部分蔬菜CMV分离物CP基因的克隆及序列分析

 对来自国内不同地区、不同蔬菜作物上的8个黄瓜花叶病毒分离物, 采用一步法RT-PCR扩增得到CP基因全长片段, 分别克隆到pMD-18T载体并测序。结果表明, 本研究8个分离物的CP基因均为657个碱基, 可编码218个氨基酸, 它们之间的核苷酸序列同源性较高, 达92.8% ～99.1%; 将它们与GenBank中部分CMV CP基因序列比较, 显示出与CMV亚组Ⅰ株系的核苷酸序列同源性达90.7%～98.0%, 而与亚组Ⅱ株系的核苷酸序列同源性仅有75.8%～78.1%。因此, 这8个分离物应归属于CMV亚组Ⅰ。     

苹果茎沟病毒KRL-1分离物外壳蛋白基因序列测定

以KRL-1(库尔勒香梨分离物)总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增外壳蛋白(CP)基因的cDNA片段,将其克隆到pMD18-T载体上。通过序列测定,分析结果表明:KRL-1CP基因由714个核苷酸组成,编码237个氨基酸。KRL-1与ASGV其它分离物CP基因的核苷酸同源性为90%-93%,氨基酸同源性为94%-98%。根据KRL-1与其他分离物CP基因序列和生物学症状上的差异,可推断KRL-1存在较大的分子变异。     

潍坊萝卜中芜菁花叶病毒分离物的分子特性及CP基因的表达

 从表现红心病的潍坊萝卜块根上得到一芜菁花叶病毒( Turnip m osaic virus, TuMV) 分离物(TuMV-Ra) , 通过RT-PCR获得了该分离物的外壳蛋白(CP) 基因, 对其进行了序列测定, 并将其核苷酸序列及推导出的氨基酸序列与GenBank中登录的其它20个TuMV萝卜分离物的相应序列进行比较和分析。结果表明, TuMV-Ra与这20个分离物CP基因核苷酸序列的同源性为89.9% ～99.0% , CP氨基酸序列同源性为94.8%～99.7%; 其中与中国浙江杭州萝卜的两个分离物HZLB1、HZLB2同源性最高, 核苷酸序列的同源性为98.7%和99.0% , 氨基酸序列同源性为99.0%和99.7%。TuMV-Ra与1999年从表现相同症状的潍坊萝卜得到的分离物CHINA-WF CP基因核苷酸同源性为93.66% , 氨基酸同源性为96.53% , 说明病毒发生了比较大的变异, 而且变异的位点主要在CP的N末端。将TuMV-Ra CP基因克隆到原核表达载体pET-22b ( + ) , 在大肠杆菌BL21 (DE3) 中表达出分子量为38 kD的融合蛋白。Western blotting分析证明TuMV-Ra CP在大肠杆菌中得到了正确表达。     

滇黑两省黄瓜花叶病毒南瓜分离物外壳蛋白基因序列分析

 利用免疫捕捉多聚酶链式反应( Immuno-Capture PCR, IC-PCR) 方法从南瓜的两个黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV) 云南分离物(CMV-YN) 和黑龙江分离物(CMV-HLJ ) 中扩增获得约700 bp的外壳蛋白(Coat protein, CP) 基因片段, 并克隆到pGEM-T载体中。核苷酸序列测定表明, CMV-HLJ和CMV-YN两个分离物CP基因长为657 bp, 编码219个氨基酸, 两个分离物的核苷酸和氨基酸同源性分别达到96.8%和97.4%。和国外CMV亚组Ⅰ 6个分离物核苷酸序列同源性在90%以上, 氨基酸同源性在97%以上, 和亚组Ⅱ 6个分离物的同源性分别为66.4%和73.4%。和国内亚组Ⅰ10个分离物的核苷酸同源性都在89.5%以上, 氨基酸同源性在93%以上, 而和亚组Ⅱ两个分离物的同源性分别为68.3%和73.5%。序列分析结果表明CMV-HLJ和CMV-YN两个分离物属于CMV亚组Ⅰ。     

北京地区不同品种草莓种苗中草莓轻型黄边病毒的检测与分析

以产自北京地区的36个品种的草莓种苗为试材,采用田间调查和RT-PCR方法,研究草莓轻型黄边病毒(SMYEV)在不同品种草莓种苗上的影响,以期为草莓品种选育和推广工作提供参考依据。结果表明：采集的431株草莓种苗中检出SMYEV阳性样品30份,病毒检出率为6.96%。其中,8个品种的草莓种苗中检出SMYEV,检出率为6.5%～23.1%,而其他28个品种均未检出。通过基因克隆、序列测定和比对分析,获得3个北京分离物的SMYEV外壳蛋白(CP)核苷酸序列,北京分离物BJHY253与美国草莓分离物WSU1988CP基因序列的同源性为98.63%;北京分离物BJHYZ83与阿根廷草莓分离物Berra-2CP基因序列的同源性为99.04%,北京分离物BJLYN与中国福建草莓分离物FJ2 CP基因序列的同源性为98.63%。通过对不同草莓品种中的SMYEV进行检测分析和序列测定,发现SMYEV在不同品种草莓种苗中的检出率存在差异,北京地区草莓种苗中SMYEV序列具有多样性,属于不同的株系,这些结果可以为草莓的田间生产和病毒防控提供数据支持。     

