细胞密度对猪圆环病毒增殖与检测准确度的影响

为了提高猪圆环病毒毒液生产批次间滴度的稳定性,提高培养毒液病毒滴度检验和成品疫苗效力检验的准确度,本实验对PK15细胞接种密度进行了研究。结果显示:病毒培养阶段,细胞最佳接种密度为2~2.5×10~5/m L,毒液滴度和疫苗效力检验时,最佳细胞接种密度为1.5~2×10~5/m L。     

猪圆环病毒2型ZJ/C株增殖条件的优化

为了在PK15细胞上获得更高滴度的猪圆环病毒2型(PCV2)ZJ/C株,本实验优化了细胞接种密度、接毒方法、接毒量与收获时间和冻融次数等条件。结果表明接种密度在2.5×10~5个/m L,同步接毒加D-氨基葡萄糖处理,接毒量为2%,接毒后90h收获,-20℃冻融2次,PCV2-ZJ/C株增殖效果最好。该结果为猪圆环病毒2型灭活疫苗(ZJ/C株)的生产提供了依据。     

微载体生物反应器按不同细胞密度培养猪圆环病毒2型的研究

本试验旨在探讨微载体生物反应器使用不同PK15细胞密度培养猪圆环病毒2型的效果,对比不同细胞密度培养出的抗原效价,从而选择最佳细胞密度培养猪圆环病毒2型,提升猪圆环病毒2型抗原效价。在生物反应器细胞上罐时分别按每个微载体20、30、40、50个细胞的细胞密度接种至4台相同的生物反应器罐中进行培养,每罐均按相同的条件培养,在分别培养4 h、24 h、48 h、96 h时取样观察细胞的生长状态并统计细胞密度,当大部分载体细胞脱落70%时收获抗原,并留样检测其抗原效价。结果显示:每个微载体40个细胞的细胞密度上罐培养的效果最好,表现在4 h时细胞贴附微载体较均匀,24 h时90%微载体长满单层细胞,48 h时细胞生长致密,细胞密度增长8倍,72 h时细胞增长7倍,最终收获抗原效价最高达到107.5TCID50/m L。结果表明:每个微载体40个细胞的接种密度上罐,培养效果最好,效价最高。因此,在微载体生物反应器上培养猪圆环病毒2型时,选择合适的细胞密度接种是保证培养高效价病毒的一个重要前提。     

PK15细胞的无血清全悬浮驯化研究

目前PK15细胞主要用于生产猪圆环病毒2型,传统的培养工艺为滚瓶系统或微载体系统,该两种培养系统都存在各自的劣势。驯化一株全悬浮的PK15细胞可推进工艺的进一步升级,降低成本的同时也简化了培养工艺且更易于产业化。经贴壁降血清培养、低血清悬浮优化传代、无血清悬浮传代培养,对一株贴壁的PK15细胞进行了无血清的全悬浮驯化。传代23次后,该株细胞无血清全悬浮培养初始密度为0. 5×106/m L,在72 h密度可增殖到4. 0×106/m L左右,形态良好,倍增时间稳定,且细胞活率达到95%以上,命名为PK15-S,为大规模培养PK15细胞提供了理论依据。     

低血清培养工艺在猪圆环病毒Ⅱ型灭活疫苗生产中的应用

为了减少血清在兽用生物疫苗生产中的使用量,降低兽用生物疫苗的生产成本,减少因血清引起的接种动物过敏反应,提升兽用疫苗产品质量稳定性,试验采用低血清培养PK-15细胞和猪圆环病毒Ⅱ型的方法对猪圆环病毒Ⅱ型灭活疫苗的抗原效价进行了研究。结果表明:低血清培养的PK-15细胞生长更快且收获的抗原效价更高,均能稳定在1×10~(6.50)TCID_(50)/m L以上。说明猪圆环病毒Ⅱ型低血清培养工艺已经比较成熟,可以应用到猪圆环病毒Ⅱ型灭活疫苗的生产中,从而降低疫苗生产成本,提升产品质量稳定性。     

