荷斯坦奶牛乳腺干细胞的成神经诱导鉴定及催乳素对其增殖活性的影响

本研究旨在探究荷斯坦奶牛乳腺干细胞的多向分化潜能及催乳素对其增殖活性的影响。采用尼氏染色法对乳腺干细胞向神经细胞分化的情况进行鉴定,利用RT-PCR技术对诱导后的乳腺干细胞进行基因水平检测;MTT法检测催乳素对乳腺干细胞增殖活性的影响。结果表明:荷斯坦奶牛乳腺干细胞经成神经诱导后,细胞中有类似神经元的细胞出现,并且细胞周围出现许多微管样的结构,经尼氏染色呈阳性。诱导后神经细胞标记基因NSE和β-Tubulin Ⅲ呈阳性表达。催乳素刺激可促进乳腺干细胞的增殖,低浓度时乳腺干细胞的活力较好,且100ng·mL~(-1)为增殖最适浓度。     

绒山羊毛囊干细胞的分离培养及诱导分化鉴定

试验旨在建立绒山羊毛囊干细胞体外分离培养方法,并对其生物学特性和多向分化潜能进行鉴定。利用两步酶消化法和差速贴壁法分离纯化毛囊干细胞,对其进行传代培养,测定生长曲线和克隆形成率,采用油红O和茜素红染色法对第5代毛囊干细胞向成脂和成骨分化情况进行鉴定。结果显示,分离得到的毛囊干细胞形态均一,体积小,呈典型的铺路石状生长,生长曲线呈S型,克隆形成能力强。成脂诱导后,细胞体积增大,细胞质增多,胞内出现小脂滴,诱导12 d后,脂滴逐渐增多,油红O染色呈阳性;成骨诱导后,细胞边缘模糊,出现颗粒状结节,经茜素红染色呈阳性。表明获得的绒山羊毛囊干细胞具有多向分化的潜能。     

内蒙古绒山羊毛囊干细胞的成神经诱导及初步鉴定

本研究旨在探究内蒙古绒山羊毛囊干细胞的成神经诱导及初步鉴定。实验采用尼氏染色法对毛囊干细胞向神经细胞分化的情况进行鉴定,利用RT-PCR技术对诱导后的毛囊干细胞进行基因水平检测。结果表明:内蒙古绒山羊毛囊干细胞经成神经诱导后,细胞中有类似神经元的细胞出现,并且细胞周围出现许多微管样的结构,经尼氏染色呈阳性。诱导后神经细胞标记基因β-TubulinⅢ和NSE呈阳性表达,表明内蒙古绒山羊毛囊干细胞具有分化为神经细胞的潜能。     

鸡精原干细胞定向诱导分化特性的研究

取孵化18～20d的鸡胚睾丸，分离精原干细胞（SSCs），培养传代3次后，用特异性化学物质定向诱导分化，以研究鸡培养传代后SSCs保持多向分化的潜能。①用特异的化学物质地塞米松、β-磷酸甘油钠、维生素C诱导鸡SSCs向成骨细胞分化，用Von Kossa＇s法、改良的钙钴法及免疫组化法进行成骨细胞鉴定；②用维甲酸（RA）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）诱导SSCs向神经元样细胞分化，甲苯胺蓝特异染色和组织化学鉴定。③用地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）诱导SSCs向脂肪细胞分化，特异性的油红O染色和脂肪细胞标志基因PPAR7检测。结果显示，SSCs被诱导15～21d后分化为成骨细胞，诱导形成率为80％；Von Kossa＇s染色细胞间布满黑色颗粒，具有矿化基质沉积；改良钙钴法碱性磷酸酶染色胞浆呈深棕色或深黑色，免疫组化染色细胞呈阳性。SSCs被诱导3～7d后分化为神经元样细胞，甲苯胺蓝染色阳性率为85％。SSCs被诱导7～21d后，分化成脂肪细胞，分化率为85％。诱导的脂肪细胞经特异性的油红O染色为阳性，并高表达脂肪细胞标志基因PPARγ。结论：在不同的诱导条件下，SSCs可被定向诱导分化为3种成体细胞，证明其培养传代后仍具有多向分化能力。     

