波状芽管蠕孢属疯草内生真菌研究进展

疯草是世界范围分布的豆科棘豆属和黄芪属有毒植物的统称,其主要毒性成分为吲哚里西啶类生物碱——苦马豆素。放牧家畜采食疯草会发生疯草中毒病,导致瘫痪、不孕、流产、生产性能下降、死亡等,造成的经济损失巨大。波状芽管蠕孢菌是疯草中普遍存在的一类内生真菌,该菌与疯草中苦马豆素的合成和疯草的毒性紧密相关。抑制或阻断波状芽管蠕孢菌在疯草中的传播和苦马豆素合成,将有望降低或消除疯草的毒性。本文将对波状芽管蠕孢属疯草内生真菌的种属分类、与疯草毒性的关系、传播机制、SW的合成机理等方面的研究进行综述,为疯草内生真菌相关研究的开展和从控制疯草内生真菌角度防控动物疯草中毒病提供思路。     

产苦马豆素疯草内生真菌及苦马豆素研究进展

疯草(Locoweed)是黄芪属、棘豆属和苦马豆属中含苦马豆素(swainsonine, SW)有毒植物的统称,具有抗旱耐寒,分布广泛的特性。牲畜长期采食疯草会引起蓄积性中毒,严重时导致死亡,严重危害了我国草原畜牧业的可持续发展。疯草内生真菌是疯草具有毒性的根本原因,其毒性代谢产物即苦马豆素。论文对疯草在中国的种类与分布、疯草与内生真菌互作关系、疯草内生真菌种属及检测方法、疯草内生真菌传播方式与内生真菌育种;苦马豆素的来源、毒理机制及生物合成通路最新研究进展做一综述,以期为疯草植株及其内生真菌的改造利用方面提供参考。     

棘豆属植物中产苦马豆素内生真菌的研究进展

苦马豆素(SW)是棘豆属(Oxytropis)植物引起家畜中毒的主要原因,而苦马豆素的产生与棘豆属植物的内生真菌有关。目前,棘豆属植物中能够产生苦马豆素的内生真菌不断被发现,所以文章对产苦马豆素内生真菌的寄主植物、形态、培养条件及其与苦马豆素的关系、对寄主植物的影响等进行了综述,为棘豆属植物的有效利用及家畜中毒的防治提供理论依据。     

小花棘豆产苦马豆素内生真菌的筛选与鉴定

通过对小花棘豆内生真菌的分离纯化,筛选产苦马豆素内生真菌,探讨小花棘豆内生真菌与其毒性成分苦马豆素的相互关系。本研究对采自内蒙古西部草地的6份小花棘豆样品进行内生真菌分离纯化,采用薄层色谱和气相色谱技术对内生真菌发酵液进行苦马豆素定性、定量检测,筛选产苦马豆素内生真菌;结合形态学和分子生物学方法进行内生真菌种属鉴定。从小花棘豆样品中分离得到6株内生真菌。经筛选,其中有2株产苦马豆素,编号为XJ-J-I和XJ-H-1,其发酵液中苦马豆素产量分别为4.209 2mg.L-1和16.733 8mg.L-1。鉴定结果表明,这2株内生真菌虽然形态学存在差异,但基因型相同,同属镰刀属内生真菌—层出镰刀菌(Fusarium prolifera-tum)。小花棘豆中存在产苦马豆素内生真菌。     

苦马豆素研究进展

1　苦马豆素研究简史苦马豆素 (swainsonine)因最初分离于灰苦马豆 (Swain-sona canesces)而得名〔1〕。其发现历经一个世纪。自从 Marsh(190 5～ 190 7)〔2〕证实疯草病与采食某些棘豆属和黄芪属植物有关以后 ,许多学者进行了毒素的分离研究。 Cauch(192 9)〔3〕从兰伯氏棘豆中分离出一种疯草毒素 ,可以引起猫的疯草病 ,他描述这种毒素是一种稳定的带有多羟基的含氮化合物 ,易溶于水 ,不溶于氯仿、乙醚和烃类溶剂 ,但由于当时条件所限未能进行结构鉴定。Frap(1936 )〔4〕从密柔毛黄芪中分离出一种毒性成分 ,呈碱性 ,吸水性强 ,取名为洛克…     

