鸡传染性法氏囊病病毒实时荧光定量RT—PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组设计一对针对病毒vp5基因的引物和一条特异性Taq Man探针,建立了一种快速检测IBDV核酸载量的Taq Man荧光定量RT-PCR方法.通过对反应条件和反应体系的优化,使得该方法在108拷贝/μL～101拷贝/μL范围内具有良好的线性关系.能够灵敏地检测初始模板中30个拷贝的病毒核酸,其灵敏度是常规RT-PCR检测方法的100倍.该方法不与其它的禽源病毒发生非特异性反应,并且具有良好的重复性,为IBDV的定性定量检测提供了有效的工具.     

禽白血病J亚群病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在通过荧光定量PCR方法研究禽白血病J亚群病毒(ALV-J)在家禽体内各个器官的分布。根据ALV-J NX0101毒株基因5 258—5 510bp的碱基序列,设计了1对特异性引物,进行RT-PCR反应,扩增产物为253bp,将该产物连接T载体作为Real-time PCR反应的标准品,利用SYBR Green I染料进行Real-time PCR反应,建立了标准曲线,并进行反应灵敏性,特异性和重复性试验。然后用已建立的方法对人工感染ALV-J的SPF鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、腺胃进行3次重复检测,将Ct值带入标准曲线公式得出各个组织的病毒拷贝数。试验结果表明:标准曲线线性关系R值均为0.991 4,检测极限约为81拷贝质粒DNA,比RT-PCR灵敏100倍以上;特异性分析表明只有ALV-J能检测到特异性的熔解度峰值;批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%。通过比较数值以得出胸腺ALV-J基因含量是最高的,肺脏、脾脏、法氏囊含量也比较高,心脏拷贝数最低。自然感染发病鸡各器官ALV-J基因均高于人工感染ALV-J的基因含量。本研究所建立的ALV-J基因实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、检测周期短,初步探讨了禽白血病J亚群病毒在畜禽体内各个器官的病毒分布。这为以后禽白血病的诊断以及治疗提供了重要的技术支持。     

K亚群禽白血病病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据K亚群禽白血病病毒(ALV-K)gp85基因序列设计1对引物,对反应条件和反应体系进行优化,建立了快速检测ALV-K的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。该方法在1～10~7 copies/μL范围内具有良好的线性关系,灵敏度达到1 copies/μL,是常规PCR方法的100倍。该方法与经典亚群ALV及其他常见禽免疫抑制病病毒无交叉反应,批间与批内重复性试验变异系数均小于2%。将ALV-K原型株JS11C1通过卵黄囊接种途径感染SPF鸡,运用本试验建立的实时荧光定量PCR方法,对感染鸡体内各器官的病毒分布及病毒载量进行了检测。结果显示,在感染鸡的心脏、脾脏、肺脏、肾脏等器官中均可检测到病毒,其载量无明显差异。结果表明,本试验所建立的实时荧光定量PCR方法具有敏感度高、特异性强和重复性好的优点,可用于ALV-K的快速、定量检测,该方法同时为ALV-K致病机制的研究提供了良好的技术手段。     

猪博卡病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的猪博卡病毒(PBoV)序列,通过VP1/2基因设计引物和Taq Man探针建立实时荧光定量PCR检测方法。建立的方法与PPV、PRRSV及PCV均无交叉反应,具有较高特异性,在107 copies/mL～101 copies/mL模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.997,最低可检测到101copies/mL的阳性质粒。说明所建立的PBoV实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性好和精确性高等优点。     

血清4型禽腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速有效的检测血清4型禽腺病毒,本试验针对高度保守的Hexon基因序列设计引物和探针,建立了TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,结果显示:该方法线性关系良好,R~2=0.998;特异性强,对禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)均无扩增;敏感性好,最低可检测病毒含量为50拷贝/μL,比常规PCR方法敏感10倍;稳定性良好,组内和组间重复试验的变异系数分别为0.75%～1.71%和0.60%～1.74%。本试验建立的TaqMan荧光定量PCR方法,为血清4型禽腺病毒感染临床快速、准确诊断提供了技术支撑。     

猪流产衣原体实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、准确检测猪流产衣原体(Chlamydophila abortus,C.abortus)实时荧光定量PCR检测方法,根据C.abortus主要外膜蛋白(MOMP)的基因序列设计1对引物和1条分子探针(FAM和Dabycl标记),以构建的重组质粒作为标准阳性质粒,通过筛选和条件优化,建立了猪流产衣原体实时荧光定量PCR诊断方法。重复性、特异性及敏感性试验结果显示,重组质粒为标准品建立的标准曲线在1.0×10~2拷贝/μL~1.0×10~7拷贝/μL内具有良好的线性关系,其相关系数为0.993 2,扩增效率为94.7%,灵敏度达到1.0拷贝/μL,批间批内变异系数(CV)为0.022%~0.051%,建立的方法可有效区分流产衣原体、猪支原体、猪衣原体、肺炎衣原体及猪蓝耳病毒等病原,具有良好的临床应用前景。     

