两种常见拟青霉的rRNA基因ITS区及5.8SrRNA基因的克隆测序

对粉拟青霉和细脚拟青霉rRNA基因内转录间区(ITS)和5.8SrRNA基因进行了克隆和测序,并将之与在CenBank中已登录的粉拟青霉和细脚拟青霉的同类序列比较,发现Park et al.登录的粉拟青霉(登录号AF237664)是一个不正确的序列,实际是细脚拟青霉的序列.序列的测定为今后粉拟青霉种下分类以及这两种真菌特异性引物或探针的设计创造了条件.     

细脚拟青霉液体栽培及氨基酸成分分析

[目的]对细脚拟青霉进行液体栽培研究,并对其氨基酸成分进行分析。[方法]利用马铃薯葡萄糖蛋白胨液体培养基进行液体栽培试验,测定孢梗束产量,并对液体栽培的细脚拟青霉孢梗束和摇瓶培养的细脚拟青霉菌丝体的氨基酸含量进行测定比较。[结果]液体栽培的干孢梗束产量为2.50 g/L;氨基酸分析表明,细脚拟青霉孢梗束的芳香族氨基酸是菌丝体中的2倍,但菌丝体中的人体必需氨基酸、儿童必需氨基酸和甜味氨基酸含量高于孢梗束。[结论]该研究为细脚拟青霉相关产品的开发提供了参考。     

比色法测定细脚拟青霉胞内甘露醇及羟自由基清除率

[目的]采用比色法测定细脚拟青霉菌丝体中的甘露醇含量及羟自由基清除率。[方法]以细脚拟青霉为供试菌株,用超声提取法提取细脚拟青霉菌丝体中的甘露醇,以D-甘露醇为标准品,绘制其标准曲线并计算其回归方程,通过测定甘露醇的吸光度计算细脚拟青霉菌丝体中的甘露醇含量及羟自由基清除率。同时,测定培养时间和提取时间对菌丝体中甘露醇含量和抗氧化活性的影响。[结果]甘露醇在412 nm处有最大吸收峰,质量浓度在10~80μg/m l范围内其具有良好的线性关系,其回归方程为:C=103.09A-1.381 4,r=0.998 8;平均回收率为101.47%,RSD为2.6%(n=5)。菌丝体中的甘露醇含量及羟自由基清除率的变化趋势基本不随培养时间改变,培养第6天时均达到最高值,分别为73.56μg/m l和47.95%。[结论]为进一步研究细脚拟青霉的抗氧化功能提供理论依据。     

滇龙胆香叶醇合酶基因的克隆与表达分析

对滇龙胆香叶醇合酶基因Gr GES进行克隆和表达分析,为研究其在香叶醇和龙胆苦苷生物合成中的作用奠定基础。根据滇龙胆转录组Gr GES序列,采用RT-PCR技术从滇龙胆叶片克隆该基因,获得Gr GES序列(Gen Bank登录号为KJ917168)。序列分析结果表明,Gr GES基因长1 767 bp,编码588氨基酸;Gr GES蛋白相对分子质量为67.84 ku,理论p I为5.56。该蛋白定位于叶绿体,包含叶绿体转运肽,为亲水不稳定蛋白,主要由α-螺旋(62.41%)和环(39.57%)构成。该蛋白具有其他GES蛋白的活性位点、萜类合酶N端结构域(IPR001906,81~273)和萜类合酶结构域(IPR005630,263~588)。Gr GES蛋白与长春花Cr GES蛋白亲缘关系最近。原核表达结果表明,Gr GES基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为78.22 ku,与预期的大小一致。组织特异性表达分析结果表明,Gr GES基因主要在叶中表达。     

岷江百合单萜合酶基因克隆与表达分析

以岷江百合花被片为材料,通过RT-PCR方法,克隆单萜合酶基因,命名为LreTPS.该基因包含1770 bp的开放阅读框,编码590个氨基酸,编码蛋白质分子质量为68.18 ku,等电点为5.77.LreTPS编码的蛋白含有单萜合酶蛋白特有的DDXXD、RRX8W保守基序,氨基酸序列N端含有一段转运肽,与其他植物的单萜合酶基因蛋白同源性为40%-50%.系统进化树分析表明,LreTPS基因属于TPS-b亚家族.荧光定量表达结果表明,LreTPS在岷江百合花被片中表达量最高,其次在叶片中,在雄蕊与柱头中微量表达.     