无血清全悬浮PK15细胞培养猪圆环病毒2型的研究

为改进猪圆环病毒2型的培养工艺,驯化了一株可无血清培养的全悬浮PK15细胞用于培养猪圆环病毒2型,并对病毒的敏感性、接毒时间、接毒量、收获方法进行了试验.结果表明,用该细胞培养猪圆环病毒2型,如果采用批次收获,接毒时细胞密度为0.5×106/mL,接毒量为0.1 MOI,接毒72 h后收毒,病毒滴度能达到106.4 T...     

猪圆环病毒1型和2型核酸定性标准样品的研制

为了研制猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)核酸定性标准样品,分别将PCV1和PCV2病毒全序列克隆至pMD18-T载体中并进行稀释分装。制备后进行均匀性评估、稳定性评估、定值和临床试用。结果:制备的标准样品的参考值分别为:1.33×10⁴ copies/μL(PCV1)和1.11×10⁴ copies/μL(PCV2);样品均匀;-20℃可稳定保存24个月以上,4℃可稳定2个月以上。经国家标准化管理委员会组织的专家评审,达到了国家标准样品的要求,可作为核酸扩增检测的猪圆环病毒核酸标准样品。     

猪圆环病毒2型高敏感性细胞的克隆

利用有限稀释法从现有PK15细胞系中克隆出一株对猪圆环病毒2型具有高敏感性的细胞克隆株PKK,初步研究了该克隆株对猪圆环病毒2型增殖的特性及稳定性。间接免疫荧光实验结果表明将该克隆株连续传代50代后对猪圆环病毒2型感染性不变,病毒滴度最高可达10^7.0TCID50/mL.这一研究结果将有利于进一步研究猪圆环病毒2型体外复制、体外诊断及开发高效价的PCV2全病毒灭活疫苗。     

猪圆环病毒2型SD/2008株的分离鉴定及培养特性

应用PK15细胞从山东省某猪场分离到1株病毒,通过免疫过氧化物酶单层试验和全基因组序列分析,证明该分离株为猪圆环病毒2型(PCV-2,命名为SD/2008株),基因组全长1767bp,为PCV-2b基因型;感染PK15细胞后96h病毒含量最高,培养液含病毒基因组1.72×108copies/μL,连续培养120h不出现细胞病变;连传5代,病毒滴度稳定,维持在106TCID50/0.1mL左右;传代PK15细胞时同步接种病毒后18h,用300mmol/L的D-氨基葡萄糖处理细胞,病毒滴度可以提高5.62倍。     

猪圆环病毒2型PK15细胞系高敏感性细胞的克隆

利用有限稀释法从现有PK15细胞系中克隆出一株对猪圆环病毒2型具有高敏感性的细胞克隆株PKK,初步研究了该克隆株对猪圆环病毒2型增殖的特性及稳定性。间接免疫荧光实验结果表明将该克隆株连续传代50代后对猪圆环病毒2型感染性不变,病毒滴度最高可达107.0TCID50/mL。这一研究结果将有利于进一步研究猪圆环病毒2型体外复制、体外诊断及开发高效价的PCV2全病毒灭活疫苗。     

单克隆抗体间接免疫荧光检测猪瘟病毒方法的建立

以作者制备的抗猪瘟病毒单克隆抗体(anti-CSFV McAb)为一抗、荧光素标记羊抗小鼠IgG为二抗,通过反应条件的优化,建立检测猪瘟病毒抗原的间接免疫荧光(IFA)检测方法。确定IFA最佳工作条件:CSFV最佳接种浓度和培养条件为CSFV 10-3倍稀释后接种PK15细胞,37℃5%CO2恒温箱中培养36 h;McAb最适工作浓度为1∶1 000倍稀释;荧光素标记的羊抗小鼠IgG荧光抗体的最适工作浓度为1∶50倍稀释。特异性试验表明,用建立的IFA检测方法检测CSFV感染PK15细胞为阳性,而检测伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪2型圆环病毒(PCV-2)感染PK15细胞均为阴性。结果表明,建立的检测细胞培养中CSFV抗原的IFA检测方法具有敏感特异、简便快速等优点,可用于CSFV感染的实验室诊断及CSFV在感染细胞中的定位和动态分布研究。     

犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

犬圆环病毒(DogCV)是圆环病毒科新发现的圆环病毒,旨在建立犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法。试验用PCR方法克隆犬圆环病毒ORF2基因保守区域,构建标准阳性质粒pClon007-ORF2。以标准阳性质粒pClon007-ORF2为模板对荧光定量PCR反应体系进行优化。结果表明,所建立的方法 Ct值与标准品在4.67×10~9 copies/μL~4.67×10~3 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-3.445。该方法检测灵敏度为4.67×10~1copies/μL。该方法对狂犬病病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型等犬常见病原的检测均无交叉反应;所有稀释度标准品模板均在83.35℃出现窄的特异性熔解峰。临床样品检测表明,所建立的实时荧光定量PCR对犬圆环病毒的阳性检测率为12.50%(4/32)。     

猪圆环病毒3型半巢式PCR方法的建立和应用

为建立快速检测猪圆环病毒3型(PCV-3)的方法,以Gen Bank上登陆的我国PCV-3全基因组为参考毒株,设计3条引物,建立了PCV-3半巢式PCR诊断方法。本方法可以扩增出大小为249 bp的特异性条带,与预期大小一致,而猪圆环病毒1型和2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒等对照样品均未扩增出特异性条带。将PCV-3的阳性DNA稀释后作为模板,发现半巢式PCR的检测极限可以达到5×10~(-3)μg/m L。对临床80份样品进行检测,发现半巢式PCR的阳性检出率可以达到27.5%(22/80),而常规PCR的检出率仅为6.25%(5/80)。检测结果表明,本文建立的半巢式PCR方法较为准确、特异和敏感,适用于PCV-3的快速检测和流行病学调查。     

热应激对嵌合猪圆环病毒1-2在PK-15细胞中增殖的影响

为提高表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的重组猪圆环病毒1型(PCV1)疫苗株(嵌合猪圆环病毒1-2,PCV1-2)在细胞内的增殖水平,本研究采用PK-15细胞,应用活细胞计数、间接免疫荧光及Taq Man荧光定量PCR等方法测定不同热应激温度和持续时间处理后细胞生长和病毒增殖的情况。结果显示,PK-15细胞可耐受41℃和43℃的培养环境,并且与常规培养方法相比43℃条件下热应激处理12 h可显著促进PCV1-2在细胞内的增殖,其病毒效价可达10~(6.0)TCID(_50)/m L以上。另外,热应激处理后病毒核酸拷贝数的动态变化表明,热应激对PCV1-2复制的影响主要在接毒后24 h至48 h内显现。本研究确定了促进PCV1-2增殖的热应激条件,为提高PCV1-2疫苗产量提供了方法。     

液相芯片技术同时检测六种猪繁殖障碍病毒的方法研究

在GenBank中收集猪细小病毒(PPV)结构蛋白VP2基因、猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF2序列、猪伪狂犬病毒(PRV)的gB基因、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的NSP2基因、猪瘟病毒(CSFV)的E2基因和乙型脑炎病毒(JEV)的M基因,利用Primer5.0等分子生物学软件对收集的序列分析比较,筛选出上述基因的特异保守序列并设计引物和探针,将设计好的探针与相应的微球偶联,优化条件,建立检测方法。结果表明:建立的检测PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV、JEV6种病毒核酸的多重液相芯片技术具有较好的特异性、敏感性和稳定性,对PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV、JEV6种病毒核酸的最低检出量分别为8.50×10~2copies/μL、2.87×10~2copies/μL、2.07×10~2copies/μL、2.61×10~2copies/μL、2.34×10~2copies/μL、2.05×10~2copies/μL,与相应病毒PCR/RT-PCR检测方法相比,敏感性提高了100~1000倍;对临床388份样品同步进行荧光PCR与液相芯片检测,结果99.87%相符。本方法为液相芯片技术在动物多病毒快速高通量检测、鉴别诊断等应用方面奠定了基础。     

