犬冠状病毒部分纤突蛋白基因的分子克隆

以RT－PCR方法扩增出犬冠状病毒（CCV）YS1、CI1 2株国内分离病毒的部分纤突蛋白基因，经酶切鉴定为CCV特异性核苷酸片段。采用平端连接法将Wizard^TM PCR纯化试剂盒纯化的PCR产物克隆于pUC19 Sma I酶切位点上，获得YS1pUC19、CI1pUC19重组质粒。琼脂糖凝胶电泳鉴定表明：重组质粒大于蓝斑菌质粒。以BamHI、Kpn I双酶切重组质粒可获得比原PCR产物略大的核苷酸片段，并从中以PCR方法扩增出与原PCR产物大小相同的核苷酸片段。     

抑制素基因疫苗的构建

使用猪抑制素α亚基上的第1－32位所基酸所对应的DNA片段作为目的基因，并与乙肝表面抗原基因串联，插入原核表达质粒（pUC18)中，构建重组原核表达质粒，经过在大肠杆菌中扩增后提取目的基因片段，手稿真核表达质粒(pcDNA3.0）中，构建重组真核表达质粒，经过扩增和提取，并经过测定获得了抑制素基因疫苗。     

质粒pUC19-CM-D的构建及应用

[目的]用克隆载体pUC19构建乳杆菌自杀质粒及乳杆菌基因缺失工程菌[方法]在质粒pUC19的多克隆位点插入氯霉素抗性基因构建pUC19-CM载体;在pUC19-CM载体氯霉素抗性基因的两侧均添加1个用于同源重组的同源臂,再构建成自杀质粒pUC19-CM-D。将自杀质粒pUC19-CM-D转化乳杆菌进行抗性筛选即可得到目标基因被抗性基因替换的突变株。[结论]pUC19-CM-D质粒的构建及应用为乳杆菌基因缺失工程菌的构建提供了一个快速有效的手段,也为乳杆菌基因功能研究奠定了基础。     

质粒pUC19-CM-D的构建及应用

[目的]用克降载体pUC19构建乳杆菌自杀质粒及乳杆菌基因缺失工程菌.[方法]以鼠李糖乳杆菌为研究对象,在质粒pUC19的多克隆位点插入氯霉素抗性基因构建pUC19-CCM载体;在pUC19-CM载体氯霉抗性基因的两侧均添加1个用于同源重组的同源臂,再构建成自杀质粒pUC19-CM-D.将自杀质粒pUC19-CM-D.将自杀质粒pUC19-CM-D转化乳杆菌进行抗生筛选即可得到目标基因被抗性基因替换的突变株.[结果]通过改造pUC19质粒,获得了可应用于构建鼠李糖乳杆菌D-乳酸脱氢酶基因缺陷型菌株的自杀质粒pUC19-CM-D.运用抗性基因替换方法来构建基因缺陷型菌株,在一定程度上避免了质粒整合带来的问题,同时提供了一个筛选标记,能够通过一次筛选即可得到缺陷型菌株.这种自杀质粒的改造和基因缺陷型菌株的构建方法具有通用性,可以应用于其他的载体和菌株.[结论]pUC19-CM-D质粒的构建及应用为乳杆菌基因缺失工程菌的构建提供了1个快速有效的手段,也为乳杆菌基因功能研究奠定了基础. Abstract： [Objective] The aims were to construct a new suicide plasmid of Lactobacillus and gene deletion engineering bacteria of Lactobacillus with pUC19 vector,[Methods]pUC19-CM was constructed by inserting a chloramphenicol resistant gene into the multi-cloning site of pUC19,and then two homologous fragments were cloned into each side of the pUC19-CM to construct suicide plasmid pUC19-CM-D.[Results]A replacement mutant strain,whose target gene was replaced by resistant gene,could be obtained by transforming the suicide plasmid pUC19-CMD into Lactobacillus for resistance screening. [Conclusion] The construction and application of pUC19-CM-D provided a fast and efficient means of construction of gene deletion engineering bacteria of Lactobacillus,and laid a foundation for study of gene function of Lactobacillus.     

大麦黄矮病毒缺失复制酶基因植物表达载体的构建及转基因小麦的 …

以大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系的ＲＮＡ为模板,采用反转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,扩增出１１３４ｂｐ的缺失复制酶基因。将扩增的片段克隆到ｐＵＣ１９的Ｓｍａｌ位点上并进行了序列测定,获得正向插入的重组质粒ｐＵＣ１９Ｄ。以Ｋｐｎｌ从Ｘｂａｌ从ｐＵＣ１９Ｄ上切下此基因并插入质粒ｐＥｍｕ－ｍｃｓ－Ｎ得到植物表达载体ｐＰＰＩ８。应用花粉管通道法转化普通小麦品种陇鉴１２７、陕１６０和晋麦４７,通过卡那酶     