蜜蜂(Apis mellifera)腺苷酸转移载体基因cDNA的电子克隆

 以果蝇腺苷酸转移载体基因cDNA序列为信息探针,对蜜蜂EST数据库进行同源检索筛选,克隆了蜜蜂腺苷酸转移载体基因(Am　ant)的cDNA序列(GenBank登记号为AY332626),该基因全长1 251bp。经RT-PCR克隆、序列分析验证,结果表明与电子克隆序列完全一致;该基因具有完整的开放阅读框架(ORF),编码蛋白为300个氨基酸,通过对人、果蝇、家蚕及烟草天蛾的腺苷酸转移载体蛋白序列比较,发现该基因具有高度的保守性;说明根据物种间同源基因序列,进行跨物种EST数据库的同源检索筛选、拼接,是基因克     

怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因克隆和表达分析

【目的】对怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因进行克隆和表达分析,为进一步揭示怀玉山三叶青黄酮醇合酶的生物学功能奠定基础。【方法】怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的核心片段通过其转录组数据库进行筛选,怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因利用逆转录PCR进行克隆,序列分析采用生物信息学进行分析,器官表达采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进行比较。【结果】怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因cDNA总长度为987 bp,G+C含量为47.92%。怀玉山三叶青黄酮醇合酶由329个氨基酸组成,分子量37578.03 Da,理论等电点5.39,为亲水性蛋白;其二级结构中α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲的比例分别占27.66%、21.88%和50.46%。怀玉山三叶青黄酮醇合酶主要存在内质网中,在进化上与山甜菜（Nekemias grossedentata）、河岸葡萄（Vitis riparia）和葡萄（Vitis vinifera）的亲缘关系较近,尤其是与山甜菜（N.grossedentata）黄酮醇合酶在进化上具有最高的亲缘关系。qRT-PCR分析结果表明,怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的表达在2个栽培种中存在器官特异性表达,怀玉2号在根中的相对表达量最高,怀玉1号在茎中的相对表达量最高。【结论】怀玉山三叶青黄酮醇合酶具有典型黄酮醇合酶的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度高,在进化上高度保守,且怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的表达存在组织器官差异性。     

蜜蜂(Apis mellfiera)腺苷酸转移载体基因cDNA的电子克隆

以果蝇腺苷酸转移载体基因cDNA序列为信息探针,对蜜蜂EST数据库进行同源检索筛选,克隆了蜜蜂腺苷酸转移载体基因(Am ant)的cDNA序列(GenBank登记号为AY332626),该基因全长1 251bp.经RT-PCR克隆、序列分析验证,结果表明与电子克隆序列完全一致;该基因具有完整的开放阅读框架(ORF),编码蛋白为300个氨基酸,通过对人、果蝇、家蚕及烟草天蛾的腺苷酸转移载体蛋白序列比较,发现该基因具有高度的保守性;说明根据物种间同源基因序列,进行跨物种EST数据库的同源检索筛选、拼接,是基因克隆的一条有效途径.     

鸭腺苷琥珀酸裂解酶基因序列特征及表达与肌肉肌苷酸含量的相关性分析

【目的】克隆鸭腺苷琥珀酸裂解酶（adenylosuccinate lyase,ADSL）基因的完整编码区（coding sequences,CDS）,对其进行核酸和蛋白序列分析,研究该基因在各品种肌肉组织mRNA表达水平;对该基因mRNA表达水平与肌肉组织肌苷酸（inosine monophosphate acid,IMP）含量进行相关性分析。为揭示中国优良地方鸭种的风味基因结构、研究其生物学功能以及与重要风味物质的关系奠定理论基础。【方法】通过PCR扩增和克隆测序获得鸭ADSL基因部分cDNA序列,运用生物信息学方法分析鸭ADSL基因编码区序列、蛋白结构和进化关系,利用real-time-PCR技术检测鸭肌肉组织中ADSL基因mRNA表达水平,利用高效液相色谱法测定肌肉组织IMP含量。【结果】①鸭ADSL基因CDS全长均为1 380 bp,编码459个氨基酸,与鸡的同源性为94.77%。②ADSL蛋白为偏碱性,有较为强烈的信号肽和细胞内跨膜结构,蛋白二级结构主要由α-螺旋构成。③鸭和鸡首先聚为一类,后与人、鼠等哺乳动物聚为一类,而与两栖、鱼类相聚较远。④ADSL基因表达量品种间差异极显著（P＜0.01）;各品种内雌性表达量极显著高于雄性（P＜0.01）;同一性别内胸肌表达量极显著高于腿肌（P＜0.01）（樱桃谷鸭除外,为P＞0.05）。⑤IMP含量在品种间差异极显著（P＜0.01）;各品种内雌性含量显著高于雄性（P＜0.05）;同一性别内胸肌含量显著高于腿肌（P＜0.05）。【结论】鸭ADSL基因CDS序列与鸡的同源性极高,在肌肉组织中该基因的表达量及对应IMP含量表现为不同品种、同一品种不同性别、同一性别不同部位间极显著或显著差异,两者并显现出显著正相关。     