荔枝败育胚S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长扩增和序列分析

 从荔枝‘桂味’的败育胚中提取总RNA，利用GeneRacer^TM Kit将RNA经去磷酸化反应、去mRNA的帽子结构及RNA Oligo连接，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，分别用SSH分离得到的胚败育相关差异表达s一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的部分cDNA序列(599 bp)设计出3’和5’端基因特异引物，进行PCR末端扩增。荔枝败育胚的s一腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列全长为1515 bp，编码393个氨基酸，与其它物种的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的核苷酸序列同源性在79%~82%之间，氨基酸序列同源性在88%～91%之间。结果表明所获得的基因为与荔枝胚败育相关的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因。关键词：     

山东省芋花叶病毒病的田间调查及鉴定

为明确芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,Ds MV)在山东芋种植区的发生和遗传进化,在山东潍坊、青岛、烟台、日照和临沂等5个芋主栽区进行调查,对采集样品进行病毒病病原鉴定、序列分析和遗传进化分析。结果显示,芋花叶病毒的检出率为55.9%,在5个地区皆有分布。5个Ds MV分离物cp基因的核苷酸序列相似性为88.5%~91.9%,氨基酸序列相似性为93.4%~97.5%;与国内外已报道代表性Ds MV分离物cp基因的核苷酸与氨基酸的序列相似性分别为74.8%~99.4%、79.7%~99.1%。遗传进化分析显示,Ds MV山东分离物与日本分离物(Ds23)、中国分离物(ND和ZAN)和美国分离物(Ds MV-U2)亲缘关系较近,聚在同一分支。综上,Ds MV在山东省芋主栽区发生普遍,其cp基因序列之间变异相对较大。     

中国柑橘叶斑驳病毒和碎叶病毒发生状况及其分子特性研究

柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)和柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)均可侵染柑橘的不同种。为明确CLBV及CTLV在中国柑橘上的发生状况和分子特性,采用RT-PCR技术对来源于中国7个省的342份和346份柑橘样品进行检测,检出率分别为9.6%和11.0%。对14个CLBV分离物和15个CTLV分离物的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因部分序列分析显示,CLBV分离物间cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为82.1%~100%和88.1%~100%,CTLV分离物的cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为89.5%~100%和92.5%~100%。测定的14个CLBV分离物在系统进化树中聚为2个组;而CTLV分离物分组不明显,该病毒的系统进化与寄主来源无明显关系。     

贵州辣椒叶脉黄化病毒分离物检测及其P0、CP、MP基因进化分析

为明确辣椒叶脉黄化病毒（Pepper vein yellows virus,PeVYV）在贵州辣椒上的发生分布及其分子变异情况。用RT-PCR法对采自贵州省25个采样地点的548份辣椒疑似病毒病样品进行检测。结果表明：129份为阳性样品,检出率为23.54%。将获得的14个不同采样点PeVYV分离物和已报道的中国和其他国家PeVYV分离物进行序列比对,P0基因核苷酸同源性为90.9% ~ 100.0%,氨基酸相似性为97.7% ~ 100.0%;CP基因核苷酸同源性为93.7% ~ 100.0%,氨基酸相似性为97.9% ~ 100.0%;MP基因核苷酸同源性为94.7% ~ 100.0%,氨基酸相似性均为100.0%。在系统进化树中,有13个采样点PeVYV分离物P0基因聚在一起,与中国分离物（KP326573）的亲缘关系较近,而遵义播州PeVYV分离物与澳大利亚分离物的亲缘关系较近。贵州所有PeVYV分离物CP基因与中国、澳大利亚、美国和西班牙分离物聚为一支,但不同采样点的PeVYV分离物又聚为两个不同的分支。而不同采样点MP基因全部聚在一起,且与其他地区PeVYV分离物的差异不明显。研究结果表明贵州辣椒上不同地区PeVYV分离物具有一定的分子差异,存在遗传分化现象。     