巴西橡胶树棒孢霉落叶病病菌蛋白激酶基因突变体△CCK1的互补载体构建及转化

为了明确蛋白激酶CCK1在巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌中的致病相关功能,在前期研究基础上通过PCR扩增,获得了该基因1604 bp的5′端片段（L－C5）和131 bp的3′端片段（L－C3）,同时以pCAMBIA3300质粒为模板扩增获得了552 bp抗性标记基因（L－Bar）,并用In－FusionHD Cloning Kit将L－Bar基因反向插入了L－C5和L－C3序列之间,克隆至pUC19载体上,成功构建了△CCK1突变体的互补载体p△CCK1－C。再从该载体上扩增互补片段,借助PEG介导法转化△CCK1突变体的原生质体,经Basta平板筛选、PCR检测和测序鉴定表明,获得了△CCK1突变体的互补转化子。为进一步明确CCK1基因在巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌中的致病相关功能打下了材料基础。     

小麦连体叶片高效瞬时表达体系的构建

分别以洋葱表皮和生长7d的小麦连体叶片为材料,采用HeliosTM基因枪将35S-sGFP-TYG-NOS(pUC19)外源基因导入植物细胞使其瞬时表达,摸索出一整套适合于小麦连体叶片高效瞬时表达体系的各项参数,包括:氦气压力、金粒子直径、PVP浓度、每次轰击的质粒DNA以及金粉用量等。并指出选用合适的质粒DNA浓度和多片小麦叶片同时轰击可有效提高转化效率。     

重组Tgo DNA聚合酶最适扩增条件的研究

以重组TgoDNA聚合酶为研究对象,检测了其最适扩增条件。结果表明:该重组酶的最适pH为8.75,最适Mg2 浓度为2.0 mmol/L,最适延伸温度为71.9℃。利用该重组酶成功扩增了质粒pUC19、野大麦Na /H 逆向运转蛋白基因、拟南芥Timeless基因、小鼠Cx37基因和人CYT2C9基因。     

大肠杆菌VT噬菌体受体基因重组质粒的构建

取含有卡那霉素抗性（Kan^R)基因的自杀性质粒pJP55603和含vpr全长基因的pUC19phiΦRID质粒，分别采用粘性末端及平末端两种连接法，2种质粒Hinc II单酶切后进行平末端连接，经鉴定未得到重组质粒，pJP5603用Hinc II和Xma I消化，回收3kb的载体质粒，pUC19ΦRID用Hinc Ⅱ和Age I消化，回收778bp vpr目的基因，通过粘性末端连接，转化到感受态细菌CC118λpir，利用Kan^R进行筛选，获得的克隆经Acc I酶切鉴定和PCR检测，确定得到重质粒，即pYYvpr，将重组质粒的DNA转化到含有全长vpr基因的感受态细胞MC1061，筛选到的克隆经PCR检测，得到一株克隆既扩增出vpr基因，又扩增出Kan^R基因，初步鉴定该克隆为MC1061的vpr同源基因突变株，暂定名为MC1061Δvpr，从而为研究vpr基因的功能提供了重要的试验材料。     

防御素基因克隆和表达载体构建

人防御素(HNP)是一类广谱抗菌阳离子小肽的总称,一般具有3个分子内二硫键。防御素对于细菌、真菌乃至某些被膜病毒有广谱杀伤作用,是免疫系统中的重要组分。实验根据已发表的HNP-1cDNA序列,设计并合成了一对引物。以HL-60细胞总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增目的片段并克隆到pUC18载体上,经筛选获得阳性重组子pUC18-HNP-1(pDFS1)。测序分析证实,扩增片段即为HNP-1cDNA。pDFS1再经SmaI与SalI酶切、插入pGEX-6p-1质粒构建HNP-1表达载体。利用PCR技术和酶切反应筛选转化子最终获得pGEX-6p-1-HNP-1(pDFS2)重组质粒。     

缺失GDD保守区的黄瓜花叶病毒复制酶基因的克隆及植物表达载体构建

以CMV亚组1株系Fny-CMV RNA2基因组为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到2.5 kb的全长复制酶基因扩增产物.对此产物进行纯化,并用NcoI和BspHI进行双酶切,得到3个片段,将不含有GDD保守区的2个片段用T4 DNA连接酶连接,并对连接产物进行PCR扩增,得到2.2kb左右缺失GDD保守区的黄瓜花叶病毒复制酶基因的扩增产物.将其克隆到pGEM-T Easy Vector上,进行序列测定,结果表明GDD保守区确已缺失.该缺失不导致开放阅读框架的移码将缺失GID保守区的基因定向克隆到植物表达载体pBI121中,并经三亲交配导入根癌农杆菌中,经PCR及酶切鉴定,证实质粒已被导入.     

