鸡奇异变形杆菌的分离鉴定和16S rRNA基因序列测定与系统进化分析

从山东泰安一鸡场发病雏鸡眼中分离到1株致病菌(编号为QY),通过细菌形态学等常规鉴定符合奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)特性。用奇异变形杆菌阳性血清诊断结果呈阳性,人工感染证明该菌株是造成该鸡场雏鸡大批发病死亡的致病菌。药敏试验结果显示对头孢类、恩诺沙星等高度敏感,而对青霉素和复合磺胺等不敏感。以细菌16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增,得到QY的16SrRNA基因序列,长约1 453bp(GenBank,登录号为GU477712)。将该序列与GenBank中序列进行Blast比对,发现与其匹配度最高的均是奇异变形杆菌各株系的16SrRNA序列,均高达98%以上。运用DNAStar软件与其中10株奇异变形杆菌分离株构建系统进化树,结果表明,分离株(QY菌株)与10个代表菌株的同源性均为98.9%～99.9%,其中与AB272366同源性最高为99.9%。从分子水平证明该菌是奇异变形杆菌并分析了其遗传进化规律,为鸡奇异变形杆菌的鉴定及其引起的疾病的诊断与治疗提供了参考。     

孔雀奇异变形杆菌的分离鉴定及遗传进化分析

从信阳地区发病孔雀肝脏中分离到1株致病菌(编号为KQY),通过分离纯化、生化试验,发现其各项检测指标均符合变形杆菌的特点。进一步对该分离菌的16S rRNA片段测序及Blast分析,与奇异变形杆菌参考株同源性为99.3%~99.9%,确定该分离菌为奇异变形杆菌。动物回归试验显示该株为孔雀的致病菌株。     

鸭源奇异变形杆菌的分离鉴定及其16 S rRNA基因序列分析

从山东潍坊不同鸭场发病雏鸭肝脏、肺脏病料中分离到3株致病菌,通过培养特性观察、革兰氏染色、生化试验,初步鉴定为奇异变形杆菌。用PCR方法扩增分离菌株的16 S rRNA基因,获得大小为1 504 bp的目的片段。经BLAST比对分析表明,与其同源性最高的均为奇异变形杆菌各株系的16 S rRNA序列,同源性高达98%以上,与14株参考菌的同源性为98.9%~99.8%,在系统发育树上聚为同一枝,表明分离菌株为鸭奇异变形杆菌。动物接种试验表明分离菌株对鸭均具有较强致病性。药敏试验结果显示分离株对头孢吡肟、哌拉西林、氨曲南等8种药物敏感,对米诺环素、头孢曲松、环丙沙星等23种药物有耐药性。     

鸡奇异变形杆菌的分离鉴定及药敏分析

从云南某鸡场发病鸡肝脏中分离到一株革兰氏阴性多形性小杆菌,并进行生理生化鉴定、16SrDNA基因比对鉴定、致病性试验和药敏试验。试验结果表明：该分离株分解葡萄糖、乳糖、半乳糖和木糖,产酸产气,迅速分解尿素,H2S试验阳性,结合分离株的培养特性和革兰氏染色镜检结果,将分离株初步鉴定为鸡奇异变形杆菌;分离株16srDNA核苷酸序列与GenBank上其它鸡奇异变形杆菌之间的同源性高达99％～100％,与ALK428（基因登录号KC456557）为代表的许多奇异变形杆菌菌株之间的核苷酸同源性高达100％,将分离菌株进一步鉴定为鸡奇异变形杆菌;分离株对小白鼠有强致病性,对头孢噻肟敏感,对青霉素、氨苄西林、头孢噻吩、链霉素、卡那霉素、氧氟沙星、磺胺嘧啶、氟苯尼考等多种抗生素表现严重的多重耐药性。     

猪源奇异变形杆菌的分离鉴定与耐药性分析

为了对河南省某猪场疑似细菌感染病例进行确诊,本试验采集了病猪肠道中的样品从中分离到1株革兰阴性短杆菌,进行了培养特性观察、生化试验、药敏试验以及16S rRNA基因序列分析。结果显示,分离菌的生化特性、培养特性基本符合奇异变形杆菌的特征,16S rRNA基因序列与奇异变形杆菌的同源性在98%以上,将该分离菌株命名为ZB17;序列分析表明,该分离菌株与猪源奇异变形杆菌(HQ259935.1和KR133627.1)的同源性最高,与大肠杆菌、沙门菌,克雷伯菌的同源性相对较低;分离株具有较强的致病性和多重耐药性,对复达欣、庆大霉素、奈替米星、阿米卡星敏感;但对氨苄西林、美洛西林、先锋霉素IV、先锋霉素V、先锋霉素VI、卡那霉素、新霉素、四环素、强力霉素耐药。本试验为猪源奇异变形杆菌的分离、鉴定及治疗提供了参考。     