PCV2感染性克隆的构建与拯救病毒在不同细胞系中的增殖特性

将猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染性克隆分别转染到猪肾上皮细胞(PK15)和猪小肠上皮细胞(J2)中获得拯救病毒PCV2,比较病毒在2个细胞系中的复制动力学差异。设计特异性引物,通过PCR法和Over-lap PCR技术获得含1.1个拷贝PCV2基因组的DNA片段,克隆于p SP72载体获得PCV2感染性克隆。用PCV2感染性克隆分别转染PK15和J2细胞,Real-time PCR和间接免疫荧光试验(IFA)检测结果表明:拯救病毒可在PK15和J2细胞系中分别连续盲传10代以上,且PK15培养的PCV2基因组的拷贝数极显著高于J2培养的(P0.01),提示获得的PCV2拯救病毒在PK15的增殖性能优于J2,为进一步探索PCV2基因组的功能及PCV2相关发病机制奠定了基础。     

辽宁省某规模化猪场猪圆环病毒Ⅱ型的PCR检测

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是迄今为止发现的最小的一种脊椎动物病毒。PCV分为无致病性(或PK15源性)的猪圆环病毒Ⅰ型(PCV-1)和有致病性(PMWS源性)的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)两个基因型[1-2]。PCV-1广泛存在于猪体内及猪原代细胞系中,无致病性,不能引起细胞病变;     

陶氏格利特GLUTEX GS2消毒剂对猪圆环病毒杀灭效果研究

本研究参照美国国家环境保护局(EPA)关于消毒剂在干燥的非生物表面的抗病毒效果测评方法,分别评定了两个批次格利特GLUTEXTMGS2消毒剂对猪圆环病毒2型的效力.结果表明:分别经1 200 mg/kg合成硬水稀释至含1 000 mg/kg戊二醛的格利特GLUTEXTM GS2消毒剂处理干燥猪圆环病毒2型30 min后或含2 500mg/kg戊二醛的GLUTEXTMGS2消毒剂处理干燥猪圆环病毒2型15 min后,对病毒活性的降低大于4log,具有强抗猪圆环病毒2型效力,是抗病毒剂.     

猪圆环病毒2型RPA恒温扩增检测方法的建立及初步应用

利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),以猪圆环病毒2型Cap基因的保守序列为靶序列设计并筛选出一组特异性的引物和探针,建立了快速检测猪圆环病毒2型核酸的RPA方法。试验结果表明,该方法特异性强,猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)核酸检测结果均为阴性,灵敏性高,最低可检出核酸浓度为0. 87×10-4ng/μL,简单快速,且重复性好。利用所建立的RPA方法对183份临床样品进行检测,结果与实时荧光PCR方法符合率为98. 9%。本研究为猪圆环病毒2型核酸的快速检测提供了一种新方法,尤其适合基层实验室或养猪场的快速检测。     

适合猪圆环病毒2生长的PK15均质细胞株的构建

<正>为筛选出PCV2培养滴度最高的PK15细胞克隆株,采用稀释法从PK15混合细胞中分离单细胞克隆株,获得的细胞克隆用于接毒试验,即用同步接种法将猪圆环病毒2(PCV2)病毒细胞混合液以1∶100的比例接种单克隆细胞,接毒后经PCR与定量PCR检测得出A10细胞克隆培养PCV2,获得的病毒含量最高。将A10细胞进行第