纤维亚麻LuNAC10基因克隆及表达分析

NAC作为植物特有转录因子,调控植物细胞次生壁合成。研究从高纤亚麻“Diana”中克隆得到Lu NAC10(Lus10013967)基因。通过序列分析发现,基因Lu NAC10开放阅读框总长度为978 bp,共编码325个氨基酸,蛋白分子质量为35.53 ku,其中蛋白疏水系数-0.787,为亲水性蛋白,不稳定系数38.10,属不稳定蛋白,无跨膜结构,具有单个典型NAM结构域,通过PSORT分析推测Lu NAC10蛋白定位于细胞核中。通过同源比对和聚类分析发现,亚麻Lu NAC10与拟南芥SND3蛋白（AT1G28470）进化关系最近。q RT-PCR结果表明,Lu NAC10基因表达量高峰出现在亚麻茎下部1/3处,亚麻根部及茎中部次之,叶片中表达量最低;从苗期到工艺成熟期,该基因表达量总体呈先升后降趋势,并在亚麻快速生长期表达量达到最高。该基因与参与次生壁合成的纤维素合酶基因Lu Ces A4、Lu Ces A8A表达量呈极显著正相关（P<0.01）,相关系数分别为0.989和0.987。同时,Lu NAC10基因表达量与纤维素含量呈极显著正相关（P<0.01）,相关系数...     

青蒿高产株系001法呢基焦磷酸合酶基因的克隆、原核表达及酶活性测定

法呢基焦磷酸合酶(FPS)是治疗疟疾的特效药物——青蒿素生物合成途径的关键酶。运用RT-PCR方法从青蒿高产株系001中克隆法呢基焦磷酸合酶基因;构建His标签融合蛋白FPS表达载体,进行原核诱导表达、蛋白纯化及酶活性测定的研究。结果表明:克隆的FPS基因和文献已报道的2个青蒿FPS基因编码的氨基酸序列的同源性分别为98.83%和99.42%;原核诱导表达的His标签融合蛋白FPS的表达量高、可溶性好,具有FPS酶活性。     

亚麻纤维素合酶LuCesA8基因克隆与表达分析

以亚麻快速生长期茎部组织总RNA为模板,通过反转录PCR克隆纤维素合酶基因Lu Ce s A8(基因ID:Lus10029245)全长开放读码框序列。序列分析结果表明,开放读码框全长2 967 bp,共编码988个氨基酸。通过多氨基酸序列比对发现,该蛋白与麻风树Ces A8蛋白亲缘关系最近,相似度达87%,与胡杨、可可树、雷蒙德氏棉及芝麻Ces A8蛋白氨基酸序列相似性分别为86%、85%、85%、81%。荧光定量PCR结果表明,该基因在亚麻不同发育阶段表达水平存在显著差异,快速生长期表达量最高,花期和绿熟期次之,苗期最低。研究为揭示Lu Ce s A8基因在次生细胞壁纤维素合成中的作用奠定基础。     

桑青枯雷尔氏菌MR111的腺苷酸激酶adk基因的克隆和序列分析

腺苷酸激酶是广泛存在的一种重要的核苷酸激酶.进行PCR扩增和克隆测序获得桑青枯雷尔氏菌MR111的腺苷酸激酶adk基因长502 bp的序列,NCBI在线BLAST分析其与大肠杆菌、流感嗜血杆菌同源基因的相似性在80％以上,序列编码蛋白有腺苷酸激酶保守的AMP结合结构域和LID结构域,为长型腺苷酸激酶.聚类分析结果表明,该基因与其他细菌的同源基因聚合在同一分支.     

