猪博卡病毒NP1基因的克隆及其生物信息学分析

根据Gen Bank发表的猪博卡病毒主要抗原基因NP1基因设计1对引物,采用降落PCR方法进行扩增,克隆后测序,并对该基因进行生物信息学分析。结果表明:成功克隆到猪博卡病毒NP1基因;NP1蛋白的二级结构中自由卷曲含量最高(51.77%),无跨膜蛋白,含有1个糖基化位点、30个磷酸化位点,有6个线性B细胞优势抗原表位,分别位于NP1蛋白的7—14位、27—50位、59—73位、85—94位、102—108位、151—155位。     

犬博卡病毒PCR检测方法的建立及其应用

[目的]建立犬博卡病毒(Canine bocavirus,CBo V)的PCR检测方法,了解其流行情况。[方法]根据Gen Bank数据库上CBo V的VP2基因序列合成1对引物,建立PCR检测方法,并运用该方法对临床样品进行检测。[结果]特异性试验中,除CBo V有目的条带出现外,犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬传染性肝炎(ICHV)、犬副流感病毒(CPIV)、猫瘟热(FDV)等均无条带出现。敏感性试验表明,此检测方法对CBo V的最低检测量为4.806 2 pg/μL。重复性试验表明,多次重复试验结果一致,表明此方法重复性好。425份样品中仅有1份样品扩增出目的条带,经测序比对鉴定为CBo V。初步的流行病学调查结果表明,CBo V在犬中的流行率与感染率极低。[结论]建立的PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、可重复性强等特点。     

一起猪流行性腹泻病毒与博卡病毒混合感染病例分析

陕西渭南某猪场发生了一起仔猪腹泻病例,通过临床症状观察、病理解剖、细菌分离以及病原RT-PCR检测,确诊为一起流行性腹泻病毒混感博卡病毒病例。针对发病原因提出了防治措施,为防控仔猪腹泻提供参考。     

猪博卡病毒1型nPCR检测方法的建立与SXWN20株基因序列分析

建立了检测猪博卡病毒1型(PBoV)的nPCR方法,对陕西省部分猪群PBoV1型感染情况进行流行病学调查。通过优化反应体系与条件,测试了方法的灵敏性和特异性,建立了PBoV1型nPCR检测方法,并对阳性样品进行测序分析。结果表明,建立nPCR方法检测PBoV1型单链DNA的极限为4.742×10^-2 ng/μL,该方法与PCV2、PCV3、PPV、猪链球菌和猪大肠杆菌DNA均无交叉反应,特异性良好。检测了陕西省猪场60份样品,PBoV1型阳性率为3.33%(2/60)。测序获得的SXWN20株VP1/VP2基因序列比对发现,SXWN20株与参比的PBoV1型毒株核苷酸同源性为96.6%～97.5%,与PBoV2/3/4/5型同源性仅为53.8%～59.7%。进化树分析显示,所有参比毒株分为3个大分支,SXWN20株与PBoV1型毒株处在一个进化分支,PBoV2型处在一个进化分支,PBoV3/4/5型处在一个进化分支。     

猪弓形虫病PCR诊断方法的建立

以具有35个拷贝的重复序列B1基因作为弓形虫种特异的遗传标记,建立诊断弓形虫病特异性的PCR方法.敏感性和特异性试验结果表明:该PCR方法最低能检测到10个弓形虫速殖子DNA,且与寄生于猪体内的6种常见微生物无交叉反应,说明该PCR方法具有高度的敏感性和特异性.动物感染试验检测结果表明,在试验动物出现明显临床症状时,对取材的7个组织样品用该PCR方法检测,有6个组织样品为阳性,其中扩增结果最清晰的的组织为肺和肝组织.     