貉源奇异变形杆菌分离鉴定及系统发育分析

为研究引起貉肺炎的病原,笔者无菌采集病貉肺脏、肝脏、心血等病料,分离出1株细菌并命名为H1,采用形态特征、培养特性、生化鉴定、动物致病性试验等方法进行了相关鉴定,初步确定该分离菌株为奇异变形杆菌(P.mirabilis)。结果表明:该分离菌株对小鼠具有较强致病作用;对H1菌株的16S rRNA序列在NCBI上利用BLAST软件与Gen Bank中公布的12株奇异变形杆菌参考株进行同源性对比分析,同源性为96.5%~99.9%,系统发育树分析发现,分离菌株H1与4株参考株亲缘关系较近,同源性均为99.9%,证明该分离菌株H1为奇异变形杆菌;该菌株对氟苯尼考、头孢曲松和阿奇霉素等高度敏感。     

海南省南美白对虾锡那罗州弧菌的分离鉴定

为了有效防治海南儋州南美白对虾病害,试验首先采用常规方法鉴定从病虾肝胰腺分离的优势菌株的形态、培养特性、生理生化反应等,并用聚合酶链式反应(PCR)扩增16S r DNA序列;其次,用人工感染试验检测分离菌株的致病性;最后,通过体外裂解试验测定噬菌体(噬菌28TM)对分离株的裂解能力。结果表明:该分离株HYRJ2013为锡那罗州弧菌(Vibrio sinaloensis)。肌肉注射HYRJ2013菌株感染南美白对虾,出现与自然发病虾相似症状,测得其半数致死量(LD50)为6.68×107cfu/m L。噬菌体(噬菌28TM)可裂解该菌株,用于生物防治。说明锡那罗州弧菌是南美白对虾的条件致病菌。     

水貂奇异变形杆菌的分离鉴定及16S rRNA基因序列分析

从辽宁某貂场发病水貂中分离到1株致病菌,命名为PMSD株,通过形态学观察和生化试验等常规鉴定发现符合奇异变形杆菌特性,进一步经VITEK 2Compact 30全自动细菌鉴定及药敏分析系统鉴定该株细菌为奇异变形杆菌。药敏试验结果显示PMSD株对氨基糖苷类药物、喹诺酮类药物等敏感,而对β-内酰胺类药物和磺胺类药物等不敏感。以细菌16SrRNA基因为模板应用通用引物进行PCR扩增,得到PMSD株的16SrRNA基因序列,长约1 504bp,提交到GenBank中,登录号:KM229530。将该序列与GenBank中序列进行BLAST比对,结果发现与其匹配度最高的均是奇异变形杆菌各株系的16SrRNA序列,均高达99%以上。选取其中前20株作为参考序列,运用生物学软件构建系统发育树并进行同源性比对,结果表明,分离菌PMSD株与20个代表菌株的同源性为98.9%~99.7%,其中与BB2000株、HI4320株、B1株和FCC141株同源性最高,为99.7%。本研究为预防和控制奇异变形杆菌引起的水貂疾病奠定了一定的基础。     

犬源奇异变形杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为了对吉林省长春地区致犬腹泻的奇异变形杆菌进行流行病学调查及药物敏感性检测,试验采用传统细菌鉴定方法及16S rRNA系统发育学分析方法,对2015—2017年间送检的62份疑似患细菌性肠炎犬的腹泻物进行奇异变形杆菌的分离鉴定及遗传进化分析,并对分离菌进行药物敏感性试验及小鼠致病性试验。结果表明:从送检病料中共分离获得12株奇异变形杆菌(分离率为19.35%),革兰氏染色为阴性,理化特性鉴定与奇异变形杆菌的生理特性基本一致;分离菌经16S rRNA基因扩增获得大小的为1 600 bp条带,所测序列与奇异变形杆菌的核苷酸序列同源性在98%以上,12株分离株处于3个独立分株;其中分离菌对兽医临床常用药物整体耐药水平较高,仅有部分菌株对环丙沙星、恩诺沙星、头孢曲松敏感;分离菌CC15031对小鼠的半数致死量(LD_(50))为2.8×10~6 cfu/mL,具有较强的致病性。说明分离得到的奇异变形杆菌具有较强的耐药性和不同程度的致病性,应引起重视。     

