羊泰勒虫可视化LAMP检测方法的建立

为了建立1种快速简便的羊泰勒虫检测方法,试验根据羊泰勒虫MPSP基因设计2组引物,建立羊泰勒虫环介导等温扩增(LAMP)检测方法,利用该方法分别检测羊泰勒虫、瑟氏泰勒虫、卵形巴贝斯虫、附红细胞体的DNA。结果：LAMP方法检测羊泰勒虫的结果为阳性,其他虫体均为阴性,具有较好的特异性;对羊泰勒虫DNA最低检测量为1.9×10^-9 ng/μL,是PCR方法的100倍。分别利用LAMP、PCR检测30份疑似羊泰勒虫感染病例,LAMP方法阳性检出率为20%(6/30),PCR方法阳性检出率为16.67%(5/30),LAMP方法准确率高于PCR方法。结论：建立的羊泰勒虫可视化LAMP检测方法特异性好、准确率高,可作为羊泰勒虫病诊断的检测方法。     

羊流产衣原体间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

以羊流产衣原体特异性外膜蛋白POMP90a为诊断标识,将其纯化后作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法。试验的最佳反应条件为:最佳抗原浓度度为2μg/mL,血清抗体稀释度为1∶20,封闭液和稀释液用含0.5%BSA的PBST,酶标二抗稀释度为1∶5 000。由于传统的IHA试剂盒只能检测衣原体目,对于其种属不能区别,该方法比IHA适合确诊流产衣原体。因此,该研究建立的羊流产衣原体间接ELISA抗体检测方法具有良好的稳定性和可重复性,并具有较高的特异性和敏感性。     

狂犬病病毒LAMP检测方法的建立及初步应用

针对狂犬病病毒基因Ⅰ型核蛋白保守区设计4条识别靶序列上6个位点的特异性引物,在链置换聚合酶(Bst酶)作用下,60℃恒温1 h内完成扩增。反应特异性强、灵敏度高。扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳、显色反应或浊度比较进行判定。通过对反应条件的优化,病毒基因的的最低检出量可达到101拷贝数。该方法可用于狂犬病病毒的实验室检测和临床初步诊断。     

沙门氏菌LAMP检测方法的建立

The assay was aimed to establish a rapid, sensitive and specific method of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for the detection of Salmonella. According to the highly conserved STN gene of Salmonella reported in GenBank, we designed a set of primers, and then followed by a series of LAMP optimization of reaction conditions, specificity test, sensitivity test, stability test and enzyme test. The sensitivity of LAMP and conventional PCR were compared.The results showed that the optimal reaction temperature of LAMP was 65 ℃, when only amplification of Salmonella, the minimum detectable concentration was 10¹ CFU/mL, which was more than conventional PCR detection by one order of magnitude. The results showed that LAMP method had the qualities of specificity, high sensitivity, short time-consuming and convenience for the detection of Salmonella, which was expected to develop into an effective method     

绵羊肺炎支原体LAMP检测方法的建立及初步应用

针对绵羊肺炎支原体(Mo) 16S rRNA基因设计4条环介导等温扩增(LAMP)引物,通过优化反应条件与体系,建立了Mo检测LAMP方法,并对其进行特异性、敏感性及临床应用性检测.结果显示,于60℃保温60 min即可最优化检测Mo,且所建方法仅能特异扩增Mo,最低检出分子拷贝数为1.0×102copies/μL,具有良好的特异性和敏感性.对4份已知阳性病料进行LAMP检测均为阳性,表明所建LAMP可初步应用于临床检测,为羊Mo感染病例诊断提供了新方法.     

肝螺杆菌LAMP快速检测方法的建立及初步应用

根据肝螺杆菌fla B基因保守区域设计一组特异性引物,经过条件优化、特异性和敏感性分析,成功建立了肝螺杆菌LAMP快速检测方法。结果显示,建立的LAMP扩增方法仅能检测出肝螺杆菌,其他常见细菌未见特异性扩增。检出肝螺杆菌最低模板量为86.9fg/L,是普通PCR所需模板量的1/10。本研究建立的LAMP快速检测方法具备操作简单、特异性好、灵敏度高的优点,结果易于观察,对仪器设备要求低,适宜推广应用。     

沙门氏菌LAMP可视化检测方法的建立

为实现沙门氏菌的快速现场检测,根据沙门氏菌invA基因编码区序列,设计合成1套引物,通过对反应物浓度和反应条件优化,建立了沙门氏菌属特异性LAMP检测方法;通过对invA基因8个区域的6条引物配对进行等温扩增,并在反应体系中加入HNB来指示反应结果,实现了反应的快速闭管检测。灵敏度试验显示,建立的方法可以检出稀释至3.6×10~1 CFU/mL菌液所提取的DNA;特异性试验显示,建立的方法与大肠杆菌DNA、志贺氏菌DNA、布鲁氏菌试管凝集抗原DNA、炭疽沉淀抗原DNA以及猪链球菌2型DNA不发生交叉反应,但能检出鸡白痢、禽伤寒沙门氏菌凝集抗原以及马流产试管凝集抗原提取的DNA;重复性试验显示,3个稀释度菌液DNA的3次重复检测均为阳性;应用试验显示,从经增菌培养的200份进境猴粪拭子样品中检出阳性2份,与细菌分离鉴定检测结果一致。结果表明,所建立的方法敏感性和特异性较高,重复性满足实际要求,可用于进境动物样品的沙门氏菌检测。     