月季切花乙烯受体ETR1 cDNA克隆及其序列分析*

 根据乙烯受体基因ETR1 保守区设计引物, 分别以瓶插寿命差异显著的月季切花品种‘德克萨斯’和‘维亚蒂’为材料, 通过RT-PCR 从花瓣中扩增出了797 bp 的cDNA 片段, 它编码265 个氨基酸。测序和序列分析表明,‘德克萨斯’重组质粒中插入片段的核苷酸序列之间完全相同, 命名为pRT-ETR1。而‘维亚蒂’所获得的重组质粒中插入片段的核苷酸和氨基酸序列之间存在差异, 同源性分别为85. 2 %和92. 1 % , 分别命名为pRV-ETR1-V4 和pRV-ETR1-V5。pRV2 ETR12V5 的核苷酸和氨基酸序列与‘德克萨斯’pRT2 ETR1 的同源性均达99 %以上; pRV-ETR1-V4 中的核苷酸和氨基酸序列与‘德克萨斯’pRT-ETR1 的同源性分别为85. 0 %和92. 5 %。上述插入片段与桃、苹果、天竺葵、拟南芥等植物的ETR1相应区域高度同源, 其氨基酸同源性均大于90 %。     

莲藕GBSS基因cDNA全长的克隆与序列分析

采用RT-PCR结合RACE技术,扩增得到全长为2265bp的莲藕＂美人红＂品种的GBSS基因的cDNA序列（GenBank登录号EU938541）,其中开放阅读框（ORF）长为1848bp,共编码615个氨基酸。用DNAman软件比对,莲藕GBSS基因cDNA与金鱼草（AJ006293）、马铃薯（EU403426）、大豆（EF153101）、水稻（EU735072）Wx基因cDNA序列的同源性分别达61.2%、59.6%、64.2%、50.6%。对该基因编码的氨基酸序列进行Blastp分析发现,该序列与金鱼草的序列同源性最高,达到77%,与马铃薯、甘薯的同源性达到75%,与豆科植物的同源性在70%～75%,与禾本科植物的同源性在65%～70%。     

月季（Rosa chinensis）丁香酚合成酶基因RcEGS1的克隆及其表达分析

 根据GenBank 发表的丁香酚合成酶（EGS）基因的蛋白保守序列设计引物,利用RT-PCR结合RACE-PCR 技术,从古老月季（Rosa chinensis）品种‘月月粉’盛开期的花瓣中获得了1 个新的丁香酚合成酶基因RcEGS1,GenBank 登录号为JQ522949。该基因全长为1 171 bp,开放阅读框（ORF）951bp,编码317 个氨基酸;蛋白质理论分子量为35.64 kD,等电点为7.36。氨基酸同源性分析表明,RcEGS1与矮牵牛PhIGS1 的氨基酸同源性达到70%,与罗勒ObEGS1 的同源性为59%,与月季RhEGS1 的同源性仅为48.2%。运用实时荧光定量PCR 法分析RcEGS1 在不同组织部位和不同开放时期花瓣中的表达,发现其在叶片和茎段中没有表达,在花瓣和萼片中有表达,在盛开期的花瓣中表达量最高。     

Sequence analysis and prokaryotic expression system construction of PIA genes isolated from Neisseria gonorrhoeae

AIM: To analyze the nucleotide and putative amino acid sequences of PIA genes isolated from N.gonorrhoeae and to construct the prokaryotic expression system of PIA gene.METHODS: The entire PIA genes from 9 strains of N.gonorrhoeae were amplified by using high fidelity PCR.The target amplification fragments were sequenced after T-A cloning.Homology comparison of the nucleotide and putative amino acid sequences of PIA genes from the isolates with the reported sequences in GenBank was then performed.A prokaryotic expression system of PIA gene was constructed.Different dosages of IPTG were applied to induce the expression of the target recombinant protein (rPIA) and 10% SDS-PAGE plus Bio-Rad Agarose Image Analysor was used to determine the expression level of rPIA.rPIA was extracted using Ni-NTA affinity chromatography and the purified effect was detected by SDS-PAGE.RESULTS: In comparison with the reported PIA gene sequences (GenBank No: L19962),the homologies of nucleotide and putative amino acid sequences of PIA genes from the isolates were 99.6%-100% and 99.1%-100%,respectively,which indicated that all the isolates were belonging to serovars IA6.Output of rPIA was as high as 50.1% of the total bacterial proteins.The purified rPIA only showed a single target protein fragment in gel.CONCLUSION: Serovar IA6 is dominant in the local N.gonorrhoeae isolates and sequences of the encoding gene are relatively conserved.The constructed prokaryotic expression system is able to express rPIA with high efficiency,which may lay a foundation for further development of serological detection kit and vaccine of N.gonorrhoeae.     