华山松大小蠹2个甲羟戊酸路径基因的克隆与表达

香叶基二磷酸合酶/法尼基焦磷酸（G/FPPS）和异戊二烯焦磷酸异构酶（IDI）是单萜和倍半萜生物合成途径分支点的关键酶。通过克隆华山松大小蠹DaG/FPPS和DaIDI基因的全长序列,预测基因和编码蛋白的性质、结构和功能,并对序列特征和不同发育时期（幼虫、蛹、初羽化期成虫和扩散期成虫）以及不同组织（头、前中肠、后中肠、后肠和剩余躯体）DaG/FPPS和DaIDI表达的研究,旨在揭示DaG/FPPS和DaIDI在华山松大小蠹信息化学物质合成中的分子调控机制。采用RT-PCR和RACE克隆华山松大小蠹DaG/FPPS和DaIDI基因,DNAStar、Blast、ExpasyProtscale、SignalP 4.1、PSORT和TargetP等多种生物信息学方法对基因全长cDNA序列、基本理化性质、系统进化关系、信号肽和蛋白亚细胞定位等进行分析。用Real-time PCR检测DaG/FPPS和DaIDI在华山松大小蠹不同发育时期和不同组织中的表达。结果表明,克隆获得华山松大小蠹香叶基二磷酸合酶/法尼基焦磷酸DaG/FPPS和异戊二烯焦磷酸异构酶DaIDI全长cDNA序列,分别命名为DaG/FPPS和DaIDI,DaG/FPPS编码的氨基酸序列与山松大小蠹DpF/GPPS相似度最高达95%,氨基酸序列含有一个RALS 四肽基序、7 个异戊烯基转移酶保守区（Ⅰ-Ⅶ）和2个典型的DD**D的天冬氨酸富含区;DaIDI编码的氨基酸序列与山松大小蠹IDI相似度最高,达到92%。Expasy Protscale结果表明DaG/FPPS蛋白疏水性氨基酸明显多于亲水性氨基酸,推测其为疏水性蛋白,而DaIDI蛋白亲水性氨基酸数量大于疏水性氨基酸,故推测DaIDI为亲水性蛋白,有较好的水溶性。信号肽预测结果表明,DaG/FPPS和DaIDI均不含信号肽,TargetP结果表明,DaG/FPPS和DaIDI蛋白含线粒体靶向肽,结合PSORT结果推测DaG/FPPS和DaIDI均定位于线粒体。华山松大小蠹DaG/FPPS和DaIDI在不同发育时期和不同组织中均有表达,其中完全羽化期与扩散期成虫保持一致,该阶段表达量最高,不同组织中前中肠表达量最高。     

鹅源草酸青霉CBHⅠ基因克隆及真核表达载体构建

【目的】鹅源草酸青霉F67(Penicillium oxalicum Currie Thom)纤维素酶二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBHⅠ)基因克隆并构建真核表达载体,为该菌株分子特性的进一步研究及构建高效纤维素分解菌奠定基础。【方法】首先通过兼并PCR法扩增CBHⅠ基因片段,然后利用改良热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术克隆CBHⅠ基因5′端和3′端侧翼序列,最后采用RT-PCR法扩增鹅源草酸青霉F67CBHⅠ基因序列全长,并对该基因进行生物信息学分析,构建pPIC9K真核表达载体。【结果】分别扩增到鹅源草酸青霉F67纤维素酶CBHⅠ基因片段A(EU574736)、5′端序列B1(EU603295)、3′端序列B2(EU652768)及全长基因C(EU727171),并成功构建真核表达载体pPIC9K-CBHⅠ;生物信息学分析表明,该基因蛋白序列与微紫青霉氨基酸序列同源性最高,达76%,前26个氨基酸为信号肽序列,疏水性可达2.63,由催化功能域、衔接区和真菌性纤维素结合域构成,其三级结构主要为β-sheet。【结论】鹅源草酸青霉纤维素酶CBHⅠ基因全长序列的克隆进一步丰富了丝状真菌的生物信息学资源;其真核表达载体的构建为将该菌株进一步在真核宿主中表达,从而获得高效工程菌株奠定了基础。     

