鲁西地区猪胸膜肺炎放线杆菌流行病学调查

1材料与方法 1．1材料 1．1．1病料及鼻拭子。疑似传染性胸膜肺炎猪的肺病料186份以及545份无临床症状健康猪鼻拭子均来自鲁西地区的22个猪场。     

二温式PCR检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌方法的建立与应用

为了探索简便、快速确诊猪传染性胸膜肺炎的方法,根据猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)apx IV基因序列,设计合成1对特异性引物,建立聚合酶链反应(PCR)检测APP的方法。采用该方法对APP和其他6种猪病病原核酸进行检测,结果只对APP扩增出与预期大小相符的422bp DNA片段,而对其他6种猪病病原核酸的扩增结果为阴性。该PCR最低可检出10pg的APP DNA。对送检的46份可疑病猪组织进行检测,结果有19份样品为阳性,27份为其他病原感染。     

某规模猪场H-PRRS和APP混合感染的诊治

四川省蒲江县某个规模化猪场60~80日龄猪只345头相继发生疾病,经流行病学调查、临床诊断、病理解剖疑似高致病性繁殖障碍与呼吸综合征(H-PRRS)与传染性胸膜肺炎(APP)混合感染,实验室细菌学、血清学检验,确诊为猪传染性胸膜肺炎(APP)感染,采集30头病猪血清样品采用RT-PCR方法检测,结果22份血清(占73%)高致病性繁殖与呼吸综合征(H-PRRS)阳性,猪瘟检测全部阴性;采取病猪肝、脾组织6份进行实验室细菌培养鉴定,结果存在传染性胸膜肺炎感染;结果表明,该猪场发生HPRRS和APP混合感染,采取综合治疗措施后,取得较好治疗效果。     

猪肺炎支原体PCR检测方法的建立及初步临床应用

根据GenBank中猪肺炎支原体（Mhp）J株P36蛋白基因（登录号X67286）的核苷酸序列设计1对引物,建立了快速检测Mhp的PCR方法。该方法能扩增出948bp的Mhp特异性条带,其敏感性达到可检测出0．735ng的MhpDNA,但对鸡毒支原体、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒均未检测出相应目的条带;将克隆获得的目的片段与GenBank已发表的MhpJ株的P36基因进行比较,同源性达到99．9％。采用所建立的PCR方法对42份疑似猪支原体肺炎（MPS）病料进行临床诊断,发现有13份呈阳性（31．0％）。可见,该PCR方法适合于MPS的临床诊断,可为其防控提供可靠依据。     

猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅡ主要抗原表位区原核表达及其间接 ELISA 方法的建立

[目的]以原核表达的重组蛋白作为检测抗原,建立间接 ELISA方法用来检测猪血清中APP抗体。[方法]将猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅡ主要抗原表位区基因片段克隆至原核表达载体 pET-28a（＋）,构建重组质粒 pET-ApxⅡA1。将重组质粒转化至宿主菌 BL21（DE3）中进行表达。通过 Western-blot分析重组蛋白免疫原性。用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立检测猪 APP抗体的间接 ELISA方法,并优化反应条件,确定抗原的最佳包被量和血清的最佳稀释度。[结果]经 PCR双酶切及测序鉴定,重组质粒构建成功,诱导表达纯化后,重组蛋白可被 APP阳性血清特异性的识别,表明表达产物具有良好的免疫原性。用纯化的重组蛋白初步建立了检测 APP抗体的间接ELISA方法,用该方法与商品化 ApxⅣ抗体检测试剂盒分别对94份临床非免疫血清样品进行检测,结果两者的符合率为90.4%。[结论]所建立的间接 ELISA 方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疫苗免疫效果评估提供了技术手段。     

猪接触传染性胸膜肺炎临床感染血清学检测研究

[目的]总结河南省猪接触传染性胸膜肺炎的流行病学规律。[方法]2006年1月至2007年12月份历时2年,郑州牧业工程高等专科学校附属兽医院对来诊的未进行传染性胸膜肺炎疫苗接种的1 169头猪随机采血,进行猪传染性胸膜肺炎抗体水平检测。[结果]平均阳性率为21.55%,同时在被检猪中又进行了猪瘟、圆环病毒、蓝耳病、伪狂犬病、弓形体等疾病感染的检测,证实猪传染性胸膜肺炎与病毒性、细菌性、寄生虫性疾病有着不同程度的混合感染。[结论]猪在发生一种或几种传染病的情况下,由于机体抵抗力的下降,往往可以继发多种疾病。     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白基因（0MP-1）的克隆、表达及其ELISA方法的建立