马铃薯Y 病毒河北分离物外壳蛋白基因序列分析和株系鉴定

 对河北张家口感病马铃薯的一个马铃薯Y病毒分离物( PXY-HBEI) 的外壳蛋白基因进行了克隆和序列分析。以提取的RNA为模板, 应用RT-PCR扩增目的基因, 扩增产物克隆到质粒pGEM-T, 上并序列分析。结果表明, 克隆cDNA片段由801个核苷酸组成, 编码267个氨基酸。与基因库中PVY代表株系相比, 它们的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.6%～98.8%和93.3% ～98.5% , 与PVYN 和PVYO株系的氨基酸序列同源性分别为93.6%和97.8% , 确定PVY-HBEI归属于普通株系( PVYO株系) , 同时建立了快速、灵敏、简便的PVY RT-PCR检测方法。     

芜菁二氢黄酮醇4–还原酶基因的克隆与功能鉴定

二氢黄酮醇4–还原酶（dihydroflavonol 4-reductase,DFR）是花青素生物合成晚期阶段的关键酶,属于NAD/NADP依赖型还原酶家族,催化从二氢黄酮醇转变成无色花色素苷的反应。利用UV-A处理‘津田’芜菁（‘Tsuda’turnip）和‘赤丸’芜菁（‘Yurugi Akamaru’turnip）块根24 h后提取总RNA,通过RT-PCR方法分别克隆了‘津田’芜菁BrDFR1和‘赤丸’芜菁BrDFR2基因。BrDFR1和BrDFR2的开放读码框分别为1 158 bp和999 bp,分别编码385和332个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BrDFR1和BrDFR2与大白菜DFR具有高度同源性,从第8到第302位氨基酸的肽段具有FR_SDR_e结构域。BrDFR1和BrDFR2基因组全长序列均含有5个位置与序列完全相同的内含子。Southern杂交结果显示,‘津田’芜菁BrDFR1和‘赤丸’芜菁BrDFR2基因均为单一拷贝。UV-A可以诱导BrDFR1基因表达,对BrDFR2基因表达的诱导效果不明显。BrDFR1和BrDFR2基因在大肠杆菌细胞中可以表达并纯化出分子量约为42.8 kD的BrDFR1蛋白和37.5 kD的BrDFR2蛋白。过量表达BrDFR1和BrDFR2基因的烟草花色加深。芜菁DFR基因的RNAi载体遗传转化烟草后,转基因植株的花色变浅。这些工作将为阐明依光型和非依光型花青素生物合成机理奠定研究基础。     

柑橘及其近缘属植物LFY同源基因的比较

LFY基因处于成花调控网络的关键位置,不仅调控开花时间和花转变,而且在花序和花的发育中也起重要作用。为了进一步探讨柑橘及其近缘属植物开花的分子机理,利用PCR技术分别从兴津温州蜜柑(Citrus unshiuMarcovitch)、无核椪柑(Citrus reticulata Blanco)、沙田柚[Citrus grandis(L.)Osbeck]、融安金柑(Fortunella crassifoliaSwing)和无核黄皮[Clausena lansium(Lour.)Skeels]叶片中分离克隆了LFY全长同源基因。结果表明兴津温州蜜柑、无核椪柑、沙田柚、融安金柑和无核黄皮中的LFY全长同源基因的核苷酸长度分别为2090、2086、2092、2081、2089bp,分别编码398、398、398、398和397个氨基酸,这些同源基因均由3个外显子和2个内含子组成。同源性分析发现,这些LFY全长同源基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性高,分别为92%～99%和95%～100%。亲缘关系分析结果与当前的植物学分类结果一致。     

甜菜BvCK2基因全长cDNA的克隆和序列分析

甜菜M14品系在细胞胚胎学和遗传学特征上具有鲜明的无融合生殖现象。为了寻找在这一特殊的生殖过程中的相关基因及其调控作用．实验通过同源克隆及cDNA末端快速扩增（RACE）的方法,首次从甜菜M14品系中克隆了与生殖相关的基因ByCK2（Beta vulgaris casein kinase2）的全长cDNA序列．长度为1501bp,开放阅读框为1002bp,编码333个氨基酸。根据氨基酸序列计算蛋白分子量为39．28kDa,pI=8．16。同源比对表明,ByCK2与烟草CK2（Ge．nBankNo．A1437635）的相似度为64.22％,与百合CK2（GenBankNo．AF517838）的相似度为65．18％。通过细胞内定位分析．ByCK2所编码的蛋白主要存在于细胞核中。     

白菜Pol胞质雄性不育系和保持系蕾期基因表达差异的SRAP分析

将SRAP技术用于基因差异表达研究, 用30对SRAP引物组合对白菜Pol胞质雄性不育系和保持系的cDNA进行扩增, 得到两条特异片段BcCMS1、BcCMS2。对特异片段克隆测序分析后发现, BcCMS1与大白菜细胞生成相关染色体的19个氨基酸有63%的相似性, BcCMS2与芥蓝抑制开花的基因FLC3部分碱基有88%的相似性。这两个序列在GenBank中的登录号分别为DQ914921、DQ914922。此结果显示在胞质雄性不育中细胞质基因改变了部分核基因的表达。