贵州省山羊布鲁氏杆菌病衣原体病蓝舌病的血清学调查研究

为了解贵州省山羊3种流产疫病流行情况,分别从贵州省4个地区共采集194份山羊血清,采用虎红平板凝集试验法(RBT)对194份血清进行布鲁氏杆菌病抗体检测,平均阳性率为0%;采用间接血凝试验法(IHA)对194份山羊血清进行衣原体病抗体检测,平均阳性率为5.7%;采用酶联免疫吸附试验法(ELlSA)对178份山羊血清进行...     

一起山羊流产衣原体感染的诊断

陕西省某山羊养殖场发生了一起山羊流产病,经流行病学调查,临床症状和病理剖检观察进行初步诊断;利用布鲁菌虎红平板凝集试验、衣原体间接血凝试剂盒对10份流产母羊血清检测;对病料进行细菌学检测;依据GenBank收录的山羊流产性衣原体基因组设计1对特异性引物,通过PCR方法从病料中扩增衣原体特异性片段。结果表明,根据临床症状和病理变化初步怀疑为布鲁菌和鹦鹉热亲衣原体感染;10份血清检测结果为布鲁菌病血清全部阴性,衣原体感染血清全部为阳性;细菌学检测结果为阴性;PCR结果获得523bp基因片段,测序结果与鹦鹉热亲衣原体100%相似。依据流行病学调查,临床症状和病理剖检观察,病原学和血清学诊断,最终确诊该病为鹦鹉热亲衣原体引起的山羊地方流行性流产。     

基于牛支原体P81基因环介导等温扩增方法的建立及应用

为快速检测牛支原体(M.bovis),根据GenBank中登录的M.bovis P81基因序列设计特异性引物,通过条件优化,建立了M.bovis环介导等温扩增(LAMP)检测方法。将该方法的灵敏度与巢式PCR进行对比,并用其检测牛支原体外的其他几种病原菌,同时对疑似感染M.bovis的临床病料进行检测。该方法的灵敏度比巢式PCR高103倍,最低检出限为1.1ng/L,对其他几种病原菌的检测结果均为阴性,临床病料检测结果与分离培养符合率为100%。建立的M.bovis LAMP检测方法灵敏度高、特异性强、检测快速准确,且不需要专门的仪器设备,可用于牛支原体病的临床检测。     

锦鲤疱疹病毒环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种快速检测锦鲤疱疹病毒(CyHV-3)的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究根据Gen Bank中登录的CyHV-3 Sphi基因编码区序列设计了LAMP特异性引物,经反应体系和反应条件优化,建立了检测CyHV-3的LAMP方法。结果表明,本研究建立的LAMP检测方法与鲤痘疱疹病毒、金鱼造血器官坏死病病毒和鳗鱼疱疹病毒均无交叉反应,特异性强;最低检出率为13.9拷贝/μL,灵敏度高。使用LAMP方法和普通PCR方法对四川地区的15个检测点采用鱼鳃拭子非致死性采集的临床样品进行检测,阳性检出率均为31.40%(27/86)。表明本实验建立的该检测方法具有高灵敏度、高特异性、快速和简便的特性,适用于临床上对锦鲤疱疹病毒病的快速诊断。     

猪巨细胞病毒环介导等温扩增方法的建立

根据GenBank已登录的猪巨细胞病毒(Porcine cytomegalovirus,PCMV)gB基因的DNA序列设计合成4对特异性引物,通过优化反应条件,以及敏感性、特异性检测,建立了猪巨细胞病毒的环介导等温扩增检测方法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP);用建立的检测方法对2013年来自四川省雅安、成都、绵阳、眉山、乐山、德阳、遂宁、资阳等市的136份病料进行猪巨细胞病毒检测,将检测结果与常规PCR方法检测结果进行比对。结果显示,本试验建立的方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,是常规PCR的10倍;136份病料用LAMP检测,其中有89份样品为猪巨细胞病毒阳性,其阳性率与常规PCR方法检测的阳性相符率为100%。结果表明,本试验成功建立了PCMV的LAMP检测方法,可用于临床上PCMV感染猪的确诊,对PCMV的快速诊断、综合防控等具有重要意义。     