内蒙古不同小花棘豆种群苦马豆素及其内生真菌关系的分析

小花棘豆是广泛分布于内蒙古草原和荒漠区的一种有毒植物,其主要毒性成分为有毒生物碱——苦马豆素（swainsonine,SW）,牲畜采食后可引起中毒,甚至死亡,给当地畜牧业造成重大经济损失。本研究旨在探究内蒙古不同小花棘豆种群植株苦马豆素及其与内生真菌关系。采集内蒙古8个样地120株小花棘豆,利用萃取、离心、离子交换层析法提取和纯化植物单株和菌丝体的SW,用气相色谱-质谱联用法（GC-MS）检测SW水平,取茎和叶外植体分离培养内生真菌,提取植物和真菌的总DNA,扩增真菌特异序列,利用内生真菌微生物学特征和DNA序列比对进行鉴定。结果显示：8个种群共111株小花棘豆检测出SW,最高水平为369.05 μg·g^-1,平均水平32.78 μg·g^-1,从38株小花棘豆分离培养出内生真菌,纯培养下菌丝体呈松散白色绒毛状,菌落圆形、隆起、边缘整齐、辐射状生长,颜色逐渐呈现灰色、深灰色或褐色至深褐色,内生真菌均测出SW,其水平为0.83~2 573.24 μg·g^-1,经微生物学研究及5.8S rDNA/ITS序列比对分析,在属水平上鉴定该内生真菌为Alternaria。有Alternaria内生真菌的小花棘豆植株含SW,无该内生真菌的植株不含SW,培养的Alternaria内生真菌合成了SW。     

变异黄芪中产苦马豆素内生真菌的分离与鉴定

从变异黄芪种子中分离并纯化内生真菌,应用ɑ-甘露糖苷酶抑制法检测能产生苦马豆素的内生真菌。提取真菌DNA,扩增和测定真菌ITS和GPD序列,进行序列同源性比较,构建系统发育树。结果:从变异黄芪种子中共分离到3株产苦马豆素内生真菌,其形态特征均与波状芽管蠕孢属相近;ITS和GPD序列与棘豆波状芽管蠕孢一致性高达99%;遗传分析显示,3株菌与棘豆波状芽管蠕孢真菌遗传距离最近。根据形态特点和遗传进化分析结果,将该3株菌鉴定为棘豆波状芽管蠕孢。     

苦马豆素生物合成研究进展

苦马豆素(SW)是苦马豆属、棘豆属、黄芪属、番薯属和黄花稔属等某些有毒植物的主要毒性成分,动物采食该类植物后,会发生以神经系统功能紊乱为特征的中毒病。研究表明,豆类丝核菌、金龟子绿僵菌和疯草内生真菌均可以产生苦马豆素。植物和真菌中苦马豆素的生物合成研究可为人类从根本上解决含有SW有毒植物引起的动物中毒问题和促进SW的医学研究及应用提供重要的科学依据。论文根据近年来的最新研究,重点围绕植物和真菌中苦马豆素的生物合成及其相关研究进行综述,以期为该类研究的开展提供思路。     

产苦马豆素疯草内生真菌U.oxytropis的发酵培养及苦马豆素检测方法的建立

通过对生长初期疯草内生真菌U.oxytropis菌丝复苏后连续培养32d,每隔4d取样1次,并设3个平行培养组,测定其不同培养时期菌丝干重变化,利用超声减压旋蒸法提取菌丝和发酵液中苦马豆素(SW),并分别利用薄层层析法、气相色谱法和α-甘露糖苷酶抑制法对菌丝、发酵液中SW含量进行测定。结果显示,经测定疯草内生真菌U.oxytropis菌丝干重质量,确定疯草内生真菌U.oxytropis生长周期为24d;薄层层析法、气相色谱法和α-甘露糖苷酶抑制法都可快速对菌丝和发酵液中提取的SW进行定性、定量检测,并比较3种检测方法,发现气相色谱法检测限低、灵敏度更高。本试验完成了疯草内生真菌U.oxytropis生长周期的测定,并建立了菌丝、发酵液中SW的有效、快速提取及检测方法,为下一步产苦马豆素疯草内生真菌U.oxytropis生物合成机理的研究奠定基础。     

产苦马豆素真菌的筛选与鉴定

为探明青海及内蒙古多种疯草类植物及其根际土壤中是否存在产生苦马豆素的真菌,并对其种属进行鉴定,同时测定其苦马豆素产率。本试验拟对采自内蒙古和青海的疯草样品中的内生真菌及根际土壤真菌进行分离;应用薄层色谱和气相色谱法分别检测菌丝及发酵液中苦马豆素含量,筛选可产生苦马豆素的真菌;运用形态学和分子生物学方法对其属种进行鉴定。从青海采集的疯草样品中分离并筛选出2株可产苦马豆素真菌,一株为土壤真菌,一株为内生真菌,分别命名为FS-5和EFG-7;菌丝中苦马豆素含量分别为0.773和0.11 mg.g-1,结合形态学和分子生物学试验结果,确定这2株真菌分别为裂褶菌属真菌和镰孢菌(霉)属三线镰刀菌。结果显示,我国青海疯草及根际土壤中存在可产生苦马豆素的真菌。     