绒山羊羔羊和成年羊前体脂肪细胞的原代培养及传代方法

本试验主要探索绒山羊羔羊和成年羊前体脂肪细胞的培养及传代方法,为研究绒山羊的脂肪代谢机理提供细胞模型。以3月龄阿尔巴斯白绒山羊羔羊肾周脂肪组织为试验材料,采用胶原酶法直接得到羔羊前体脂肪细胞,结合其细胞形态观察、生长曲线和油红O染色进行鉴定;以绒山羊成年羊肾周脂肪组织为试验材料,采用胶原酶法和"天花板"法得到成熟脂肪细胞后,通过去分化得到前体脂肪细胞,诱导分化后利用油红O染色鉴定其向成熟脂肪细胞分化的情况。绒山羊羔羊肾周脂肪组织中前体脂肪细胞的适宜分离条件为0.1%Ⅰ型胶原酶、37℃消化1 h,250×g离心10 min;传代时分离细胞采用0.25%胰蛋白酶消化60 s。细胞形态为梭形,生长曲线呈"S"型,油红O染色结果呈阳性。成年羊采用和羔羊相同的胶原酶法获得成熟脂肪细胞后,通过改进的"天花板"法获得前体脂肪细胞,经诱导分化后,油红O染色结果呈阳性。综上,采用Ⅰ型胶原酶消化法可直接分离培养3月龄绒山羊羔羊的前体脂肪细胞;采用胶原酶法和改进后的"天花板"法分离培养成年绒山羊的前体脂肪细胞是可行的。     

蒙古羊骨髓间充质干细胞的分离培养及多向诱导分化

本研究旨在建立蒙古羊骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)体外分离、纯化、增殖方法,诱导其向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化。穿刺法抽取蒙古羊骨髓组织,采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化BMSC,增殖,并测定其生长曲线及细胞倍增时间。对第3代蒙古羊BMSC进行成脂、成骨及成软骨诱导,观察诱导后的细胞形态。采用油红O、茜素红、HE等染色法在组织学水平对BMSC进行成脂、成骨和成软骨分化鉴定。结果显示,蒙古羊BMSC呈现均一梭形成纤维细胞样生长,生长曲线呈S型,生长增殖能力良好。在不同分化诱导之后,细胞呈现脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞的表型特征。表明获得的蒙古羊BMSC具有多向分化潜能,所分离细胞确为骨髓间充质干细胞。     

南阳牛骨髓间充质干细胞的分离培养及多向分化

本研究旨在建立南阳牛骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养方法,在此基础上研究其生物学特性和多向分化的能力。采用骨髓穿刺法取3月龄小牛的肋骨骨髓,分离培养BMSCs,传代培养并测定其生长曲线,RT-PCR检测Oct4、Nanog、Sox2基因的表达,然后取P3 BMSCs分别向神经和脂肪细胞进行诱导分化,并利用组织学染色技术和RT-PCR技术进行鉴定。结果表明,分离得到的BMSCs大小均匀,多呈梭形的成纤维细胞样生长;RT-PCR可检测到干细胞因子Oct4、Nanog、Sox2的表达;不同代次细胞生长曲线呈S型,一般在第3天时进入指数生长期,第7天后进入平台期;成神经诱导后,甲苯胺蓝染色可见明显的尼氏体结构,RT-PCR检测ENO2和GFAP基因表达呈阳性;成脂肪诱导后,油红O染色后可见大量的脂滴存在,RT-PCR检测Leptin和PPAR基因表达呈阳性。试验证明,成功分离得到了南阳牛BMSCs,且其具有多向诱导分化潜能。     