3株猪博卡病毒的全基因遗传进化及重组分析

[目的]了解猪博卡病毒(Porcine bocavirus,PBoV)在广西猪群中的流行状况及遗传学特征,为有效防控PBoV感染提供科学依据.[方法]采用PCR对采自广西境内养殖场的388份猪源样品进行PBoV检测,挑选3份阳性样品(1份为PBoVG1阳性样品,2份为PBoVG3阳性样品)进行全基因扩增,测序获得的序列使用LaserGene进行处理及多重比对分析,应用MEGA 5.2中的ClustalW进行遗传进化分析,通过邻接法(NJ)构建系统发育进化树,并以SimPlot 3.5.1进行潜在基因重组事件分析.[结果]猪内脏组织(肺脏、脾脏和淋巴结的混合样品)、扁桃体、脑组织和公猪精液的PBoV阳性率分别为25.19%、8.33%、2.94%和1.54%.在所有检测样品中,PBoVG3基因群的阳性率最高,为9.02%,PBoVG2和PBoVG1基因群的阳性率均为1.55%;不同基因群的PBoV存在混合感染现象,其中,PBoVG1+PBoVG3二重感染率为1.03%,PBoVG2+PBoVG3二重感染率为0.77%.从PBoV阳性样品中扩增获得3条PBoV全基因序列(毒株),命名为GXBH2014、GXBH2015和GXLC2014,对应的GenBanK登录号为MN747332、MN747333和MN747339.其中,GXBH2014株序列全长5055 bp,GXBH2015株序列全长5070 bp,GXLC2014株序列全长4313 bp.GXBH2014株和GXBH2015株与PBoVG3基因群参考毒株SH20F各编码基因的推导氨基酸序列同源性较高,为70.9%~98.5%;GXLC2014株与PBoVG1基因群参考毒株SX各编码基因的推导氨基酸序列同源性最高,为98.0%~99.1%.基于PBoV全基因编码区(CDS)全长序列构建的系统发育进化树也显示,GXBH2014株和GXBH2015株同处于PBoVG3基因群分支上,GXLC2014株处于PBoVG1基因群分支上.基因重组分析结果显示,在GXBH2014株的全基因序列中检测到1个潜在的重组断点,位于NP1基因的第391位核苷酸;而在GXBH2015株和GXLC2014株的全基因序列中均未检测到潜在的重组断点.[结论]广西猪群中普遍存在PBoV感染,且PBoVG1、PBoVG2和PBoVG3基因群毒株同时存在.其中,GXBH2014株可能是IA159-2株(KF025386)与MN154-1株(KF025384)基因重组进化的产物.     

鸡毒霉形体感染的PCR检测方法的建立及应用

用多聚酶链反应检测了鸡毒霉形体种内菌株的特异性ＤＮＡ片段,并用该法对人工感染鸡及野外野群进行了ＭＧ感染的分子流行病学调查。结果表明,通过基因扩增及电泳,仅ＭＧ出现特生扩增条带,最低能检出１８ｐｇＭＧＤＮＡ,说明该方法具有很高的特异性和敏感性。人工感染６０只鸡,３ｄ后即可用ＰＣＲ查出ＭＧ阳性,６ｄ后１００％为阳性,对照鸡全部为阴性。与分离培养的结果完全一致。ＰＣＲ对野外鸡群的ＭＧ检出率为１０．５－３     

安氏隐孢子虫ITS-1基因PCR检测方法的建立

[目的]建立针对安氏隐孢子虫的PCR快速检测方法,为安氏隐孢子虫的检测和分子流行病学调查提供技术支撑.[方法]根据GenBank中安氏隐孢子虫的ITS-1基因序列设计1对特异性引物,建立基于ITS-1基因的PCR方法,并通过特异性试验、敏感性试验、临床检测以及与经典巢式PCR检测方法进行比较等,验证其可行性.[结果]基于ITS-1基因的PCR检测方法能扩增出安氏隐孢子虫的特异条带,而对猪源隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、微小隐孢子虫、牛泰勒氏虫、牛巴贝斯虫、伊氏锥虫、食道口线虫的扩增结果均为阴性;将测序结果进行BLAST比对,发现其与GenBank中安氏隐孢子虫的同源性均在99%以上.敏感性最低可检测每克牛粪中5个卵囊;用于检测广西不同地区的1613份牛粪样品时,与经典巢式PCR检测方法相比,发现两者的阳性检出率均为11.72%,且吻合率达100%.[结论]安氏隐孢子虫ITS-i基因PCR检测方法具有快速、敏感、特异的特点,适用于安氏隐孢子虫的检测和分子流行病学调查分析.     

应用PCR检测猪伪狂犬病毒野毒的研究

[目的]对猪伪狂犬病毒野毒进行检测.[方法]根据已发表的猪伪狂犬病病毒gE基因核苷酸序列,设计合成1对引物,扩增片段长度为276 bp,优化PCR反应条件,建立检测PRV野毒的PCR方法.[结果]利用建立的PCR方法检测疑似PRV野毒感染的临床送检组织病料34份,阳性样品18份,阳性率达52.94％（18/34）,选取6份阳性病料PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列鉴定,测序结果表明均为PRV gE基因特异性序列.[结论]该方法敏感、特异、可靠,可用于PRV野毒感染的快速诊断和流行病学调查.     

副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用

针对副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)16 S rRNA序列设计1对特异性引物,能扩增出821 bp的特异性DNA片段,并据此建立了快速准确鉴定副猪嗜血杆菌PCR方法,临床试验证明该方法具有很好的特异性和敏感性.13份疑似病料检测结果表明,PCR检测结果与传统生化鉴定结果符合率为100％.结果表明已成功建立了副猪嗜血杆菌PCR检测方法,并可应用于临床副猪嗜血杆菌的检测.     