苦马豆素抗肿瘤作用研究进展

苦马豆素(SW)是一种吲哚里西啶生物碱,最早是从灰苦马豆中分离得到,是疯草类植物的主要毒性成分.它能抑制肿瘤细胞表面糖蛋白的表达,从而抑制肿瘤细胞的生长与转移.此外,SW能促进脾细胞增殖,增强巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤活性,还能促进机体淋巴细胞活性升高,刺激机体骨髓细胞增殖,增强机体杀灭肿瘤细胞的能力.由于SW具有很好的抗肿瘤活性和免疫增强作用,已引起国内外学者的广泛关注,并作为抗肿瘤药物筛选的后备药物.目前,国外SW抗肿瘤药物的研发已进入Ⅲ期临床试验阶段,而国内才刚起步.论文主要介绍了SW抗肿瘤作用及其临床治疗效果,并对SW下一步研究重点及应用前景进行了展望.     

苦马豆素抗肿瘤作用研究进展

苦马豆素(SW)是引起动物疯草中毒的主要毒性成分,研究表明它能直接作用于肿瘤细胞,表现出明显的抗肿瘤作用;也能刺激淋巴细胞增殖,增强由抗原刺激的T淋巴细胞作用,激活自然抗肿瘤免疫系统;还能够迅速刺激机体内巨噬细胞,促使机体对肿瘤的免疫监视作用,促进骨髓增殖,从而增强机体免疫能力。作为人工抗原,苦马豆素还能诱导机体产生特异性抗体,避免动物因采食疯草而中毒。文章就苦马豆素的抗肿瘤作用进行综述并对其药用前景进行展望。     

不同因素对疯草内生真菌合成苦马豆素的影响

研究不同因素对疯草内生真菌——Undifilum oxytropis合成苦马豆素的影响,筛选出显著影响U.oxytropis苦马豆素合成的因素。将U.oxytropis分别接种到不同pH或不同浓度聚乙二醇(PEG)、L-哌可酸、L-赖氨酸、α-酮戊二酸的培养基中培养,测定菌丝及其发酵液中苦马豆素,分析各条件下真菌苦马豆素产率的变化。结果表明:当pH在4.5~6.5时,随pH增加,真菌SW产率显著增加(P0.05);当PEG质量浓度在0~32g·L-1时,随PEG增加,真菌苦马豆素产率显著降低(P0.01);当在培养基中添加相同量(10-3 mol·L-1)的L-哌可酸、L-赖氨酸、ɑ-酮戊二酸时,L-哌可酸添加组的苦马豆素产率显著降低(P0.05),L-赖氨酸添加组苦马豆素产率显著增加(P0.05);当L-哌可酸的初始浓度为10-3和10-2 mol·L-1时,真菌的苦马豆素产率显著下降(P0.05),当其浓度为10-4 mol·L-1时,苦马豆素产率显著增加(P0.01);当L-赖氨酸的初始浓度为10-1、10-2或10-4mol·L-1时,真菌苦马豆素产率显著降低(P0.05)。当ɑ-酮戊二酸的初始浓度分别为10-1、10-2、10-3 mol·L-1时,真菌的苦马豆素产率显著降低(P0.05)。由试验可知,低pH或添加PEG可抑制U.oxytropis中苦马豆素的合成,L-哌可酸、L-赖氨酸、α-酮戊二酸均对U.oxytropis的苦马豆素合成产生显著影响,但对苦马豆素合成的影响与各物质在培养基中的浓度密切相关。     

野生型斜茎黄芪内生真菌分离鉴定及苦马豆素分析

为探明青海野生型斜茎黄芪(Astragalus adsurgens)是否存在产苦马豆素内生真菌,本试验采用植物组织表面消毒法对斜茎黄芪内生真菌进行分离培养,运用形态学观察和内部转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)序列分析鉴定分离获得的内生真菌种属,并构建系统发育树,应用薄层层析法对斜茎黄芪和优势菌发酵液中的苦马豆素进行检测。结果显示,从斜茎黄芪中共分离出26株菌株,分属于5纲、5目、7科、7属,4株未定属。其中由根中分离的链格孢菌属(Alternaria sp.)是斜茎黄芪的优势菌属,分离率为23.08%。从薄层层析结果可以看出,斜茎黄芪和优势菌发酵液中均未检测到苦马豆素。上述结果表明,野生型斜茎黄芪不属于疯草类有毒植物,这为该植物的后续资源化利用提供重要理论依据。     