鸡ES细胞体外定向诱导分化特性的研究

旨在探索鸡胚胎干细胞(ES细胞)体外定向诱导的多向分化潜能.分离鸡X期胚盘细胞,体外培养传代,经鉴定后,采用地塞米松(DEX)、β-甘油磷酸钠(β-GP)和维生素C(VitC)诱导ES细胞向成骨细胞分化;采用维甲酸(RA)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)诱导ES细胞向神经元样细胞分化;采用DEX、胰岛素、IBMX诱导ES细胞向脂肪细胞分化,比较不同浓度组合诱导剂的诱导效果,分别用Von Kossa's染色法、甲苯胺蓝染色法、免疫组化法、油红O染色法和RT-PCR鉴定诱导产生的细胞.结果显示,ES细胞被诱导3～21 d后,分化为成骨细胞,诱导率为40％～72％;被诱导4～7 d后,分化为神经元样细胞,诱导率为71％～84％;被诱导2～21 d后,分化为脂肪细胞,油红O染色阳性,并表达PPARγ基因.结果表明,在体外条件下,ES细胞可被特异的化学物质定向诱导分化为成骨细胞、神经元样细胞和脂肪细胞,具有多向分化潜能.     

鸡肌腱干细胞的分离培养与初步鉴定

为了建立鸡肌腱干细胞的分离培养体系和鉴定方法,试验使用Ⅰ型胶原酶消化20日龄鸡胚肌腱组织,低密度接种得到鸡肌腱干细胞,用结晶紫染色细胞克隆团块,选择50,500,5 000个/cm~2密度接种7~10 d,镜下观察细胞形态,用细胞计数仪测定细胞增殖能力,用分化诱导试剂对细胞进行成脂与成骨分化诱导,采用油红O和碱性磷酸酶进行染色鉴定。结果表明:原代细胞及传代细胞为长梭形,接种7~10 d后开始形成克隆团块,细胞生长曲线呈S型。500个/cm~2的细胞密度接种细胞克隆能力与增殖能力最强;将该密度接种细胞消化后,按1×10~4个/cm~2接种,分别对其进行成脂与成骨诱导,可发现成脂分化过程中有脂滴形成,油红O染色呈阳性;成骨分化过程中有钙结节形成,碱性磷酸酯酶染色呈阳性。说明消化20日龄鸡胚肌腱组织可成功分离出鸡肌腱干细胞,克隆增殖能力强,且具有分化多种细胞的潜能。     

猪骨髓间充质干细胞分离培养和诱导分化脂肪细胞

采用全骨髓培养法分离猪骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)并传代培养;取第4代纯化的MSCs在成脂诱导培养基中诱导分化;分化的成脂细胞用形态学和油红O染色法进行鉴定;用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测成脂分化标志基因PPARγ2和LPL mRNA的表达情况。结果显示,分离培养的猪MSCs细胞经连续传代形态上无明显改变;MSCs在成脂分化培养液中诱导分化2d开始有少量脂滴出现,油红O染色成阳性,诱导18d成脂转化率可达59.8%;在诱导分化第5、10、15天时,PPARγ2mRNA相对表达量分别是(5.065±0.159)、(6.268±0.340)、(9.277±0.261),LPL mRNA的相对表达量分别是(10.995±1.473)、(13.130±0.712)、(15.762±0.934)。结果表明,用本诱导条件诱导猪MSCs向脂肪细胞分化,经形态学和油红O染色鉴定,成脂细胞分化率可达60%,且随分化时间的延长,脂肪细胞标志基因表达增加。     