牛诺如病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

牛诺如病毒（BNoV）是国内新发的犊牛腹泻病原,笔者拟建立检测BNoV的Real-time PCR方法。根据BNoV流行株的RNA聚合酶（RdRp）基因序列设计引物,通过优化反应条件和体系,成功建立基于EvaGreen检测BNoV的Real-time PCR方法。该检测方法的Ct值与标准品模板在2.24×10²~2.24×10⁸拷贝·μL^-1线性关系良好,相关系数R²=0.997,扩增效率为98.44%;该方法可特异性检出BNoV,对其他犊牛腹泻相关病原呈阴性;最低检测限为22.4拷贝·μL^-1;批间和批内的变异系数均小于2%,重复性好。对2017年9月-2019年5月采自河南省的221份犊牛腹泻样本中BNoV的检出率为11.31%（25/221）,采样场阳性率为92.86%（13/14）。本试验所建方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BNoV的检测和流行病学调查提供了有力手段。     

实时荧光定量PCR检测布鲁菌方法的建立

旨在建立实时荧光定量PCR检测布鲁菌的方法。经选取高度保守的具布鲁菌属特异性的BSP31基因设计了一对引物及探针,并采用矩阵法优化反应体系,筛选出引物、探针、dNTP和Mg2+最优浓度配比,同时进行了特异性和灵敏性试验,建立了实时荧光定量PCR检测布鲁菌的方法。该方法可用于对布鲁菌病普查监测及进出境动物及其产品的检验检疫。     

牛结核分枝杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立可应用于快速检测奶牛结核病、评估鲜乳污染状况、追溯传播途径的试验方法,本研究根据牛结核分枝杆菌基因组设计合成特异性引物,建立实时荧光定量PCR方法,并对反应条件进行优化,构建标准曲线,评价该方法的性能。结果显示,本研究所建立的实时荧光定量PCR方法能有效检测牛结核分枝杆菌目的基因,其最佳引物浓度为400 nmol/L,最佳退火温度为52 ℃。所构建的标准曲线相关性好,可用于样本的定量检测。该方法的性能评价显示,其最小检出模板浓度为80.24 ng/L,且该方法具有较好的特异性、可重复性,可对鲜乳样本进行检测。试验结果表明,本研究所建方法可用于牛结核分枝杆菌的定性和定量检测,这为奶牛结核病的诊断与净化及鲜乳食品安全评估提供重要技术。     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究为了建立一套检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的实时荧光定量PCR检测方法,根据GenBank公布的23株编码ASFV结构蛋白p72的基因序列,设计引物和探针,优化退火温度、Mg^2＋浓度和引物、探针浓度,生成标准曲线,进行重复性、敏感性、特异性试验,并检测样品。结果显示,优化的退火温度为60 ℃,Mg^2＋终浓度为4 mmol/L,引物、探针终浓度分别为0.8、0.3 μmol/L。重复性试验变异系数均小于1.3%,敏感性试验最低能够检测到10拷贝/μL的质粒,以其他5种猪病病毒和ASFV质粒为模板进行特异性试验,只有ASFV质粒出现扩增曲线。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法是快速、灵敏、特异的检测ASFV的方法。     

塞内卡病毒Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据对GenBank中2015-2017年登录的18株国内塞内卡病毒(SVV)基因组序列比对分析结果,设计合成1对针对SVV 5’UTR区域的特异性引物和Taqman探针,通过优化荧光定量PCR反应条件,建立一种定量检测SVV的Taqman实时荧光定量PCR检测方法。该方法定量检测范围在10～10~9 copies/μL,检测下限为10 copies/μL,比常规PCR检测灵敏度高约1 000倍,同时检测口蹄疫病毒(FMDV)、猪水疱病病毒(SVDV)、猪水疱疹病毒(VSV)、圆环病毒(PCV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)均为阴性,特异性良好;对50份疑似病料同时进行荧光定量PCR检测和常规PCR检测,结果显示荧光定量PCR阳性检测率(38%)高于常规PCR阳性检测率(25%),证实本试验建立的SVV Taqman实时荧光定量PCR检测方法可实现对SVV的临床诊断和定量分析。     

霍乱弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立霍乱弧菌(VC)的快速检测方法,以VC的hlyA基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针建立实时荧光定量PCR快速检测法,同时对该方法进行了特异性、灵敏性、稳定性和重复性试验,并对145份临床样品进行了检测。结果表明:特异性试验中15株试验菌株荧光定量PCR检测只有VC菌株为阳性,表明该检测方法特异性强;灵敏性试验表明该方法的灵敏度为25 cfu/m L;稳定性和重复性试验表明同一样品重复检测4次,Ct值的变异系数均小于2%;对145份临床样品进行检测,共计检出2份VC阳性样品,与行标法(SN/T 2425—2010)检测结果一致。说明该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。     