宁夏黄花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离及鉴定

对宁夏黄花棘豆中产苦马豆素内生真菌进行分离和鉴定,为进一步研究疯草内生真菌合成苦马豆素的分子调控机理提供菌种和奠定基础。分离并纯化黄花棘豆植物组织中的真菌,采用气相色谱质谱联用法对各菌株菌丝中的苦马豆素进行分析,筛选能产生苦马豆素的内生真菌;紫外线照射和黑暗交替培养诱导内生真菌产孢;提取真菌DNA,扩增和测定真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GPD）、内部转录间隔区（internal transcribed space,ITS）和线粒体核糖体小亚基（mitochondrial small subunit,mt SSU）基因序列,进行同源性比对和遗传进化分析,对其进行种属分类和命名。本研究从宁夏黄花棘豆中共分离到5株真菌,其中菌株NX-FEL001菌丝中含有苦马豆素,经诱导培养,该菌株能产生分生孢子及分生孢子梗等结构;序列同源性和系统发育分析结果表明,该菌株与Undifilum真菌的亲缘关系最近,根据形态结构和分子进化分析结果将菌株NX-FEL001鉴定为Undifilum oxytropis。     

直立黄芪中产苦马豆素真菌的分离与鉴定

为了确定直立黄芪中是否存在能产生苦马豆素的真菌及该类真菌与链格孢属波状芽管孢组疯草内生真菌的遗传进化关系,对直立黄芪植物组织中的真菌进行了分离,应用ɑ-甘露糖苷酶抑制法和超高效液相色谱-串联质谱法对分离菌株菌丝中的苦马豆素进行分析,筛选能够产生苦马豆素的菌株。PCR法扩增产苦马豆素真菌的内部转录间隔区(ITS)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)和β-酮脂酰合酶(β-ketoacyl synthase,KS)基因,测定其序列,进行序列一致性比对。基于ITS和GPD序列构建系统发育树,根据遗传进化分析结果和形态特征,对直立黄芪中的产苦马豆素真菌进行种属分类和命名。结果显示:从直立黄芪中共分离到43株真菌,其中有13株菌丝中含有苦马豆素,序列一致性和系统发育分析结果表明,该类真菌与已报道的直立黄芪病原真菌甘肃链格孢(Alternaria gansuense)和产苦马豆素疯草内生真菌(Alternaria Section Undifilum sp.)的亲缘关系最近。直立黄芪中存在能产生苦马豆素的真菌,根据形态特点和遗传进化分析结果,本研究将从直立黄芪中分离的产苦马豆素真菌划分到链格孢属波状芽管孢组中,并命名为甘肃波状芽管孢(Alternaria Section Undifilum gansuense)。     

产苦马豆素疯草内生真菌Undifilum oxytropis原生质体的制备和再生

以产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis NX-FEL001为供试菌株,研究了培养方式、菌龄、酶解时间和酶解温度等,对U.oxytropis原生质体制备和再生的影响。结果表明,U.oxytropis菌丝在质量分数为10g/L纤维素酶+10g/L蜗牛酶+1g/L溶壁酶组成的复合酶溶液,35℃恒温,80r/min振荡孵育3h左右,原生质体释放量最高;原生质体在YCM培养基上,22℃培养9d可以再生形成菌落,培养15d其再生率可达8.5%;原生质体在YCM培养基上再生后其菌落颜色与野生型U.oxytropis不一致,呈现白色;菌丝形态与野生型U.oxytropis相一致,经检测再生后菌丝仍然能够产生苦马豆素。U.oxytropis原生质体的制备,将为进行疯草内生真菌的遗传转化和基因操作研究提供重要工具,为进一步开展疯草内生真菌合成苦马豆素的分子调控机制奠定了基础。     

疯草内生真菌苦马豆素合成相关基因及其研究方法的进展

<正>豆科棘豆属(Oxytropis)和黄芪属(Astragalus)有毒植物统称为疯草。疯草的营养价值丰富,是潜在的优良牧草。但家畜长期或过量采食后,可发生以神经机能紊乱为特征的慢性中毒病,称之为疯草中毒病[1]。中毒家畜表现为共济失调、瘫痪、流产、不孕、出生缺陷和死亡等。疯草导致动物中毒的主要因素是疯草中的吲哚里西啶类生物碱—苦马豆素,它能特异性地抑制参与糖蛋白分解代谢的溶酶体α-甘露糖苷酶、高尔基α-甘露糖苷酶Ⅱ,破坏细胞内膜系统[2-     

产苦马豆素疯草内生真菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据疯草内生真菌苦马豆素合成基因簇中swn K 基因KS 区域设计引物,构建SYGR Green I实时荧光定量PCR检测方法,初步分析黄花棘豆植物样品中内生真菌生物量与苦马豆素含量的关系.结果表明,基于swnK基因KS区域构建的实时荧光定量PCR法特异性较好,灵敏性较高,当真菌起始DNA浓度在0.009?90ng/μ...     

苦马豆素来源及其检测方法的研究进展

概述了苦马豆素的来源和理化特性的研究情况,从薄层色谱（TLC）、气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）、酶分析法、荧光光谱和离子抑制色谱等几个方面介绍了苦马豆素定性、定量检测方法的研究进展,并对各种检测方法的优缺点进行了比较。