牛骨骼肌卫星细胞的分离鉴定和诱导分化

为了在体外研究西门塔尔牛的肌肉生长发育过程并建立牛骨骼肌卫星细胞的原代细胞模型。本研究采用0.2%的Ⅱ型胶原酶消化后再使用0.25%胰酶消化获得牛骨骼肌卫星细胞（bovine skeletal satellite cell，BSSC），并利用差速贴壁法分离获得纯化后的BSSC，使用RT-PCR、免疫荧光染色和Western blotting等方法鉴定BSSC，使用成脂诱导剂诱导其分化为脂肪细胞，油红O染色鉴定分化后细胞的成脂能力，使用2%马血清诱导其分化为肌细胞，RT-PCR鉴定静止期PAX7基因和肌细胞的标记基因MyoG在诱导前后表达量的变化。结果发现，分离纯化得到的BSSC呈梭形或纺锤形，细胞形态饱满，折光性强，随着培养时间的延长，细胞由原来的无序生长变为有序生长；RT-PCR检测发现，BSSC表面标志基因Desmin、c-Met、Myf5和特异性标志基因PAX7均呈阳性表达；免疫荧光染色及Western blotting结果显示，PAX7和MyoD基因均呈阳性表达；成脂细胞诱导分化后被油红O大量染色并观察到大量脂滴出现；成肌细胞诱导分化后静止时期PAX7基因表达量诱导前高于诱导分化后，而成肌标记基因MyoG表达量诱导前低于诱导分化后。综上，本研究成功分离获得BSSC，并证明BSSC具有分化成脂肪细胞和肌细胞的能力，为体外研究西门塔尔牛肉制品调控机制提供原代细胞模型。     

西门塔尔牛表皮干细胞的分离培养与生物学特性研究

旨在建立西门塔尔牛表皮干细胞(epidermal stem cell, EpSCs)分离培养体系,探究其生物学特性,为西门塔尔牛种质资源保存提供新方法,为干细胞治疗研究提供种子细胞。采用3～4月龄西门塔尔牛背部表皮,通过酶消化法和组织贴壁法两种方法分离培养西门塔尔牛EpSCs,绘制EpSCs生长曲线探讨其增殖能力。通过免疫荧光鉴定EpSCs表面标记物(ITG β1、P63和CD71),通过RT-PCR分析EpSCs特异性基因(ITG β1、KRT19和ITG α6)表达情况。通过体外诱导EpSCs分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞检测其分化潜能。结果显示,组织块贴壁法获得的EpSCs纯度较低,酶消法获得的EpSCs纯度较高,细胞传代至P28代时开始逐渐老化。EpSCs细胞生长曲线呈“S”型。免疫荧光结果显示EpSCs表面特异性标记物ITG β1、P63和CD71呈阳性表达,RT-PCR结果显示EpSCs高度表达ITG β1、KRT19和ITG α6,不表达CD31基因。EpSCs诱导分化脂肪细胞时,产生可被油红O着色的脂滴,经鉴定细胞阳性表达脂肪细胞PPAR-γ和LPL特异性基因。Ep...     

IGLL1基因在奶牛乳腺组织中的表达量差异分析

免疫球蛋白λ多肽1(immunoglobulin lambda-like polypeptide 1,IGLL1)是一种具有编码蛋白质特性的基因,位于17号染色体上。通过本实验室前期的奶牛乳腺组织转录组测序研究表明,IGLL1基因可能对奶牛乳脂的合成代谢产生影响。本试验以中国荷斯坦奶牛乳腺组织为研究对象,选取3头高脂中国荷斯坦奶牛,3头低脂中国荷斯坦奶牛的乳腺组织提取RNA并反转录为c DNA,进行RT-PCR,并对数据进行统计分析,研究IGLL1基因在奶牛乳腺组织中的表达差异。结果显示,该基因在高脂奶牛及低脂奶牛的乳腺组织中均有表达,且高脂奶牛的乳腺组织中的表达量显著高于低脂奶牛的表达量(P=0.0370.05)。研究表明,IGLL1基因可能对中国荷斯坦奶牛的乳脂的合成或代谢产生影响。该研究为奶牛的优良品种选育提供了试验基础。     