猪传染性胸膜肺炎由猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）引起,是猪最重要的呼吸道传染病之一。通过筛选APP3～8kb随机基因组文库,获得1株阳性克隆。测序拯救质粒得到其DNA序列,通过BLAST分析确定此片段为APP外膜蛋白基因,预计成熟蛋白质的分子量为48．766kD。根据序列设计特异性引物,用PCR扩增该基因,分子克隆表达该外膜蛋白。Western blot结果表明,该蛋白与APP康复期血清发生反应。纯化该重组蛋白,并将其作为抗原包被ELISA酶标板,对已知阳性血清、阴性血清和临床送检血清样品进行ELISA检测,为最终建立APPELISA检测方法奠定了基础。     

猪传染性胸膜肺炎的ApxIV-ELISA检测方法

[目的]建立一种敏感性好、简便快捷,适用于临床诊断、实验室检测和血清学调查的诊断技术,为规模化养猪场监控胸膜肺炎放线杆菌(APP)感染及净化猪传染性胸膜肺炎(PCP)提供技术支撑.[方法]以ApxIV重组蛋白为抗原,建立ApxIV-ELISA检测方法,经可行性、特异性、准确性、重复性检验后,对采自广西南宁周边地区随机抽取的未免疫APP疫苗育肥猪与经产母猪进行血清抗体检测.[结果]经试验证实,以ApxIV-ELISA检测APP具有可行性,且具有特异性良好、准确性较高、重复性较好的特点,其判断标准:S(样品孔OD630nm)≥0.397为阳性,S<0.397为阴性.以ApxIV-ELISA检测的90份血清样品中有40份为阳性,阳性率为44.4%;其中经产母猪阳性血清33份,占总阳性血清的82.5%.[结论]广西南宁周边地区的养猪场已普遍存在APP感染,特别是经产母猪较严重.采用ApxIV-ELISA检测方法能及时鉴别诊断猪群的APP感染情况,且敏感性好、简便快捷,适用于临床诊断、实验室检测和血清学调查.     

猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌多重PCR检测方法的建立和应用

根据已发表的猪呼吸道疾病主要致病菌猪链球菌(SS)、胸膜肺炎放线杆菌(APP)和副猪嗜血杆菌(HPS)基因序列合成3对特异性引物,通过单一PCR和三重PCR体系及条件优化,建立这3种致病菌的三重PCR检测方法,并对200份临床表观健康猪鼻拭子样品用三重PCR方法进行检测。结果显示:建立的三重PCR方法能对同一样品中的SS、APP、HPS 3种病原菌的DNA模板进行扩增,无交叉反应;对猪体内常见的猪多杀性巴氏杆菌、猪大肠杆菌、猪放线杆菌、猪葡萄球菌、猪丹毒杆菌、猪沙门氏菌进行扩增,并无任何扩增产物;对SS、APP、HPS细菌纯培养物的检测敏感性分别为1×10~4CFU/ml、1×10~3CFU/ml、1×10~3CFU/ml;对人工模拟SS、APP、HPS感染组织样品的敏感性均为1×10~4CFU/ml。三重PCR方法对200份临床表观健康猪鼻拭子样品的检测结果显示:SS阳性160份,阳性率80.0%;APP阳性3份,阳性1.5%;HPS阳性45份,阳性22.5%。分别用细菌分离法和三重PCR法对30份临床病料进行检测,两者检测结果的符合率达到93%。建立的三重PCR可在4.5 h左右得到检测结果。     