真鲷虹彩病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种检测真鲷虹彩病毒的环介导等温扩增(LAMP)方法,满足口岸、养殖场对该病的快速监测的需求,本研究比对分析了Gen Bank中公布的真鲷虹彩病毒基因组序列,筛选其主要衣壳蛋白MCP基因保守区序列,进行LAMP引物设计,建立了真鲷虹彩病毒LAMP检测方法。对扩增条件进行优化,确定最佳反应条件为62℃,45 min。灵敏度试验结果显示,该方法最低检测限为100拷贝/μL目的基因。特异性试验结果显示,该方法不与流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、蛙病毒3型(FV3)、甲鱼虹彩病毒(STIV)发生交叉反应。结果表明,本研究建立的LAMP方法具有良好的敏感性和特异性。对5份疑似真鲷虹彩病毒感染的临床样品进行检测,发现检测结果与世界动物卫生组织(OIE)推荐的PCR方法检测结果符合率为100%。研究表明,本方法具有灵敏度高、特异性强,以及仪器设备简单、操作便捷、结果直观等优点,非常适合作为初筛手段,应用于养殖场、口岸等一线的疫病监测。     

猪流感病毒LAMP检测方法的建立

本试验针对猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）NP基因保守区域设计并合成6条引物,建立了SIV的环介导等温扩增（LAMP）检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法可特异性检测H1N1、H1N2、H3N2、类禽H1N1亚型SIV及甲型H1N1流感病毒,但不能检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、日本乙型脑炎病毒;该方法的最低检测量为100拷贝/μL质粒DNA。结果表明建立的LAMP方法具有较高的敏感性和特异性,可用于SIV的快速检测。     

沙门菌LAMP检测方法的建立

建立了一种沙门菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法。依据GenBank公布的沙门菌属fimY基因序列,利用Primer Explorer V5软件设计LAMP扩增所需引物,通过LAMP反应条件的优化,建立沙门菌LAMP快速检测方法,并对其特异性和敏感性进行了评价。结果表明,针对fimY基因建立的LAMP方法具有较强的特异性,最低可检出浓度为56×102CFU/mL,灵敏度高于PCR方法 10倍。     

沙门菌LAMP检测方法的建立

为动物产品沙门菌快速检测提供技术支持,针对沙门菌属特异性的侵袭蛋白(Invasion protein,invA)基因设计2对引物,建立了一种环介导等温扩增(Loop-mediated iso?thermal amplification,LAMP)方法。对优化后的LAMP方法进行了特异性检测、灵敏度检测及沙门菌人工污染鸡蛋内容物检测。结果表明,该LAMP法可快速、特异地检测出沙门菌。LAMP法对细菌培养物检出限为8.7×100cfu/mL,对人工污染鸡蛋内容物中沙门菌的检出限为9.5×100cfu/mL。该方法有望用于鸡蛋中沙门菌的快速检测。     

沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立

为实现沙门氏菌的快速检测,根据沙门氏菌特异性invE、hilA、invA、hut基因编码区序列,分别设计合成4套引物,通过对引物筛选和反应条件优化,建立了以invA特异性基因设计合成为引物的沙门氏菌环介导等温扩增检测方法。本方法对沙门氏菌定性检测灵敏度可达到101CFU/mL (细菌浓度),其灵敏度比普通PCR高10倍且反应结果易于观察。以6种沙门氏菌和8种非沙门氏菌细菌DNA为模板进行LAMP扩增检测,并无交叉反应。结果显示,设计的LAMP引物组和建立的沙门氏菌的LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、费用低廉等优点,可应用于动物和食品样品中肠道沙门氏菌6个亚种的快速检测。     

鹦鹉热衣原体荧光环介导等温扩增（LAMP）检测方法的建立

鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)是一种人兽共患病原体,能引起自然疫源性衣原体病,目前广泛分布于世界各地。本研究应用环介导等温扩增技术(LAMP),针对鹦鹉热衣原体23S RNA基因序列设计引物,并进行筛选以及敏感性和特异性试验,建立了鹦鹉热衣原体恒温荧光扩增方法。该方法在63℃恒温条件下1 h内即可显示结果,操作简单、快速,特异性强,灵敏度可达100拷贝/μL,且与流产衣原体、动物布鲁氏菌、牛结核分枝杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌无交叉反应;用国产仪器可直接通过检测荧光信号判读结果,既增强了准确性,也避免了开盖污染产生假阳性;应用建立的LAMP方法对实验室保存的临床DNA样品进行检测,发现检测结果与QPCR相同。该方法的建立弥补了传统检测技术的不足,为实现鹦鹉热衣原体的现场快速诊断提供了技术支持。     