绵羊骨髓间充质干细胞分离培养与鉴定

旨在分离绵羊骨髓间充质干细胞(sheep bone marrow mesenchymal stem cells, SBMSC),建立绵羊骨髓间充质干细胞系,为相关研究提供种子细胞。取新生健康绵羊肋骨为试验材料,利用贴壁法分离获得SBMSC;取生长良好的P3代细胞通过免疫荧光,进行CD73、CD90、CD105、CD106表型鉴定;取生长良好的P3代细胞分别进行成软骨、成脂、成骨方向的诱导,对诱导结果分别进行阿利新蓝、油红O和茜素红染色,鉴定分化结果。SBMSC呈成纤维样贴壁生长;体外培养P3代细胞表面标记物CD73、CD90、CD105和CD106完全符合标准;P3代细胞经软骨、脂肪、骨方向诱导3周后,经阿利新蓝染色,细胞呈亮蓝色;经油红O染色,细胞质内出现橙红色脂滴;茜素红染色表明聚集的细胞团中央能形成钙化结节。说明SBMSC经体外诱导培养后可向软骨细胞、脂肪细胞和成骨细胞分化,并具有明显的成软骨、成脂和成骨表型,表明SBMSC具有多向分化潜能。通过贴壁培养法建立了SBMSC完整的体外培养体系,为绵羊育种等方面提供种子细胞。     

荷斯坦奶牛乳腺干细胞的分离纯化与初步鉴定

本研究以荷斯坦奶牛乳腺为研究对象,旨在建立奶牛乳腺干细胞体外分离培养方法及纯化体系并对其进行初步鉴定。消毒清洗后的组织小块400 IU/m L胶原酶、37℃环境下消化20 h,初步分离得到乳腺干细胞,悬滴培养法对其进行筛选纯化,再对纯化乳腺干细胞的候选表面标记进行检测。结果表明:获得的干细胞具有自我增殖能力,并在悬滴培养条件下能够形成类似乳腺球结构细胞团,而且,不仅表达干细胞标记基因Sox2、Nanog,还表达乳腺干细胞参考标记基因CD24、CD29、CD49f,初步认定分离纯化的细胞为乳腺干细胞。     

荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞的体外培养

用外科手术的方法采取健康的泌乳期荷斯坦奶牛乳腺组织,采用机械剪切结合酶消化的方法,在体外进行原代乳腺上皮细胞分离培养。结果成功地培养出荷斯坦奶牛原代乳腺上皮细胞。显微镜下观察,细胞形成单层呈鹅卵石样;角蛋白免疫组化染色后,呈现阳性反应。经数次传代后,细胞增殖依旧旺盛。     

猪乳腺干细胞的分离培养及EGFP基因转化

利用乳腺干细胞培养技术体系,从成年猪乳腺组织中分离培养乳腺干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入乳腺干细胞,诱导转基因乳腺干细胞向乳腺上皮细胞分化,观察其分化特点。结果成功分离培养出乳腺干细胞,获得转EGFP基因乳腺干细胞,它们在表达EGFP的同时仍具有分化潜能,能分化成梭形和扁平状细胞。结果表明,从成年猪乳腺组织中分离乳腺干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因乳腺干细胞具有自我更新、增殖和分化潜能,可以用EGFP基因对乳腺干细胞进行标记、追踪,为EGFP基因作为示踪标记对乳腺干细胞用于体内移植研究奠定了基础。     

奶牛乳腺组织中ACSL5基因的表达量差异分析

旨在分析高蛋白和低蛋白中国荷斯坦奶牛的乳腺组织中ACSL5基因表达量差异。以高蛋白的中国荷斯坦奶牛及低蛋白的中国荷斯坦奶牛为研究对象,分别提取乳腺组织总RNA,运用实时定量荧光PCR技术,检测奶牛乳腺组织中ACSL5基因的表达量。结果显示:在所检测的6头不同奶牛的乳腺组织中,ACSL5基因均有表达,且在高蛋白奶牛乳腺组织中的表达量显著低于低蛋白奶牛的乳腺组织(P0.05)。结果表明,本试验初步验证ACSL5基因的表达可能与奶牛的乳蛋白具有相关关系,为进一步对ACSL5基因的生物学功能和作用机制的研究奠定了基础。     