法氏囊B细胞λ轻链基因编码蛋白在大肠杆菌中的表达

为获得鸡λ轻链基因的表达蛋白,采用聚合酶链反应从鸡法氏囊B细胞cDNA文库中扩增出分泌表达蛋白的编码基因;用限制性内切酶消化后,插入克隆载体pUC19中。经PCR鉴定与序列测定证实后,以亚克隆法构建于原核表达载体PET43a的相应酶切位点。经过基因序列测定、BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定证实克隆载体正确插入载体PET43a。转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导、SDS-PAGE分析表明目的蛋白得到表达;且能与His-Taq单抗相结合。     

EHEC O157：H7紧密黏附素C300与LTB融合基因克隆与序列分析

目的构建肠出血性大肠埃希菌（EHEC）O157：H7紧密黏附素C-端免疫保护片段与肠黏膜佐剂大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）的融合基因克隆载体,为进一步研究EHEC O157：H7重组疫苗奠定了基础.方法设计引物采用PCR技术从EHEC O157：H7基因组中扩增Intimin C300的编码基因,从肠产毒性大肠埃希菌基因组中扩增LTB的编码基因,分别构建克隆载体pUC18-C300和pUC18-LTB,采用酶切位点相连技术,构建pUC19-C300-LTB克隆载体,并测序.结果从EHEC O157：H7基因组中扩增出了900 bp的目的片段,从肠产毒素大肠埃希菌基因组扩增出了275 bp的目的片段,分别插入载体pUC18和pUC19,经酶切及测序鉴定与目的序列一致.结论克隆出EHEC O157：H7的紧密黏附素C-端免疫保护片段与不耐热肠毒素B亚单位基因,并成功构建融合基因克隆载体,测序正确.     

伪狂犬病病毒gG基因缺失通用转移载体的构建

对克隆有伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA SphI 15kb片段的质粒pBSA用SphI和KpnI消化，将含gG全基因及其上游PK基因，下游gD基因部分编码区的约2．6kb的片段亚克隆到消除了EcoRI位点的载体pUC19中，获得重组质粒pUSK(E)。以pEGFP-N1为模板，通过PCR扩增约0．3kb的SV40Poly(A)片段，并将其克隆到杆状病毒转座载体pFastBac1的NotI和PstI位点，利用pFastBac1的BamHI和PstI将含有9个酶切位点以及SV40Poly(A)的片段亚克隆到pUSK(E)的相应位点，在插入的同时导致gG基因5‘端编码区约9个酶切位点以及SV40Poly(A)的片段亚克隆到pUSK(E)的相应位点，在插入的同时导致gG基因5‘端编码区的400bp的缺失，构建了由gG启动子驱动gG部分编码区缺失的通用转移载体pgG-Uni。序列分析进一步证实：有7个单一酶切位点可供外源基因直接插入。上述结果为构建以伪狂犬病病毒作载体的多价基因工程疫苗以及利用标记蛋白探讨伪狂犬病病毒在体内的增殖与分布奠定了基础。     

基于Xcm I酶切的pUC19-T载体的构建

[目的]构建以pUC19质粒为基础可利用Xcm I内切酶制备的T栽体。[方法]化学合成2条含有双XcmI酶切位点的互补寡聚核苷酸链,经过变性、复性后克隆入pUCl9质粒的HindIII和BamHI位点之间,通过XcmI酶切后得到一个线性化的带有3’末端突出一个T碱基的T栽体。[结果]经TA克隆验证,制备的pUC19-HB-T载体对PCR产物的克隆率达到95％以上。[结论]构建的pUC19-HB-T载体可用于PCR产物的克隆、测序及后续分子生物学操作。     

水稻OsGL1-2基因反义表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术（PCR）扩增水稻OsGL1-2基因反义片段及基因自身的启动子,并分别克隆到pUC19克隆载体上,得到含有OsGL1-2启动子＋OsGL1-2反义片段的中间载体.对重组子进行PCR检测和酶切分析并测序,结果表明,长度分别为417和2 199bp.将OsGL1-2启动子＋OsGL1-2反义片段克隆到植物表达载体pCambia1380多克隆位点,构建了该基因的植物反义表达栽体pCamGL1-2.     

pBIN438-CMV △Rep表达载体的构建及其在根癌农杆菌中的转化

用PCR方法扩增黄瓜花叶病毒部分复制酶基因(CMV△Rep),连接到PUCm-T载体上构建成克隆载体PUCm-T-CMV△Rep。用Bam HⅠ和SalⅠ分别对克隆载体PUCm-T-CMV△Rep和植物表达载体p BIN438进行双酶切,获得目的片段和线性质粒。在T4 DNA连接酶的作用下进行定向连接,构建成植物表达载体p BIN438-CMV△Rep。采用Ca Cl2冻融法将重组子导入根癌农杆菌LBA4404。经PCR和双酶切鉴定,表明重组质粒p BIN438-CMV△Rep已成功导入根癌农杆菌中。     

一种基于Xcm Ⅰ酶切的pUC19-T载体的构建（摘要）

[目的]构建以pUC19质粒为基础可利用XcmⅠ内切酶制备的T载体。[方法]化学合成2条含有双XcmI酶切位点的互补寡聚核苷酸链,经过变性、复性后克隆入pUC19质粒的HindⅢ和BamHⅠ位点之间,通过XcmI酶切后得到一个线性化的带有3末端突出一个T碱基的T载体。[结果]经TA克隆验证,制备的pUC19-HB-T载体对PCR产物的克隆率达到95%以上。[结论]所构建的pUC19-HB-T载体可用于PCR产物的克隆、测序及后续分子生物学操作。