牛诺如病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

牛诺如病毒(BNoV)是国内新发的犊牛腹泻病原,笔者拟建立检测BNoV的Real-time PCR方法。根据BNoV流行株的RNA聚合酶(RdRp)基因序列设计引物,通过优化反应条件和体系,成功建立基于EvaGreen检测BNoV的Real-time PCR方法。该检测方法的Ct值与标准品模板在2.24×10~2～2.24×10~8拷贝·μL~(-1)线性关系良好,相关系数R~2=0.997,扩增效率为98.44%;该方法可特异性检出BNoV,对其他犊牛腹泻相关病原呈阴性;最低检测限为22.4拷贝·μL~(-1);批间和批内的变异系数均小于2%,重复性好。对2017年9月—2019年5月采自河南省的221份犊牛腹泻样本中BNoV的检出率为11.31%(25/221),采样场阳性率为92.86%(13/14)。本试验所建方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BNoV的检测和流行病学调查提供了有力手段。     

鹿布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究依据布鲁氏菌的特异性基因Omp25c的部分片段作为靶基因,设计探针引物,且优化了反应体系,筛选出引物、探针的最优浓度配比。将扩增产物连接到PGEM-T载体上,制备标准品及标准曲线,建立鹿布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、稳定性、敏感性进行评价。由标准曲线可知该方法的最低检测浓度可达到36拷贝/μL,比常规PCR灵敏度高出很多。     

羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

山羊痘和绵羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。为了更快、更准确的诊断该病,本研究根据Gen Bank已经发表的GTPV和SPPV参考毒株(登录号分别为AY077836和AY077832)A29L基因序列,设计合成了1对特异性引物和2条Taq Man探针,同时制备重组质粒标准品。经过反应条件的优化,建立了羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的实时荧光定量PCR方法反应体系的特异性、灵敏性和重复性进行了评价,并用此方法对19份临床样品进行了检测。结果显示:该诊断方法与4种非羊痘病毒不发生交叉反应,并且山羊痘病毒和绵羊痘病毒之间也不发生交叉反应。该方法的重复性试验变异系数均低于2%,并且双重实时荧光定量PCR最低浓度检测限分别为470和440 fg。对标准阳性模板进行定量检测,生成的标准曲线相关系数分别为0.995和0.997。在检测的临床样品中,GTPV和SPPV阳性分别有14和4份,混合感染有1份。结果表明所建立的方法具有良好的特异性,灵敏性、稳定性,可以对GTPV和SPPV进行准确的定量检测。     

猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、灵敏、快速及量化的猪瘟病毒(CSFV)检测方法,设计扩增CSFV E2基因的特异性引物,建立Eva Green染料的RT-qPCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性测试,并检测疑似猪瘟病毒感染的临床样品.结果显示,所建立的RT-qPCR检测方法标准曲线的线性相关系数R2=1.000,具有良好的线性关系...     

布鲁氏菌实时定量荧光PCR检测体系的建立及应用

本根据GenBank上公布的布鲁氏菌BCSP31基因保守区域序列设计合成一对特异性引物与TapMan探针,建立整套快速准确鉴定布鲁氏菌的实时定量荧光PCR检测体系。以实验室构建的克隆有布鲁氏菌目的片段的重组质粒为标准品,进行实时定量荧光PCR反应检测,通过优化反应条件,建立标准曲线。以标准品为模板,对该方法的特异性、敏感性与重复性进行检测与分析。并以临床样本进行检测的结果进行比较分析,结果表明,该检测体系的检测灵敏度高,重复性与特异性良好。本研究建立的实时定量荧光PCR可用于准确检测样本中的少量的布鲁氏菌,具有良好的应用前景和市场价值。     

胎儿弯杆菌病TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立胎儿弯杆菌(C.fetus)定量检测方法,本研究根据C.fetus毒力因子表面蛋白(SapA)基因序列设计引物和一条特异的TaqMan水解探针,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测C.fetus的TaqMan荧光定量PCR方法.对该方法的特异性与敏感性研究,结果显示,该方法检测C.fetus结果均为阳性,而非C.fetus均为阴性;对带有SapA基因的阳性质粒的检测敏感性为10~8拷贝～10~2拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,可敏感地检测到模板中13个拷贝的细菌DNA,其灵敏度是常规PCR方法的100倍.该方法具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点.该方法为C.fetus快速检测试剂盒的研制打下了良好的基础.     

猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感、特异的猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中CSFV E2基因保守区域序列,设计了一对特异性引物和一条特异性探针,以CSFV总RNA为反转录模板,经优化反应条件,建立CSFV实时荧光定量PCR检测方法,并对其进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对35份临床疑似CSFV感染样品进行了检测。结果表明,本研究建立的CSFV实时荧光定量PCR检测方法在10¹~10⁶拷贝/μL范围内有很好的线性关系,相关系数为0.999;CSFV细胞培养物出现阳性扩增信号,但ST正常细胞对照和其他8种病原对照未出现扩增,特异性良好;该方法重复性好、敏感性高,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,并且CSFV的最低检测限为1 TCID₅₀/mL;自35份疑似CSFV感染样品中检出19份阳性样品,与本课题组建立的CSFV Nested RT-PCR检测结果和克隆测序结果一致。本研究成功建立了CSFV实时荧光定量PCR检测方法,可用于CSFV的快速检测。