鹦鹉热衣原体荧光环介导等温扩增（LAMP）检测方法的建立

鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)是一种人兽共患病原体,能引起自然疫源性衣原体病,目前广泛分布于世界各地。本研究应用环介导等温扩增技术(LAMP),针对鹦鹉热衣原体23S RNA基因序列设计引物,并进行筛选以及敏感性和特异性试验,建立了鹦鹉热衣原体恒温荧光扩增方法。该方法在63℃恒温条件下1 h内即可显示结果,操作简单、快速,特异性强,灵敏度可达100拷贝/μL,且与流产衣原体、动物布鲁氏菌、牛结核分枝杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌无交叉反应;用国产仪器可直接通过检测荧光信号判读结果,既增强了准确性,也避免了开盖污染产生假阳性;应用建立的LAMP方法对实验室保存的临床DNA样品进行检测,发现检测结果与QPCR相同。该方法的建立弥补了传统检测技术的不足,为实现鹦鹉热衣原体的现场快速诊断提供了技术支持。     

青海民和县猪衣原体病血清学调查

采用间接血凝试验(IHA),采集青海省民和县总堡乡、隆治乡、中川乡3个乡饲养的生猪血样102份进行检测,调查青海民和县猪衣原体病流行情况。结果显示,检测出阳性5份,可疑13份,阳性率为4.9%,可疑率为12.7%;表明猪衣原体病在民和县存在,感染率较低,但可疑率高,需引起高度重视。     

贵州省山羊流产的病原学鉴定

为了解贵州省山羊流产与山羊痘的相关性,采用琼脂扩散试验和PCR法对本省10个市(县)流产羊群的血清和病料样本进行山羊痘抗原抗体及病原核酸检测,同时血清进行布氏杆菌抗体检测,流产胎儿病料进行羊流产亲衣原体病原核酸检测。结果发现山羊痘羊群流产率达37.1%(4329/11660),山羊痘血清抗体阳性率为38.2%(34/89),抗原阳性率为72.7%(32/44),流产胎儿山羊痘病毒核酸检出率为83.3%(10/12),发病羊群未检出布氏杆菌和羊流产亲衣原体感染。结果表明,山羊流产与山羊痘感染有一定关系,提示在山羊养殖中应加强饲养管理,防止山羊痘感染引起孕羊流产。     

用聚合酶链反应检测羊流产衣原体的初步研究

依据鹦鹉热衣原体羊流产株的主要外膜蛋白基因核苷酸顺序，设计，合成了１对ＰＣＲ引物，利用该对引物，以衣原体基因组ＤＮＡ为模板，可以用ＰＣＲ扩增出－１．１７ＫｂＤＮＡ片段，检测灵敏度可达０．１ｐｇ。采集衣原体感染的山羊流产胎衣等病料制取核酸样品，进行ＰＣＲ检测，同样扩增出特异性条带。作为对照的健康动物组织，常见病原菌的核酸样品则都呈阴性反应，用建立的ＰＣＲ检测衣原体的方法检查了６５份自然病料，有６份呈     

隐孢子虫LAMP检测方法的建立及其在牦牛中的应用

为了探索和建立隐孢子虫LAMP检测方法,以便能快速、简便检测牦牛隐孢子虫的感染情况,基于GenBank中牦牛源隐孢子虫18SrRNA基因序列,设计1组LAMP引物,优化并建立LAMP反应体系。对所建立的LAMP方法进行特异性、重复性、敏感性试验,并用该方法对牦牛的临床样本进行检测。结果显示,建立的LAMP方法特异性、重复性良好,其敏感性是套式PCR的8倍。LAMP方法与套式PCR临床检出率对比,符合率100%。表明成功建立了隐孢子虫的LAMP检测方法,该方法特异性和灵敏性良好,可以应用于牦牛粪便临床样本的检测。     

晴隆县山羊流产嗜衣原体病血清学调查研究

采用间接血凝试剂盒对贵州省晴隆县7个羊场随机采集的血清共716份,进行流产嗜衣原体病(CAB)血清学调查研究,以了解该县山羊流产嗜衣原体病发生情况。结果表明,晴隆县7个养羊场山羊流产嗜衣原体病隐性感染抗体阳性率为8.66%(62/716)。     

胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立及临床应用

为建立检测可疑病料中猪胸膜肺炎放线杆菌(App)的方法,针对App的RTX毒素(ApxⅣA毒素)毒力基因长约449 bp的片段设计引物,以App 10个血清型的基因组分别作为模板,对PCR扩增条件进行优化筛选,并进行了特异性及重复性试验。对副猪嗜血杆菌、马链球菌兽疫亚种、多杀性巴氏杆菌的扩增结果为阴性,表明该PCR方法特异性强,建立了该菌的种属特异性PCR方法。以筛选出的优化条件,对22份临床可疑病料进行了检测。结果表明,建立的PCR方法特异、快速、稳定、敏感,优于传统的细菌学方法,可作为App可疑病料的检测方法。     

生鲜乳中金黄色葡萄球菌LAMP检测方法的建立

针对金黄色葡萄球菌的TRAP基因设计LAMP引物,建立了金黄色葡萄球菌环介导等温扩增(LAMP)方法,进行了特异性和灵敏性试验,并对临床乳样进行初步检测。结果显示,建立的LAMP检测方法特异性良好,与生鲜乳中常见的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、无乳链球菌、粪肠球菌无交叉反应,灵敏度为10CFU/mL。分别用传统分离鉴定法与LAMP法对50个乳腺炎乳样进行检测,传统方法分离得到S.aureus 14株,LAMP法检测得到S.aureus 14株,符合率100%,阳性检出率均为28%。结果表明,成功建立了生鲜乳中金黄色葡萄球菌的快速检测方法,该方法无需特殊的仪器,有利于在临床和基层进行推广。     

2种鸡免疫抑制性疾病LAMP检测方法的建立

本文借助环介导等温扩增技术(LAMP),建立了两种常见鸡免疫抑制病的(鸡传染性贫血病、J亚群白血病)的快速检测方法。采用简易法提取DNA模板,设计特异性LAMP引物,成功扩增出梯形条带,并且对反应体系进行优化,以及特异性试验和灵敏度试验。结果表明LAMP的灵敏度可达10个拷贝,比PCR灵敏度高10倍;且具有特异性,对其他相关鸡病病原检测结果均为阴性。用建立的LAMP方法对临床样品进行检测,同时与PCR方法比较,结果表明LAMP结果基本与PCR相符,但检测的阳性率要比PCR高。操作简便,无需昂贵设备,适用于临床快速诊断。     

检测水貂出血性肺炎绿脓杆菌的比色LAMP法的建立与应用

为了快速有效检测水貂出血性肺炎病原绿脓杆菌,本研究结合金属指示剂HNB特性建立了快速检测绿脓杆菌比色LAMP法。根据绿脓杆菌外毒素A基因设计引物,建立了检测LAMP法;并且对该方法进行了特异性、灵敏性分析;同时进行了初步应用。结果显示,该方法特异性强,灵敏性好,可检测167CFU/mL的菌体,对病貂肺脏检出率高。结果表明,该比色LAMP法可以有效地检测水貂出血性肺炎绿脓杆菌。     

检测水貂出血性肺炎绿脓杆菌的比色LAMP法的建立与应用

为了快速有效检测水貂出血性肺炎病原绿脓杆菌,本研究结合金属指示剂HNB特性建立了快速检测绿脓杆菌比色LAMP法。根据绿脓杆菌外毒素A基因设计引物,建立了检测LAMP法;并且对该方法进行了特异性、灵敏性分析;同时进行了初步应用。结果显示,该方法特异性强,灵敏性好,可检测167CFU/mL的菌体,对病貂肺脏检出率高。结果表明,该比色LAMP法可以有效地检测水貂出血性肺炎绿脓杆菌。     

猪流行性腹泻病毒环介导等温扩增检测方法的建立及应用

试验旨在建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）的环介导等温扩增方法（LAMP）,为诊断PEDV提供简便、敏感、准确可靠的工具。参考GenBank中PEDV基因序列（登录号：KT799997）,针对PEDVN基因设计了6条引物,对所建立的LAMP反应体系、反应温度进行优化,建立可特异性扩增PEDV的LAMP方法。结果显示,本试验成功建立了PEDV LAMP检测方法,在60℃恒温下反应60 min,能特异性地检测PEDV,检测限量为91拷贝/μL,比常规PCR方法的敏感性高100倍。对比75份临床样本的LAMP和常规RT-PCR法检测结果,显示两种方法符合率为97.3%。综上所述,本试验建立的LAMP方法具有特异性强、敏感性高,操作简单,设备要求低的特点,适用于PEDV临床样本的快速检测。     