猪传染性胸膜肺炎的综合防制技术

猪传染性胸膜肺炎,是由胸膜肺炎放线杆菌引起猪的一种高度接触传染性、致死性呼吸道传染病。本病病原为胸膜肺炎放线杆菌（APP）。     

猪轮状病毒与猪传染性胃肠炎病毒混合感染的实验室诊断

[目的]对海南省某猪场腹泻病死仔猪病原进行实验室诊断。[方法]通过临床症状观察与病理剖检,结合RT-PCR方法和病毒的分离培养进行病原鉴定。[结果]经过RT-PCR扩增,获得了PRV和TGEV阳性目的片段;应用MA-104细胞与PK-15细胞分别进行PRV与TGEV的分离培养后,可见典型的细胞病变,经过RT-PCR进一步鉴定最终确诊为PRV和TEGV混合感染。[结论]通过采用紧急接种和保守治疗等综合防治措施,获得了较好的防控效果。     

猪NCOA1基因PCR-RFLP多态性分析

[目的]研究猪NCOA1基因的PCR-RFLP多态性,为猪的分子育种和标记辅助选择提供理论依据。[方法]以81头山东寿光六和原种猪场的长白猪为研究对象,采取常规酚-氯仿抽提法从猪耳组织提取基因组DNA,以基因组DNA为模板进行PCR扩增获得440bp的NCOA1基因目的片段,利用限制性内切酶RsaⅠ对PCR产物进行酶切和琼脂凝胶电泳检测,并计算各等位基因频率和基因型频率。[结果]琼脂糖电泳检测酶切产物出现3种基因型：AA型（1条带：440bp）、AB型（3条带：440、282、158bp）、BB型（2条带：282、158bp）;基因型频率分别为0.54、0.43和0.03;A和B2个等位基因的基因频率分别为0.76和0.24。[结论]该研究猪群中,A为优势等位基因,AA基因型频率较高。     

13/17罗伯逊易位猪CMYA3基因多态性分析（摘要）（英文）

[目的]对13/17罗伯逊易位杂合子猪[2n=36,rob（13;17）]互交后代中的148个体进行CMYA3基因的多态性分析。[方法]采用PCR-RFLP方法分析CMYA3基因在13/17罗伯逊易位猪群中的多态性。用酚-氯仿抽提法从猪耳组织中提取基因组DNA。以基因组DNA为模板进行PCR扩增,反应体系为25μl：dNTPs 2μl,上下游引物各0.5μl,Taq酶1 U,模板DNA1μl,用ddH2O补足至25μl。PCR反应条件为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,53℃退火45 s,72℃延伸30 s,共35个循环;72℃延伸10 min。PCR产物经PCR纯化试剂盒纯化,限制性内切酶Bsh1236 I 37℃酶切过夜后,1%琼脂糖凝胶电泳,检测酶切结果。[结果]通过PCR扩增所有个体均能获得507 bp的目的片段,PCR产物经限制性内切酶Bsh1236I酶切,琼脂糖凝胶电泳结果表明该基因在此群体中具有A和B 2个等位基因,基因频率分别为0.699和0.301,具有AA、AB和BB 3种基因型,基因型频率分别为0.615、0.169和0.216。因此,在该试验猪群中,A为优势等位基因,AA基因型频率最大。[结论]该研究为13/17罗伯逊易位猪的分子育种和标记辅助选择提供了理论依据。     

2种玉米胚乳DNA提取方法的比较

[目的]筛选出玉米胚乳DNA提取的最佳方法。[方法]采用改进的CTAB提取液,以高温和常温2种方法提取玉米胚乳基因组DNA,用紫外分光光度计、0.8%水平的琼脂糖凝胶电泳及PCR检测法比较了2种方法的提取效果。[结果]高温法所提玉米胚乳DNA浓度和纯度均达到分子生物学要求,而常温法所提DNA的纯度未达到分子生物学的要求。电泳检测表明,高温法提取的DNA均未降解,DNA条带整齐度较好,而用常温法提取的DNA都出现了降解。PCR检测结果表明,用高温法提取的DNA作模板的PCR所得条带清晰,明亮,而用常温法提取的DNA作模板的PCR条带不清晰。最佳聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)的浓度确定为玉米籽粒重的6%~10%。[结论]高温法更适宜用作玉米胚乳DNA提取。     

