单增李斯特氏菌溶血素基因的克隆及原核表达

参考GenBank收录的单增李斯特菌Hly基因序列,设计1对引物,采用PCR技术扩增出单增李斯特氏菌的溶血素基因Hly(不含有信号肽部分),得到一条1590bp的条带。将其连入pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定和序列测定法进行鉴定。测序正确后,将该基因插入到pET-28a中构建原核表达载体pET-28a-sHly,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,将诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果显示,Hly基因可以在大肠杆菌中获得表达,表达产物分子质量约为65kU,与预期蛋白质分子质量大小一致。经Western-blotting鉴定可知,诱导表达产物以可溶形式存在,可被兔抗LM阳性血清特异识别,具有较好的抗原活性,为进一步研制基于溶解素蛋白的诊断抗原和特异性单克隆抗体,开展LM的致病与免疫机理研究奠定基础。     

溶血素基因缺失对单增李斯特菌在小鼠肠道内定殖的影响

旨在探究单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)溶血素hly、llsB基因对小鼠肠道的影响。在构建Lm的hly基因缺失株基础上,以Lm90SB2及溶血素基因缺失株Lm90SB2-Δhly、Lm90SB2-ΔllsB为试验菌,进行生长曲线、溶血活性以及器官载菌量的测定。结果：缺失株在不同条件下的生长特性与亲本株相比无明显差异;Lm90SB2、Lm90SB2-ΔllsB的溶血效价分别为1log2、2log2,而Lm90SB2-Δhly基本无溶血现象。缺失株Lm90SB2-Δhly、Lm90SB2-ΔllsB的肠道载菌量均低于亲本株Lm90SB2(P<0.05),在各个时间点肠道中的细菌定殖率依次为Lm90SB2>Lm90SB2-Δhly>Lm90SB2-ΔllsB。本研究表明,hly、llsB基因对Lm在小鼠肠道内定殖可能有直接或间接的调控作用,试验结果为进一步研究hly、llsB基因在Lm致病过程中的作用提供一定的理论依据。     

单增李斯特菌内化素家族蛋白的研究进展

单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种革兰阳性病原菌,是食源性李斯特菌病的病原体,在免疫力低下的人和动物中能够引起高死亡率.该菌致病的关键是其能在非吞噬细胞发生内化作用并在其中存活.内化素家族蛋白(internalins)在单增李斯特菌感染过程中起着至关重要的作用,该族蛋白是一组以...     

黄芩提取物对猪链球菌溶血素抑制作用的试验

为了治疗和控制猪链球菌病,本文通过最小抑菌浓度、生长曲线的测定以及溶血试验等筛选针对猪链球菌溶血素(Suilysin,SLY)的抑制剂,研究发现较低浓度的黄芩提取物对猪链球菌几乎没有抗菌活性,但可以显著抑制猪链球菌SLY所诱导的溶血活性;并且黄芩提取物可以显著降低猪链球菌感染所引发的细胞损伤;此外,体内研究发现,黄芩提取物可降低猪链球菌感染小鼠的死亡率。综上,本研究结果表明,黄芩提取物可以通过抑制SLY的生物活性而在猪链球菌感染中发挥治疗作用,是一种具有开发价值、治疗猪链球菌感染的先导复合物。     

单增李斯特氏菌检验

本研究对肉、胴体拭子等400份单增李斯特氏菌样品进行前增菌,然后用荧光PCR方法对前增菌样品进行检测,挑取阳性样品进行后续的分离、鉴定.结果显示,本研究在传统单增李斯特氏菌分离、鉴定方法基础上增加了荧光PCR初步筛选,提高了检测的灵敏度与特异性,省工省时,最终分离到5株单增李斯特氏菌.     

