间接血球凝集试验。用该方法研究了银鲫对嗜水气单胞菌灭活菌苗的免疫应答一般规律。研究结果表明,疫苗免疫组在免疫７天后可以测到血凝抗体,２１天达到高峰值４０９６,然后开始下降,３５天时抗体滴度降为１６。加弗氏不完全佐剂疫苗免疫组亦在７天时可以测到血凝抗体,２１天达到１０２４,３５天时为２０４８,抗体维持在较高的水平。对鱼体免疫后的保护力进行测定,结果表明,两个免疫组分别在７天左右和１４天左右开始产生保护力。免疫保护力在鱼体免疫初期随着抗体滴度的增加而加强,随后在一段时间内保持在较强的水平,并不随抗体滴度的下降而减弱。浸泡免疫试验的结果亦表明,银鲫可以通过浸泡免疫获得免疫保护力。     

嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila无毒活性株免疫技术研究

用１／１０－１／１００浓度的无毒活性株肉汤原液０．１－０．２ｍｌ／尾注射接种链、镛、鲤、鲫、鳊等鱼种，强毒株攻击时保护力在９０％以上，与全细胞灭活苗无显著差异；用２－３％浓度的无毒活性株肉汤原液在有增渗增效剂的溶液中浸泡接种鲢、镛、鳊等鱼种，强毒株攻地保护力也都在７０％以上，与注射接种差异不显著。 互     

十六种中草药及其复方对大鲵致病性豚鼠气单胞菌的体外抑制作用

应用二倍稀释法测定了诃子、五倍子、石榴皮等16种中草药及其复方对大鲵(Andrias davidianus)致病性豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度,应用棋盘法设计16种中草药组合的120种双联复方和10种中草药组合的120种三联复方,评估了复方的体外抑菌作用。结果表明:16种中草药对大鲵致病性豚鼠气单胞菌均有一定程度的抑菌作用,抑菌作用强弱依次为诃子、五倍子、石榴皮、大黄、槐角、覆盆子、黄芩、金樱子、肉苁蓉、丁香、川牛膝、赤芍、知母、防风、天葵子及罗汉果;在120个中草药双联复方中,5.8%为显著协同作用,82.6%为协同作用,11.6%为相加作用;在120个中草药三联复方中,29.2%为显著协同作用,87.5%为协同作用。因此,合理的中草药配伍能提高对大鲵致病性豚鼠气单胞菌的体外抑菌作用。     

褐牙鲆腹水症病原菌的分离鉴定及其灭活疫苗的研制

从患腹水病褐牙鲆体内分离致病菌,通过生理生化和分子生物学方法进行鉴定;该菌的16S rDNA序列与标准株同源性达99.8%,证明该菌为嗜水气单胞菌.制备灭活疫苗后分别注射小鼠和牙鲆,测定其免疫效果.试验结果表明,用所制备的灭活疫苗免疫小鼠,其保护率达到90%,免疫牙鲆的保护率达到80%;采用渗透压差法浸泡免疫牙鲆在攻毒后发病率仅为6%,攻毒后保护率为85%;通过间接ELISA检测表明受免动物体内产生了较高水平的抗体;剖检及病理切片结果表明免疫过的动物内脏健康无异样,而未免动物肝脏充血,肠腔有积水.说明该疫苗安全有效.     

口服嗜水气单胞菌生物被膜疫苗的动物免疫试验

将热灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)生物被膜(biofilm,BF)菌苗和浮游(freecell,FC)菌苗口服免疫小鼠和剑尾鱼,通过测定抗体效价、相对保护率、小鼠的淋巴细胞转化和肠道sIgA浓度,评价免疫效果。免疫20d后,BF菌苗组50尾剑尾鱼的相对保护率为68%;FC菌苗组为42%。BF菌苗组12只小鼠的相对保护率为70%;FC菌苗组为50%;对照组为17%。BF菌苗组小鼠外周血淋巴细胞转化率是7.28、FC菌苗组为3.87、对照组为2.36。BF菌苗组小鼠肠道sIgA浓度是1.22μg/mL;FC菌苗组为0.73μg/mL;对照组为0.465μg/mL。免疫30d后,小鼠的血清凝集抗体达到最高,BF组抗体达128:1,FC组为32:1,对照组为2:1。各组间差异显著(P<0.01)。结果表明,BF菌苗较FC菌苗能更有效地刺激机体的免疫系统,尤其是肠道淋巴组织的免疫应答,对剑尾鱼和小鼠具有较好的保护力。     