鸡传染性喉气管炎病毒可视化LAMP快速诊断方法的建立和应用

试验旨在建立简易、快速、高效的鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)检测和诊断方法。根据GenBank上公布的ILTV TK基因序列,设计检测ILTV的特异性环介导的等温扩增(loop media-ted isothermal amplification,LAMP)技术反应引物,通过对LAMP反应体系和反应条件的优化,以及特异性、敏感性和临床样品的检测,建立了ILTV LAMP检测方法。结果显示,以内引物ILT9-FIP和ILT9-BIP、外引物ILT9-F3和ILT9-B3、环引物ILT9-LB和ILT9-LF为LAMP反应引物,反应温度为66℃时,所建立的LAMP检测方法反应效率最高;所建立的LAMP检测方法能够特异性地检测ILTV(匈牙利株和王岗株),不与新城疫病毒(NDV,B株)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV,H52株和H120株)、大肠杆菌、鸡副嗜血杆菌、巴氏杆菌等发生交叉反应,且能够检测到的病毒最低浓度达到0.06pg/μL,其灵敏度是普通PCR方法的100倍;采用建立LAMP方法对50个临床样本进行检测,阳性率为14%,且与PCR检测结果的符合率达96%。本研究建立了特异性强、灵敏度高、操作简单的LAMP检测方法,适用于临床上ILTV的快速检测和诊断。     

贵州省7个地区主要山羊流产疫病的流行病学调查

为了解2011—2012年间贵州省山羊5种流产疫病的流行情况,采用虎红平板凝集试验(RBPT)、间接血凝试验(IHA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)3种血清学方法对贵州省7个地(州、市)74个养殖场的514份山羊血清进行5种流产疫病抗体的血清学监测,并通过PCR方法对10个规模化养殖场流产死亡母羊子宫、胎儿、肺和肺门淋巴结组织进行羊流产亲衣原体病和山羊传染性胸膜炎的病原核酸进行检测。结果显示:布氏杆菌病、羊流产亲衣原体病、弓形虫病、蓝舌病、山羊传染性胸膜炎的丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体血清抗体阳性率分别为0、1.26%、6.72%、26.95%、2.35%和6.79%;羊流产亲衣原体病、山羊传染性胸膜肺炎的丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体病原核酸检测阳性率分别为0、0、10%。结果表明:目前除布氏杆菌病以外,其余4种山羊流产疫病均在贵州存在不同程度的流行。     

鸡传染性喉气管炎病毒可视化LAMP快速诊断方法的建立和应用

试验旨在建立简易、快速、高效的鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)检测和诊断方法。根据GenBank上公布的ILTV TK基因序列,设计检测ILTV的特异性环介导的等温扩增(loop media-ted isothermal amplification,LAMP)技术反应引物,通过对LAMP反应体系和反应条件的优化,以及特异性、敏感性和临床样品的检测,建立了ILTV LAMP检测方法。结果显示,以内引物ILT9-FIP和ILT9-BIP、外引物ILT9-F3和ILT9-B3、环引物ILT9-LB和ILT9-LF为LAMP反应引物,反应温度为66℃时,所建立的LAMP检测方法反应效率最高;所建立的LAMP检测方法能够特异性地检测ILTV(匈牙利株和王岗株),不与新城疫病毒(NDV,B株)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV,H52株和H120株)、大肠杆菌、鸡副嗜血杆菌、巴氏杆菌等发生交叉反应,且能够检测到的病毒最低浓度达到0.06pg/μL,其灵敏度是普通PCR方法的100倍;采用建立LAMP方法对50个临床样本进行检测,阳性率为14%,且与PCR检测结果的符合率达96%。本研究建立了特异性强、灵敏度高、操作简单的LAMP检测方法,适用于临床上ILTV的快速检测和诊断。