产单核细胞李斯特菌溶血素的纯化

本文旨在探讨产单核细胞李斯特茵溶血素（LLO）的纯化方法。将产单核细胞李斯特茵（LM）接种于BHI液体培养基中培养,得到含LLO的培养液上清（LLO1）,再经70％饱和硫酸铵沉淀、透析,得到溶血素粗提物（LLO2）,LLO2经凝胶过滤层析,聚乙二醇浓缩,得到活性峰收集液（LLO3）。通过以上三步的纯化,溶血素的比活提高160倍,纯化蛋白在SDS-PAGE中呈现一条带,达电泳级纯度。     

单增李斯特菌溶血素S llsB基因缺失株的构建及部分生物学特性研究

为分析单增李斯特菌溶血素S(listeriolysin S,LLS)llsB基因缺失对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)生物学特性的影响,本研究利用同源重组构建了llsB基因缺失株LM90-ΔllsB,并以8周龄、体重40g±5g的健康昆明系雄性小鼠为试验动物对其生长特性、半数致死量(LD50)、脏器载菌量等生物学特性进行了初步研究。结果显示,本研究成功构建了llsB基因缺失株;缺失株在体外连续培养20代过程中能稳定遗传。通过生长曲线测定发现,llsB基因缺失株生长活性略高于亲本株;小鼠感染试验结果显示,亲本株和缺失株的LD50分别为106.17和106.50 CFU;与亲本株相比,缺失株在小鼠肝脏和脾脏中的载菌量均极显著减少(P0.01),说明缺失株对小鼠的感染能力明显减弱。在小鼠脑中未检出单增李斯特菌。综上所述,llsB基因对LM90的部分生物学特性可能有直接或间接的调控作用,本试验结果为进一步研究LLS的致病机理及防控李斯特菌病提供一定的理论依据。     

单增李斯特菌溶血素LLS/LLO缺失株的构建及小鼠免疫保护性研究

旨在探究单增李斯特菌溶血素S/O(LLS/LLO)对单增李斯特菌(LM)的部分生物学特性影响及单增李斯特菌溶血素S/O基因缺失株的免疫原性。利用同源重组技术在本实验室已成功构建并保存的LM90SB2Δlls菌株基础上构建LM90SB2Δlls-Δllo,并绘制LM90SB2和LM90SB2Δlls-Δllo的生长曲线，测定半数致死量(LD₅₀)、组织载菌量(同时采用灌服和腹腔注射方式)等，进行小鼠免疫保护性研究，分析溶血素基因llsB/hly缺失对LM的生长特性以及毒力的影响。结果：成功构建LM90SB2Δlls-Δllo缺失株，且能在体外稳定遗传。测定生长曲线，LM90SB2的生长活性略高于LM90SB2Δlls-Δllo; LM90SB2的LD₅₀为3.65×10^7.23 CFU,LM90SB2Δlls-Δllo的LD₅₀大于2.7×10⁹ CFU;通过灌服及腹腔注射，与LM90SB2相比，LM90SB2Δlls-Δllo在小鼠脑、肝、脾中的载菌量均明显减少，差异极显著(P...     

重组产单核细胞李斯特菌溶血素的应用研究

李氏杆菌溶血素(Listeriolysin,LLO)是产单核细胞李斯特菌的主要毒力因子,为探索LLO的免疫保护性和作为诊断抗原的可行性,本研究用重组LLO抗原和单核细胞增多性李氏杆菌(Listeria monocytogenes,LM)全菌分别免疫BALB/c小鼠和家兔,定期采血,ELISA检测抗LLO的抗体水平,并分别对免疫和对照动物攻毒致死剂量的LM,分析重组LLO抗原的免疫保护性。结果表明,小鼠和家兔在二免后10~20 d内LLO的抗体即可达到峰值,而且免疫动物能有效抵抗LM的感染。因此,重组LLO不仅可以用作动物LM的诊断抗原,而且具有作为基因工程疫苗的潜力。     