维氏气单胞菌弱毒株FS12001及其疫苗对鲫鱼的免疫效果

为探究由维氏气单胞菌（Aeromonas veronii,简称Av）弱毒株FS12001制备的疫苗对异育银鲫（Carassius auratus gibelio,gibel carp）免疫效果。采用Av弱毒株FS12001制备活疫苗、灭活疫苗、ISA763A-灭活疫苗和蜂胶-灭活疫苗腹腔注射免疫异育银鲫,同时设ISA763A佐剂、蜂胶佐剂及0.65% NaCL作为对照组。于免疫后 1、3、5、7和 14 d经实时荧光定量 PCR 法检测脾脏组织中 IgM、IL-1β及LZM的基因表达量;于免疫后 7、14、21、28、42和 48 d尾静脉采血分离血清,检测抗体IgM,SOD和LZM活性;于免疫28 d 后用2株不同来源的Av强毒株分别攻毒各组实验鱼,连续观察记录7 d,计算各免疫组的相对保护率。结果显示,各免疫组脾脏组织中IgM、IL-1β及LZM的基因表达量高于对照组,且ISA763A-灭活疫苗组和蜂胶-灭活疫苗组的表达量显著高于其他各实验组。各疫苗免疫组血清特异性抗体水平均显著高于0.65% NaCL对照组和佐剂对照组。各疫苗免疫组的LZM活性均在28 d最高,灭活疫苗组、ISA763A-灭活疫苗组及蜂胶-灭活疫苗组SOD活性均在7 d 最高。菌株AVCA07攻毒后,活疫苗组、灭活疫苗组、ISA763A-灭活疫苗组和蜂胶-灭活疫苗组的RPS 分别为 63%、56%、100%、60%;菌株YC170511攻毒后,以上4个免疫组RPS分别为59%、55%、93%、72%。研究表明用弱毒株FS12001制备的几种疫苗,注射免疫异育银鲫后均可增加脾脏中 IgM、IL-1β及LZM的基因表达量,提高血清抗体水平,增强SOD和LZM酶活性,增强其抵抗Av感染的能力。本研究为运动性气单胞菌败血症疫苗研发做储备,为该病的预防和控制技术提供依据。     

嗜水气单胞菌对鲫三项血液指标的影响

用嗜水气单胞菌(浓度9×108CFU/mL)感染健康鲫(剂量为0.3mL/尾),4d后观察鲫的发病情况,并对鲫三项血液生化指标进行测定。结果表明:感染鲫表现出典型的嗜水气单胞菌引起的败血症症状,与对照组比较甘油三酯含量极显著下降,总蛋白含量显著下降,而谷丙转氨酶活性极显著升高。     

鲜饵不同投饵率对2–5龄大鲵(Andrias davidianus)生长的影响

为探寻大鲵(Andrias davidianus)的适宜投饵率,在水温为18-19℃、pH为8.0和溶氧为6.0 mg/L的工厂化养殖条件下,用鲜饵分别投喂了2、3、4和5龄大鲵各60 d.比较了各实验组体重增加量、全长增加量、饵料系数、平均增重率、特定生长率和饵料转化率等生长指标.结果显示,2龄大鲵的投饵率为2.0％时,其饵料系数均显著低于投饵率为1.7％、2.6％、2.9％的组,其平均增重率和饵料转化率均显著高于投饵率为1.7％、2.3％、2.6％、2.9％的组,其特定生长率均显著高于投饵率为1.7％、2.6％的组(P＜0.05);3龄大鲵的投饵率为2.2％时,其饵料系数均显著低于投饵率为1.9％、2.5％、2.8％的组,其平均增重率和特定生长率均显著高于投饵率为1.6％、1.9％、2.5％、2.8％的组,其饵料转化率均显著高于投饵率为2.5％、2.8％的组(P＜0.05);4龄大鲵的投饵率为2.3％时,其饵料系数均显著低于投饵率为1.7％、2.0％、2.9％的组,其平均增重率和特定生长率均显著高于投饵率为1.7％、2.0％、2.9％的组,其饵料转化率均显著高于投饵率为1.7％、2.9％的组(P＜0.05);5龄大鲵的投饵率为2.5％时,其饵料系数显著低于投饵率为1.9％的组,其平均增重率和特定生长率均显著高于投饵率为1.9％、2.2％、2.8％、3.1％的组,其饵料转化率均显著高于投饵率为2.2％、2.8％、3.1％的组(P＜0.05).为使大鲵的饵料系数较低,平均增重率、特定生长率和饵料转化率较高,研究表明,2、3、4和5龄大鲵的适宜投饵率分别为2.0％、2.2％、2.3％、2.5％;随着大鲵年龄的增加,适宜投饵率呈逐渐增加的变化规律,关系式为y=0.000212x+2.07 (r2=0.8797).     

Stability comparison of three candidate internal reference genes in Chinese giant salamander (Andrias davidianus)

The Chinese giant salamander (Andrias davidianus) as food and medicinal product has been an important aquaculture object in China. Study of gene function in the Chinese giant salamander requires accurate normalization though the use of appropriate reference genes. In this study, the expression levels of three candidate reference genes including β‐actin, GAPDH and cytb of different tissues, different developmental stages and different challenges in Chinese giant salamander were evaluated by qPCR. The stabilities of these three reference genes were analysed by geNorm, NormFinder and BestKeeper software. The results showed that the expression of GAPDH was more stable than that of β‐actin and cytb in four tissues and at two developmental stages of Chinese giant salamander. Compared with GAPDH and cytb, β‐actin was the most stable in spleen of Chinese giant salamander treated with LPS or GSIV. Therefore, the result showed that GAPDH was the suitable reference gene in different tissues and at different developmental stages of Chinese giant salamander. The β‐actin could be used as a reference gene in spleen of Chinese giant salamander challenged with LPS and GSIV. This study provides convincing information for the GAPDH and β‐actin as suitable reference gene in Chinese giant salamander of different tissues, different developmental stages and different challenges respectively.