猪流行性腹泻病毒LAMP检测方法的建立及初步应用

猪流行性腹泻病毒是引起仔猪腹泻死亡的主要病原。为实现对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的快速检测,利用PEDV S基因设计特异性引物,通过优化各种反应条件,建立了检测PEDV的环介导等温扩增快速检测方法(LAMP)。此方法特异性好,敏感度强,将反转录后的病毒c DNA稀释到108倍仍可检出,是PCR方法的100倍。本研究建立的LAMP方法操作简便、灵敏度高、特异性强,为临床PEDV的快速检测和预防奠定基础。     

山羊痘病毒LAMP检测方法的建立

为了建立适用于基层养殖场快速、可视化的山羊痘病毒(GTPV)环介导等温扩增技术(LAMP)检测方法,根据GenBank公布的GTPV ORF103保守区核苷酸序列为靶序列,设计并合成一组特异性LAMP引物,优化反应条件(时间、温度)和反应体系(dNTP、内外引物浓度比),并进行特异性和灵敏度试验。结果表明,所建立的LAMP方法在65℃时反应50 min即可获得清晰的梯状条带;扩增物经10×SYBR GreenⅠ荧光染料染色,紫外线照射或日光下即可直接判定结果;灵敏度试验结果表明,该方法能够检出的GTPV核酸最低浓度为1.287 ng/mL,与常规PCR方法相比,灵敏度增高100倍;该方法特异性良好,与小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊支原体(Mccp)、羊口疮病毒(ORFV)均无交叉反应;对10份临床样品检测结果显示,该方法与传统PCR检测结果一致。建立的LAMP检测方法可用于临床山羊痘病毒的检测。     

猪细小病毒 LAMP检测方法的建立

猪细小病毒（PorcineParvoviru，PPV）属于细小病毒科细小病毒属，通常感染初产母猪后会发生流产、不孕、产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等病状。该病广泛存在于世界各地并在大多数猪场流行，中国PPV的感染也很广泛，因此本研究针对VP2基因作为靶序列设计引物，旨在建立一种可快速、灵敏、特异地检测PPV的LAMP检测方法。     

犬细小病毒LAMP检测方法的建立

为提高犬细小病毒(CPV)的检出率,降低检测成本,本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立了一种新型敏感、特异、快速、简便、实用的检测CPV的技术。针对CPVVP2基因保守区设计6条引物,进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化,并检测其敏感性、特异性。所建立的方法最佳反应时间为60min,具有良好的特异性,与同属的其它病毒无交叉反应。该方法对CPV的最低检出量为9.3×10-5ng/μL,其敏感性是PCR的100倍。结果表明,该方法特异性强、敏感性高,并且操作简便、检测成本低,检测时间短,在CPV的综合防治和早期诊断方面具有很高的实用价值。     

牛源性成分LAMP检测方法的建立

根据牛cytB基因设计3对特异性引物,运用GenieⅡ等温扩增荧光检测系统,以环介导等温扩增(LAMP)荧光检测方法为基础,建立了牛源性成分LAMP检测方法,并对该方法进行了反应体系和条件的优化。试验结果表明:该方法操作简单、特异性好;灵敏度比普通PCR方法高100倍,达到5.408×10~(-2)μg/μL;反应时间短,最快的10分钟内即可完成反应。     

番鸭细小病毒LAMP检测方法的建立

本研究根据GenBank中登录的番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)VP3基因的高度保守序列,设计特异性引物,通过对反应体系及反应条件的优化,建立了MDPV的体外环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测方法。敏感性和特异性试验结果显示,建立的LAMP检测方法的灵敏性与常规PCR一致,全部反应可以在1.5 h内完成,对其他鸭常见病原体检测结果全部为阴性。该方法的建立为研制番鸭细小病毒的LAMP快速检测试剂盒奠定了基础。     

柑橘黄龙病LAMP快速检测方法的建立

本文根据GenBank中柑橘黄龙病菌的外膜蛋白（omp）基因序列,设计了1套环介导等温扩增引物,建立了柑橘黄龙病的环介导等温扩增检测方法。该方法敏感度可达25pg/μL,与实时荧光PCR方法灵敏度相同。全部反应只需一个可控温的水浴锅在60min内即可完成,通过肉眼观察颜色即可直接判定结果。本研究建立的环介导等温扩增方法简便、快速、灵敏、特异,适用于基层工作站的柑橘黄龙病鉴定工作。