黄芩提取物抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素溶血活性的研究

α-溶血素(αHL)是金黄色葡萄球菌(S.aureus)重要的毒力因子,为研究黄芩醇提物对αHL溶血活性的抑制作用,本研究通过乙醇回流提取法获得黄芩醇提取物,测定其对S.aureus的最小抑菌浓度(MIC)、对αHL表达和生物学活性的影响以及对αHL介导的A549细胞损伤的保护性作用.试验结果显示,黄芩醇提取物对所测试的S.aureus的MIC均高于2048 μg/mL;黄芩醇提取物能够抑制S.aureus培养物上清中的αHL的溶血活性,并呈浓度依赖关系,但对αHL的表达并无抑制作用;而且黄芩醇提取物也能够呈剂量依赖关系缓解S.aureus αHL介导的对A549细胞损伤作用.该结果表明黄芩醇提取物能够以某种形式导致αHL丧失生物活性,并提示黄芩醇提取物是一种潜在的抗S.aureus感染的复合物.     

糖基转移酶GalU对单增李斯特菌致病性的影响

为了探明糖基转移酶GalU对单增李斯特菌致病性的影响,本研究利用同源重组技术构建了galU基因缺失株,分析了亲本株ScottA、缺失株ΔgalU和回补株CΔgalU的生长能力、对细胞的黏附侵袭能力以及对小鼠的致病性。生长试验结果显示,galU基因缺失并不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力。细胞侵染试验结果显示,ΔgalU对肠上皮细胞Caco-2的黏附率(0.74±0.18)%和侵袭率(0.70±0.10)%均显著低于亲本株ScottA的黏附率(2.01±0.11)%和侵袭率(2.48±0.25)%,回补株CΔgalU与亲本株的黏附侵袭率则并无显著性差异。免疫印迹结果显示,内化素InlB在ΔgalU细菌表面的锚定量显著低于亲本株,但其表面InlA的锚定量与亲本株并无显著性差异。小鼠试验结果显示,ΔgalU感染的小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量分别为(3.76×10~7±1.41×10~7)CFU/g和(2.88×10~7±2.31×10~7)CFU/g,均显著低于亲本株感染小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量;此外,ΔgalU感染组小鼠的存活率高于亲本株,但与回补株感染组小鼠的存活率一致。上述结...     

单增李斯特菌检测方法的最新研究进展

单增李斯特菌（LM）是人畜致病菌。近年来,因食品污染LM而导致的食物中毒事件日渐增多,因此LM的检测技术就显得越来越重要。LM检测技术主要有传统分离与鉴定方法、显色培养基快速鉴定技术、全自动微生物分析系统、分子生物学方法、免疫学方法。     

单增李斯特菌llsB基因克隆及序列分析

试验旨在对新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2单增李斯特菌llsB基因进行克隆及生物信息学分析,以期进一步完善单增李斯特菌溶血素S的功能研究。根据GenBank中单增李斯特菌F2365基因全长序列(登录号为:AE017262)设计其特异性引物,利用PCR方法对新疆分离株LM90SB2的llsB基因进行扩增,回收目的基因与pMD19-T载体连接,采用PCR、双酶切鉴定筛选阳性菌并进行测序,对所获序列进行同源性比对及遗传变异分析。结果显示,新疆分离株LM90SB2的llsB基因序列全长为876 bp,共编码291个氨基酸;LM90SB2分离株llsB基因核苷酸序列与10-0809、81-0592、81-0558、02-1792、NTSN、02-1289不同分离株同源性均为100%,与CIIMS-PH-1、NRRLB-57603株的同源性均为99.9%,与J1816、R2-502株的同源性为44.7%～45.0%。分子进化树显示,LM90SB2菌株llsB基因与血清型为4b的菌株亲缘关系较近,聚类为同一分支。蛋白质二级结构预测表明,LM90SB2 llsB蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,不形成跨膜结构。本试验成功克隆了LM90SB2株llsB基因,为深入探讨该基因功能提供全面的理论依据。     