鸡腺苷琥珀酸裂解酶(Adsl)基因多态性及其与肌苷酸含量相关研究*

 腺苷琥珀酸裂解酶是嘌呤核苷酸合成过程中的关键酶之一,催化嘌呤核苷酸合成过程中的两个重要反应:(1)由SACIAR生成AICAR的反应;(2)由腺苷酸琥珀酸生成腺苷酸单磷酸的反应。本研究对泰和乌骨鸡、隐性白羽肉鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因的cDNA进行了克隆,并对序列进行了分析,共发现有6处碱基突变:249 G→A(TH),717 C→G(TH),985 A→G(TH)仅在泰和乌骨鸡中出现;992 T→C(RW),1400 C→T(RW)仅在隐性白羽肉鸡中出现;而在泰和乌骨鸡和隐性白羽肉鸡中均检测到突变1179 A→C(TH,RW)。其中985 A→G(TH),1400 C→T(RW)处突变导致两处氨基酸突变:Thr→Ala(305),Ala→Val(443),其它4处碱基突变均为同义突变。     

5种虫生拟青霉高产VE菌株的筛选及优化

[目的]为从真菌中开发利用天然VE提供一定的科学依据和参考。[方法]用紫外分光光度法测定5种虫生拟青霉中天然VE的含量,采用正交试验对细脚拟青霉进行高产VE培养基的优化。[结果]细脚拟青霉中的天然VE含量最高;所得优化的培养基碳源为甘露糖,氮源为尿素,微量元素为铁,pH值自然。[结论]该研究中的真菌资源具有开发脂溶性物质的极大潜力。     

EuPOD基因克隆与焦枯病菌胁迫表达分析

植物过氧化物酶是植物体内活性氧清除过程中的关键酶之一,在植物的抗逆性中发挥着重要作用。以对焦枯病菌高抗品系尾细桉为材料,克隆得到一个 POD 基因序列,并命名为 EuPOD,通过实时荧光定量聚合酶链式反应( qRT￣PCR)检验该基因在尾细桉叶片中的表达。结果表明该基因cDNA长999 bp,其编码蛋白由332个氨基酸组成;基于氨基酸序列的系统进化树分析表明, EuPOD在进化上与蓖麻、可可、苹果的同源基因亲缘关系较近,相似性达到了75％,与拟南芥的相似性达到65％,与水稻的相似性较低,只有48％。 EuPOD在桉树焦枯病菌侵染后不同时间所受诱导表达量不同,在12 h的表达量达到高峰。     

龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

【目的】克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因(mitochondrial F1-ATPase beta subunit gene),并分析该基因在龙眼体胚发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,通过T/A克隆测序,获得龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因全长序列;随后通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达规律。【结果】成功克隆龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因完整cDNA序列(GenBank登录号:FJ222749),该序列全长2099bp,由1677bp核苷酸组成的ORF,编码558个氨基酸。该基因与其它植物的线粒体ATP合酶β亚基基因在核苷酸序列和推导的氨基酸序列方面相似性较高。对来源于动、植物的28条线粒体ATP合酶β亚基基因编码区序列所构建的进化树分析表明,由线粒体ATP合酶β亚基基因编码区序列所建立的系统关系树与真实的动、植物进化基本一致,龙眼处在双子叶植物中,由于该基因在龙眼同科属的植物中为首次克隆,所以有自己单独的分支。qRT-PCR结果分析表明,随着龙眼体胚的发育,线粒体ATP合酶β亚基基因转录水平逐渐升高,到球形胚阶段达到最高,而后又急剧下降,到鱼雷形胚阶段降到最低,子叶形胚阶段略有升高。【结论】龙眼线粒体ATP合酶β亚基基因与其它植物相应序列具有较高同源性,在龙眼体胚发育过程中,以球形胚阶段的表达最高。     

灵芝倍半萜合酶基因的克隆及表达

倍半萜合酶是倍半萜化合物生物合成途径中的关键酶。本试验从灵芝基因组数据库中筛选出1个编码灵芝萜类合酶的基因,并对其进行克隆及表达。序列分析表明,该基因开放阅读框的长度为1041bp,编码346个氨基酸;成功构建了1个灵芝萜类合酶基因的原核表达载体,并完成了该基因编码的倍半萜合酶在大肠杆菌中的可溶性表达;顶空固相微萃取—气相色谱质谱法分析结果表明重组的灵芝萜类合酶具有催化活性。为后续研究萜类化合物的多样性奠定基础。