亚洲猫β-干扰素基因的克隆与分析

[目的]为猫干扰素类生物制品的研究奠定基础。[方法]根据NCBI上的猫IFN-β基因序列,设计1对特异引物。以从病死猫肝脏组织中提取的基因组DNA为模板,进行PCR扩增。将扩增产物回收后,与pUCm-T载体连接,并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。通过PCR和双酶切对获得的质粒DNA进行鉴定后,进行序列分析和核苷酸、氨基酸序列同源性的比较。[结果]经PCR扩增,可获得一条561 bp的特异性条带。猫IFN-β基因已成功重组到载体中,获得阳性克隆。序列分析结果表明,亚洲猫IFN-β基因长561 bp,编码186个氨基酸,与已报道的猫IFN-β基因同源性达99.82%,而氨基酸序列未改变。[结论]该研究成功克隆了猫IFN-β基因,为进一步利用基因工程技术生产重组猫IFN-β基因及其生物学功能的研究奠定了基础。     

猪NCOA1基因PCR-RFLP多态性分析（摘要）（英文）

[目的]研究猪NCOA1基因的PCR-RFLP多态性,为猪的分子育种和标记辅助选择提供理论依据。[方法]以81头山东寿光六和原种猪场的长白猪为研究对象,采取常规酚-氯仿抽提法从猪耳组织提取基因组DNA,以基因组DNA为模板进行PCR扩增获得440 bp的NCOA1基因目的片段,利用限制性内切酶RsaⅠ对PCR产物进行酶切和琼脂凝胶电泳检测,并计算各等位基因频率和基因型频率。[结果]琼脂糖电泳检测酶切产物出现3种基因型：AA型（1条带：440 bp）、AB型（3条带：440、282、158 bp）、BB型（2条带：282、158 bp）;基因型频率分别为0.54、0.43和0.03;A和B 2个等位基因的基因频率分别为0.76和0.24。[结论]该研究猪群中,A为优势等位基因,AA基因型频率较高。     

仔猪人工感染猪传染性胃肠炎病毒的病理分析

[目的]研究猪传染性胃肠炎（TGE）在仔猪体内的发病规律,为猪传染性胃肠炎的防治提供理论依据。[方法]将猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）JL分离株口服接种1周龄仔猪,10TCID50/只。应用RT-PCR方法检测发病和死亡仔猪的粪便处理液;采取病猪心脏、肝脏、胃、肺脏、肠管,制成病理组织切片,观察病理组织学变化。[结果]接种动物48h后出现典型的传染性胃肠炎临床症状,表现为短时间呕吐,伴有黄色水样腹泻和脱水。剖检发现肠管扩张,充满液体,小肠壁变薄。PCR结果为TGEV阳性。十二指肠近端黏膜绒毛轻微萎缩变短,远端绒毛明显缩短;上皮细胞脱落,呈浆液性或卡他性炎症。空肠、回肠绒毛显著萎缩,肠黏膜皱褶减少,大肠出血,并见卡他性炎症。胃壁变薄,淤血,出血。肺脏表现为间质性肺炎病理变化。[结论]攻毒仔猪表现出典型的TGE病理组织学变化。     

转绿色荧光蛋白标记基因猪整合检测的研究

[目的]为转基因猪生产的整合效率、外源目的基因表达水平、目的基因在猪体内组织特异性表达分布等相关领域的进一步研究奠定基础。[方法]用显微注射法将GFP标记的转基因猪表达载体PM1导入湖北白猪和通湖猪1-细胞、2-细胞胚胎中,胚胎移植妊娠后生产仔猪,取耳或尾组织样提取基因组总DNA,用PCR法检测PM1在猪基因组中的整合情况。[结果]在所有生产的78头仔猪中,有6头猪用PCR检测为转PM1基因阳性猪,这6头猪在3次PCR扩增反应中都得到650 bp目的扩增片段。其他样品没有得到目的扩增片段的为阴性猪。[结论]载体PM1可以用于携带外源基因进行转基因猪生产。     

北京地区种猪氟烷基因分布的研究

[目的]了解北京地区种猪群氟烷基因（Haln）的分布状况。[方法]采用PCR-RFLP对北京地区公猪站、种猪场共计609头种猪进行氟烷基因检测。[结果]公猪站大白猪、长白猪、杜洛克、皮特兰的Haln基因频率分别为0、17.11%、5.56%和18.75%;种猪场大白猪、长白猪、杜洛克的Haln基因频率分别为4.52%、11.68%和23.33%。[结论]该研究结果为合理利用氟烷基因提供依据。