单增李斯特菌在乳粉中的生存特性

单增李斯特菌是乳粉中常见的致病菌之一。为了解不同水活性（Aw）干乳粉、复水乳粉和热冲调乳粉中单增李斯特菌的生存特性，通过人工方法将单增李斯特菌添加于不同Aw的干奶粉、复水奶粉中，并在不同温度或pH条件下培养，通过菌落计数来分析单增李斯特菌的生存特性。结果显示：在4 ℃条件下，单增李斯特菌可在较低Aw（0.81、0.92）的干奶粉中长期保持生长活力，并且当Aw较高（0.96）时，会有增长趋势；在25 ℃条件下，干奶粉中的单增李斯特菌的生长活力很快减退，细菌处于亚损伤状态。复水奶粉中的单增李斯特菌能够生长的温度为-1.5~37 ℃，在pH4.4~8.0的复水奶粉中，高温条件下（30 ℃）比在低温条件下（4 ℃）生长快，但在低温条件下，对酸碱的耐受程度比在高温条件下大。单增李斯特菌在复水的高糖高脂奶粉中比原料奶粉中对热的耐受力强。结果表明，高温条件更易使干奶粉中单增李斯特菌生长活力减退，复水奶粉如果污染单增李斯特菌，在低温条件下贮存则能够控制单增李斯特菌的生长，高糖高脂成分可提高单增李斯特菌的热抵制能力。本研究为乳粉中单增李斯特菌的风险评估和关键控制措施的制定提供了依据。     

单增李斯特菌llsB基因克隆及序列分析

试验旨在对新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2单增李斯特菌llsB基因进行克隆及生物信息学分析，以期进一步完善单增李斯特菌溶血素S的功能研究。根据GenBank中单增李斯特菌F2365基因全长序列（登录号为：AE017262）设计其特异性引物，利用PCR方法对新疆分离株LM90SB2的llsB基因进行扩增，回收目的基因与pMD19-T载体连接，采用PCR、双酶切鉴定筛选阳性菌并进行测序，对所获序列进行同源性比对及遗传变异分析。结果显示，新疆分离株LM90SB2的llsB基因序列全长为876 bp，共编码291个氨基酸；LM90SB2分离株llsB基因核苷酸序列与10-0809、81-0592、81-0558、02-1792、NTSN、02-1289不同分离株同源性均为100%，与CⅡMS-PH-1、NRRLB-57603株的同源性均为99.9%，与J1816、R2-502株的同源性为44.7%~45.0%。分子进化树显示，LM90SB2菌株llsB基因与血清型为4b的菌株亲缘关系较近，聚类为同一分支。蛋白质二级结构预测表明，LM90SB2 llsB蛋白为亲水性蛋白，无信号肽，不形成跨膜结构。本试验成功克隆了LM90SB2株llsB基因，为深入探讨该基因功能提供全面的理论依据。     

单增李斯特菌内化素A分段表达及多克隆抗体的制备

为了研究单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)Inl A蛋白入侵细胞时各段相关功能,试验采用PCR技术扩增得到L.monocytogenes 08-5923株Inl A基因片段,测序后利用Gen Bank对Inl A氨基酸序列进行分段,分为2个基因片段,即Inl A1(1~1 488 bp)和Inl A2(1 315~2 403 bp),将其分别克隆至原核表达载体p GEX-6P-1中,并转化至宿主菌中诱导表达,表达的重组蛋白经Western-blot和间接ELISA法鉴定,用纯化的重组蛋白分别免疫家兔,并用ELISA法检测家兔多克隆抗体的特异性。结果表明:表达的2种重组蛋白分子质量分别约为79 ku和64 ku,以其制备的多克隆抗体均可与单增李斯特菌Inl A天然蛋白发生反应;2种重组蛋白均能有效诱导抗体反应,其中Inl A2(new flag)诱导产生的抗体效价较高,与单增李斯特菌Inl A天然蛋白结合能力较强。     