山羊腹泻粪便中奇异变形杆菌的分离鉴定及系统发育分析

该研究从四川成都某羊场腹泻简阳大耳山羊粪便中分离鉴定出奇异变形杆菌（14/20）,随机选取5个菌株腹腔注射小鼠,5×10^8 CFU/只,小鼠于接种后12 h内全部死亡。PCR扩增分离株的16S rRNA序列,测序结果显示其与GenBank中奇异变形杆菌的序列同源性为99%～100%,分离菌株间的同源性为99.8%～100%;系统发育分析结果显示,分离菌株与不同宿主源奇异变形杆菌共聚为2个分支,存在一定的多样性,但其进化不存在显著的地域及宿主相关性。本研究结果表明,奇异变形杆菌与山羊腹泻密切相关,对养羊业的危害及公共卫生学意义值得关注。     

仔猪腹泻奇异变形杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为了对吉林省某规模化养猪场腹泻仔猪肛拭子样品进行病原菌分离鉴定,试验对样品进行细菌分离培养,革兰氏染色、镜检,生化反应及动物回归试验,选取生物过滤后分离获得的部分分离菌利用BD PhoenixTM-100全自动微生物鉴定/药敏系统检测细菌鉴定仪对分离菌株进行药物敏感性检测,同时利用ERIC(enterobacterial repetitive intergenic consensus)-PCR指纹图谱和融合试验对分离菌株进行流行病学分型检测。结果表明:根据细菌分离培养及染色镜检结果初步分离得到14株奇异变形杆菌。在14株奇异变形杆菌中,选取生物过滤后分离获得的7株奇异变形杆菌进行生化反应和药敏试验。在45种生化反应中,有7种生化反应结果为可变量,生化反应结果与奇异变形杆菌一致率为84. 4%。7株分离菌对氨苄西林、磺胺甲基异口恶唑和环丙沙星的耐药率均达到85. 7%,而对哌拉西林和左氧氟沙星的耐药率均达到42. 9%,具有较高的耐药性。将分离获得的14株奇异变形杆菌培养物腹腔注射Balb/c小鼠,全部小鼠于12 h内死亡,表明14株分离菌均具有高致病性。14株分离菌的ERIC-PCR指纹图谱的鉴定结果与融合试验的结果一致。说明融合试验也可用于检测奇异变形杆菌分离株的同源性,同时本试验分离株的耐药情况严重。     

一株猪源奇异变形杆菌的分离鉴定

试验通过对阿克苏某生猪养殖场腹泻仔猪肛拭子进行病原分离,并成功分离到一株细菌。细菌纯化后通过革兰氏染色观察其形态结构,并提取其DNA测序。分离菌株得到的基因序列标记为W1,通过DNA star生物软件将菌株W1与国内外菌株进行基因序列对比,并做同源性和进化树分析。结果表明:W1与国内外15株奇异变形杆菌的同源性为96.4%~99.4%,其中与W1同源性最低的是KT216564,与W1同源性最高的是AB272366。遗传进化树分析表明,分离株W1与南京株JF775415处于同一分支,属于奇异变形杆菌,该菌株的成功分离为阿克苏地区对奇异变形杆菌的研究提供参考。     

致羔羊腹泻奇异变形杆菌的分离鉴定及迁徙行为分析

2015年春,山东滕州某规模化羊场新生羔羊出现严重的腹泻,并且部分羔羊死亡。对该羊场病死羔羊进行剖检后,共分离到4株细菌(分别命名为PM1、PM2、PM3、PM4)。对所分离的细菌进行形态特征、生化试验以及16S rDNA遗传分析,判定该4株菌均为奇异变形杆菌。16SrDNA系统发育及同源性分析显示:4株分离菌与其他11株奇异变形杆菌的同源性为99%以上,其中与中国Hu株、马来西亚PPB3株以及印度BAB-199株位于同一个分支上,且与中国的Hu株的进化关系最近;4株分离菌之间的同源性为100%,判断为同1株菌。细菌生长曲线、药敏试验、毒力试验、毒素测定试验以及游散行为分析结果表明,该分离菌于14h左右达到生长稳定期,且对环丙沙星、左氟沙星最为敏感;对小鼠有强致病性,分离菌培养液的无菌滤液对小鼠无毒性作用;在含0.5%琼脂的LB平板上迁徙速度最快,且在含琼脂1.5%和2.0%的LB平板上呈圆环样周期运动。该研究结果为羊奇异变形杆菌病的防控提供了基础。     