猪肌源性前体脂肪细胞的分离培养和成脂诱导分化研究

本研究旨在建立猪肌源性前体脂肪细胞的体外培养体系,并探究成脂诱导分化过程中相关基因的表达,为进一步研究调控猪肌内脂肪沉积的分子机制提供试验材料。采集15日龄仔猪的背最长肌组织,使用Ⅱ型胶原酶进行消化,分离获得前体脂肪细胞,进行原代、传代培养以及成脂诱导,观察细胞形态、测定生长曲线、油红O染色鉴定以及检测成脂关键基因PPARγ、FABP4、C/EBPα、C/EBPβ、ZFP423、SREBP1、PRDM16和HSL在诱导分化过程中的表达量。结果表明,分离的猪肌源性前体脂肪细胞在6～7 h,发现少量细胞开始贴壁,贴壁的细胞呈似圆型、小梭型以及其它不规则形状,经传代后细胞形态均一,呈典型的成纤维细胞样,细胞的生长曲线呈S型。添加分化培养基进行诱导后,所有基因在细胞分化的早期均有表达,FABP4、C/EBPα、SREBP1与PPARγ基因在分化早期表达量极显著升高(P 0. 01),在后期表达量极显著下降(P 0. 01),C/EBPβ、ZFP423和PRMD16基因的表达量在分化过程中未见显著变化,HSL的表达量随着分化进行极显著降低(P 0. 01)。在诱导分化12 d左右,油红O染色呈现红色。综上表明,本研究成功建立了猪肌源性前体脂肪细胞的分离与培养体系,进行成脂诱导分化,揭示分化过程中关键基因的表达规律,为进一步研究猪肌内脂肪沉积的分子机制和改善肉质品质奠定基础。     

盘羊脐带间充质干细胞的分离培养及诱导分化

试验旨在研究野生盘羊脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs）的分离、培养及体外多向分化潜能等生物学特性。取盘羊分娩后的新生雄性胎儿脐带,采用组织块培养法分离盘羊UC-MSCs后进行体外培养,并对UC-MSCs进行成骨、成软骨和成脂诱导分化,检测其多向分化潜能。结果显示,应用组织块培养法获得的盘羊UC-MSCs具有UC-MSCs特有的呈簇、成纤维状的特性,细胞呈"S"型曲线生长,细胞的倍增时间平均为33.50 h,且可以向成骨细胞、成软骨细胞和成脂细胞分化。诱导分化特异性染色结果表明,野生盘羊UC-MSCs经诱导后的成骨细胞经茜素红S染色呈现典型的橙红色钙沉积物聚集,成软骨细胞经阿利新蓝染色呈现蓝色的软骨基质,成脂细胞经油红O染色呈现深红色的脂滴。实时荧光定量PCR检测结果发现,随着诱导时间的延长,成骨分化的细胞中骨内γ-羧基谷氨酸蛋白（BGLAP）、骨桥蛋白基因（OPN）、Runt相关转录因子2（RUNX2）基因的相对表达量极显著升高（P<0.01）;成软骨分化的细胞中光蛋白聚糖（LUM）基因的表达量明显增加,而双糖链蛋白多糖（BGN）和Y染色体性别决定区基因盒9（SOX9）基因表达量极显著提高（P<0.01）;成脂分化的细胞中脂蛋白酶（LPL）和过氧化物酶体增殖因子活化受体γ（PPAR-γ）基因的相对表达量极显著上升（P<0.01）。试验结果表明,用盘羊胎盘附带的脐带组织可以分离到盘羊UC-MSCs,且分离到的UC-MSCs具有分化为成骨细胞、成软骨细胞及成脂细胞等多向分化潜能。