双元调控系统LisRK对单增李斯特菌抗酸应激与侵袭力作用的研究

【目的】 试验旨在阐明双元调控系统LisRK在单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)抵抗不利环境应激以及感染过程中的作用。【方法】 以参考菌株10403S为亲本株，利用穿梭质粒pKSV7通过同源重组方法构建lisRK基因缺失株，并基于表达质粒pIMK2构建了lisRK回补株；比较了亲本株10403S、缺失株ΔlisRK与回补株CΔlisRK在酸(pH 4.5)、渗透压(5% NaCl)和氧化(10 mmol/L H₂O₂)应激条件下的生长与存活能力及其对胃腺癌细胞MGC803和肠上皮细胞Caco-2的侵袭率，进一步比较了亲本株10403S、缺失株ΔlisRK与回补株CΔlisRK经腹腔注射感染的小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量。【结果】 应激试验结果显示，lisRK基因缺失显著降低单增李斯特菌在酸应激(pH 4.5)条件下的生长能力，但不影响该菌在5% NaCl和10 mmol/L H₂O₂中的生长能力；缺失株ΔlisRK在强酸应激条件下(pH 2.5)的存活率(0.57%)极显著低于亲本株(2.07%)与回补株(1.97%)(P < 0.01)。细胞侵袭试验显示，缺失株ΔlisRK对肠上皮细胞Caco-2和胃腺癌细胞MGC803的侵袭率分别为2.04%和0.13%，极显著或显著低于亲本株与回补株(P < 0.01；P < 0.05)。小鼠感染试验显示，在感染后48 h，缺失株ΔlisRK在小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量分别为7.42×10⁷和1.87×10⁷ CFU，均低于亲本株和回补株感染小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量，但并无显著性差异(P > 0.05)。【结论】 双元调控系统LisRK缺失减弱单增李斯特菌的抗酸应激能力和对宿主细胞的侵袭能力。     

产单核细胞李斯特菌溶血素基因的克隆及原核表达

利用PCR方法扩增产单核细胞李斯特菌（LM）的溶血素基因hlyA,获得一条大小约为1600bp的目的片段,将其与pMD18-T载体连接,经酶切、PCR鉴定,命名为pMD18-T—hlyA。测序结果显示所扩增的hlyA基因与GenBank中发表的hlyA的序列同源性为99％。利用含有BamHⅠ／XhoⅠ酶切位点引物B从pMD18-T—hlyA扩增不含信号肽序列的目的片段B,获得了大小约为1500bp的基因片段,该片段与pET32a表达载体经BamHⅠ／XhoⅠ处理后进行连接,转化BL21受菌体。通过酶切、PCR鉴定及序列测定后获得阳性pET32a-hlyA表达重组质粒,将重组菌用终浓度为0．1mmol／L的IPTG进行诱导表达,结果表明重组菌在诱导2h～3h表达量最高,融合蛋白约占菌体的40％,分子量大小约为80ku;利用LM的阳性血清进行Western blot分析,证实该融合蛋白可以被LM阳性血清所识别,为今后研制针对该蛋白的单克隆抗体和建立间接ELISA诊断方法提供了条件。     

4b型单增李斯特菌更易引发疾病

我国学者从食品中分离出了单核细胞增生性李斯特菌（LM）,并研究了其分子学特征和潜在毒性。结果显示,从食品中分离的88株LM中,42株血清型为1/2a或3a,23株血清型为1／2b或3b，15株血清型为1／2c或3c，6株血清型为4b、4d或4e，2株血清型为4a或4c。     

单增李斯特菌lmo2193基因克隆与原核表达

为了对单增李斯特菌新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2的lmo2193基因进行克隆及其原核表达,采用PCR方法扩增lmo2193基因,连接pMD19-T载体进行克隆,筛选阳性菌进行测序比对。将目的基因克隆至原核表达质粒p ET32a中,构建重组质粒pET32a-2193,并转化大肠杆菌感受态细胞,经诱导表达后,利用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白。结果显示:扩增得到的lmo2193基因序列长度为1 077 bp,与预期一致;该基因在大肠杆菌中大量表达,经SDS-PAGE检测和Western blot鉴定分析表明该产物为1个60 ku左右的融合重组蛋白。本研究成功克隆lmo2193基因,并获得大量表达,为进一步研究lmo2193基因功能奠定基础。