鸡源致病性奇异变形杆菌的分离鉴定与遗传进化分析

为了解鸡源奇异变形杆菌的耐药情况、致病力和遗传特征,本试验从凉山地区分离得到2株细菌（YLF1、WS）,通过培养特征、镜检特征和16S rRNA序列测定对分离菌进行鉴定及致病性试验;采用（K-B）法检测分离菌对14种常用抗生素（包括β-内酰胺类、头孢烯类、氨基糖苷类、四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类）的敏感性;并与GenBank中公布的21种不同来源的变形杆菌16S rRNA基因序列进行遗传进化分析。结果表明,YLF1、WS菌株均具有迁徙性和β-溶血生长特征,镜检为革兰氏阴性长短不一的杆菌或球菌,经16S rRNA基因鉴定与GenBank中奇异变形杆菌同源性均在99%以上,YLF1、WS菌株确定为奇异变形杆菌,均表现为多重耐药,耐药率分别为78.6%（11/14）和71.4%（10/14）;雏鸡致死率均为80%;YLF1、WS菌株与日本人体分离株、中国新疆黄牛分离株和中国广东土壤分离株同源性最高,达99.9%;与来自中国河南、中国新疆及印度的鸡源奇异变形杆菌同源性较高（98.9%~99.3%）,遗传关系密切。表明凉山地区鸡群中存在奇异变形杆菌感染,分离株有较高的致病力和较强的耐药性,也提示分离菌可能来源于环境、感染鸡或其他动物,同时存在人畜共患的潜在危险。     

鸡源致病性奇异变形杆菌的分离鉴定与遗传进化分析

为了解鸡源奇异变形杆菌的耐药情况、致病力和遗传特征,本试验从凉山地区分离得到2株细菌(YLF1、WS),通过培养特征、镜检特征和16SrRNA序列测定对分离菌进行鉴定及致病性试验;采用(K-B)法检测分离菌对14种常用抗生素(包括β-内酰胺类、头孢烯类、氨基糖苷类、四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类)的敏感性;并与GenBank中公布的21种不同来源的变形杆菌16SrRNA基因序列进行遗传进化分析。结果表明,YLF1、WS菌株均具有迁徙性和β-溶血生长特征,镜检为革兰氏阴性长短不一的杆菌或球菌,经16SrRNA基因鉴定与GenBank中奇异变形杆菌同源性均在99%以上,YLF1、WS菌株确定为奇异变形杆菌,均表现为多重耐药,耐药率分别为78.6%(11/14)和71.4%(10/14);雏鸡致死率均为80%;YLF1、WS菌株与日本人体分离株、中国新疆黄牛分离株和中国广东土壤分离株同源性最高,达99.9%;与来自中国河南、中国新疆及印度的鸡源奇异变形杆菌同源性较高(98.9%~99.3%),遗传关系密切。表明凉山地区鸡群中存在奇异变形杆菌感染,分离株有较高的致病力和较强的耐药性,也提示分离菌可能来源于环境、感染鸡或其他动物,同时存在人畜共患的潜在危险。     

3株鸽源奇异变形杆菌的分离与鉴定

对从江苏省某鸽场病死鸽脏器中分离的细菌进行分离鉴定。通过细菌培养、革兰染色镜检及生化特性测定等对分离株进行初步鉴定;扩增分离株的16S rDNA片段并测序,Blast搜索比对确定细菌的种属;通过动物致病性试验和药敏试验来检测分离株的致病力及耐药性。结果:3株细菌的16S rDNA序列测定和Blast分析表明与奇异变形杆菌参考株的同源性达99.4%～99.8%,确定为奇异变形杆菌;致病性试验显示奇异变形杆菌对鸽子和小鼠均有致病力;药敏试验表明奇异变形杆菌对头孢菌素类抗生素和氟苯尼考敏感,对青霉素类和磺胺类抗生素等有耐药性。结果表明,从鸽子脏器中所分离的细菌为奇异变形杆菌,具有较强的致病力和多重耐药性。     

鹅源奇异变形杆菌的分离鉴定及药敏试验

从某鹅场病死鹅脏器中分离到一株细菌,进行生化鉴定试验、16 S rDNA鉴定、动物致病性试验、动物回归试验和药敏试验。结果表明:初步鉴定为鹅奇异变形杆菌,应用PCR方法扩增出1 465 bp的16 S rDNA基因片段,经BLAST比对分析,与奇异变形杆菌参考株同源性为99.5%~100%,其中与KT216564(巴基斯坦)、KF051774(中国深圳广州)同源性为100%,从分子水平进一步证明该菌是鹅奇异变形杆菌;以0.2 mL/只(3.5×109cfu/mL)菌液的剂量接种小白鼠,其发病率为100%,死亡率为80%,表明分离菌具有较强致病性;药敏试验结果显示,在5类14种常用抗菌药物中,分离菌仅对β-内酰胺类抗生素头孢哌酮与氨基糖苷类抗生素丁胺卡那高度敏感,而对喹诺酮类抗生素氟哌酸、环丙沙星,大环内酯类抗生素红霉素、克拉霉素以及磺胺类抗菌药复方新诺明均产生耐药性。     

1株鸡源奇异变形杆菌的分离鉴定及药敏试验

[目的] 阐明青海省大通县某鸡场病鸡发病原因,为奇异变形杆菌病防控提供参考。[方法] 无菌采集病鸡肝脏、脾脏和泄殖腔拭子等样品,接种普通琼脂和SS琼脂平板进行细菌分离纯化培养,挑取平板上生长的疑似菌落进行革兰染色镜检,再将分离的菌落接种生化鉴定管进行生化鉴定,同时通过PCR扩增16S rDNA和tuf特异性基因并测序。将分离菌接种雏鸡进行致病性试验,采用K-B法评价分离菌对27种抗菌药物的敏感性。[结果] 分离菌为短杆、长杆状多形性杆菌,生化特性与奇异变形杆菌相符。PCR成功扩增出1 400 bp的16S rDNA,序列比对显示与奇异变形杆菌同源性最高,为99.9%。雏鸡致病性试验结果表明,该株奇异变形杆菌对雏鸡有致病性。药敏试验结果显示,该菌株对哌拉西林、头孢吡肟和头孢噻肟等高度敏感,对环丙沙星、奥格门汀中度敏感,对氨苄西林、阿莫西林和头孢唑啉有耐药性,提示该菌对头孢类药物高度敏感。[结论] 分离到的一株奇异变形杆菌对鸡具有较强的致病性,且对多种药物表现出耐药性。     

变形杆菌的分离鉴定及其毒力与耐药相关基因检测

将从病死的牛、猪和鹅肝脏内分离的3株菌分别进行分离纯化、革兰染色镜检、生化试验和药敏试验,对其16S rRNA基因进行PCR扩增、测序、同源性比对,测定其毒力和耐药相关基因。结果显示,3株均为革兰阴性杆菌。16S rRNA基因序列同源性分析显示,2株分离菌与普通变形杆菌同源性高达999%,另外1株与奇异变形杆菌同源性高达100%。毒力基因检测表明,2株普通变形杆菌携带rpoA和fliL,奇异变形杆菌携带hpmA、hpmB、rpoA和fliL,均为编码溶血素和鞭毛的基因。药敏试验结果显示,3株变形杆菌对多种抗菌药物耐药,仅对头孢吡肟等敏感。对其耐药基因——头孢菌素酶(ampC)基因检测结果与药敏试验的结果基本一致。3株不同来源的分离菌均为变形杆菌,其致病性可能与其含有编码溶血素以及鞭毛的基因有关,对头孢菌素类耐药性可能与其携带ampC基因有关。     

一株撒坝猪源大肠杆菌噬菌体的生物学特性研究

为了解撒坝猪源大肠杆菌噬菌体分离株的生物学特性。自撒坝猪源大肠杆菌中分离到一株裂解性噬菌体,利用PCR扩增噬菌体衣壳蛋白gp23基因,并通过同源性比对及遗传进化分析来鉴定噬菌体。经增殖纯化培养后测定噬菌体的效价和对菌株的裂解效应,而后测定其最佳感染复数、热稳定性、pH稳定性及绘制生长曲线以探究该噬菌体的生物学特性。结果表明,分离株衣壳蛋白gp23基因与噬菌体slur14亲缘关系最近,属于有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科T4-like噬菌体;分离株具有较高的效价,达8.67×10~9 pfu/m;针对实验室保存的92株已确定血清型的大肠杆菌裂解率为61.95%,完全裂解率为27.17%;在60℃条件下作用30 min,或在pH5和pH9时,噬菌体的效价表现明显下降;生长曲线绘制后可知该噬菌体感染宿主菌的潜伏时间约为30 min,爆发时间约为120 min,裂解量为41 pfu/cell。该试验成功分离得到裂解能力较强、裂解谱较广且对理化因素耐受力较强的T4-like噬菌体。