猪瘟病毒实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速检测猪瘟病毒的基因检测方法,根据GenBank中猪瘟病毒(CSFV)基因组NS2基因序列设计并合成引物和Taq Man探针,通过各项条件优化并以10倍稀释度的质粒为标准品进行实时定量PCR扩增制作标准曲线,建立检测CSFV的实时定量PCR方法。该方法的检测灵敏度可达每微升10个拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高出1个数量级;对标准品质粒检测的线性范围是1.0×109～1.0×101μL-1。对1.0×107、1.0×105、1.0×103μL-13种稀释度的标准品质粒进行重复试验,批内变异系数分别是0.30%、0.85%、0.43%,批间变异系数分别是0.81%、1.36%、0.63%,具有良好的重复性。应用该方法对45份临床样品进行检测,检出26份阳性样品,而常规PCR只检测出19份阳性样品,说明该实时定量PCR方法的敏感性高于常规PCR。可见,该方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,可用于检测病料中的猪瘟病毒。     

枯草芽孢杆菌特异性PCR快速检测方法的建立和应用

参照Gen Bank中登录的枯草芽孢杆菌16S r RNA基因,设计1对引物,扩增片段大小为460 bp的基因片段,该方法对枯草芽孢杆菌检测的灵敏性为1pg总DNA量,对枯草芽孢杆菌DNA的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,成功地建立枯草芽孢杆菌PCR检测方法,且该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点。     

检测猪圆环病毒2型DNA的套式PCR方法的建立及应用

为了进一步调查研究PVC2的流行病学及其致病机制,根据猪圆环病毒2型GD株及已发表的PCV2的全基因组序列,对来自广东、广西、湖南、海南等地287个猪场送检的1 560个可疑病料进行PCR扩增,并对扩增产物进行克隆、酶切、测序鉴定,建立了PCV2检测的套式PCR方法.结果表明,PCR扩增获得了预期大小的片断,将测序结果与GenBank收录的PCV2序列进行比较,发现同源性均在90%以上.该PCR方法对PCV2是特异的,并具有良好的重复性和稳定性.用该PCR方法对287个猪场的1 560份样品进行了检测,其中983份为PCV2阳性,表明该病在我国广泛流行.     

PCV2套式PCR检测方法的建立及应用

根据猪圆环病毒2型GD株及已发表的PCV2的全基因组序列,设计1对PCV2型特异性引物,对可疑病料进行PCR扩增。将扩增产物连接到pMD 18-T载体上并克隆到大肠杆菌DH5α中,提取质粒进行套式PCR、酶切、测序鉴定,结果扩增出了PCV2的目的片段。将测序结果与GenBank收录的PCV2序列进行比较,发现同源性均在90%以上。用该PCR方法对287个猪场的1 560份样品进行了检测,其中983份为PCV2阳性,阳性率为63%。     

猪鼻支原体套式PCR诊断方法的建立及应用

为建立猪鼻支原体快速诊断方法,根据猪鼻支原体P69基因序列设计2对引物,建立了猪鼻支原体套式PCR诊断方法,对建立的方法进行特异性、敏感性检测,同时进行临床检测。结果表明,应用建立的套式PCR方法对猪鼻支原体DNA的检出限为1.4×10~(-5)ng/μL,与常见感染猪的细菌、病毒均无交叉反应。利用建立的套式PCR方法对23份临床样品进行检测,阳性检出率为73.9%。本研究建立的猪鼻支原体套式PCR具有特异性强、敏感性高等优点,可用于猪鼻支原体的临床诊断。     

獐茅AIHAK1 Real-time PCR定量方法的建立

以β-actin为内参基因,根据已克隆的AIHAK1及β-actin碱基序列,分别设计了实时定量特异性引物,优化了反应的退火温度与引物浓度,并以优化的条件建立了相对定量标准曲线,同时对该方法的稳定性进行了评价.结果表明AIHAK1及β-actin基因的real-time PCR扩增效率分别为1.09和1.04,线性相关系数分别为0.996和0.997,批内及批间变异系数<5%.所建立的A1HAK1 real-time PCR定量方法操作简便、定量准确、重复性好,为进一步探索AIHAK1的功能、mRNA表达水平的变化及转AIHAK1农作物的检测奠定了方法学基础.     

BRSV和BPIV-3双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速诊断牛呼吸道合胞体病毒(BRSV),牛副流感病毒3型(BPIV-3)病毒病的方法,根据Genbank中登录的BRSV核衣壳蛋白N基因序列和BPIV-3的核衣壳蛋白N基因序列,利用分子生物学软件Primer5.0设计2对特异引物,经过条件优化,建立了BRSV和BPIV-3的双重PCR检测方法。采用该方法检测BRSV和BPIV-3参考毒株,特异性良好。对参考毒株进行梯度稀释检测,结果该方法检测BRSV的敏感性可达10 TCID50·100μL-1,BPIV-3可达10 TCID50·100μL-1。应用建立的双重PCR方法能够从临床样品中检测出BRSV和BPIV-3。表明建立的双重PCR方法具有特异、敏感、快速的特点,可用于BRSV和BPIV-3的临床检测。     

牛病毒性腹泻病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

参照多株不同基因型和基因亚型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′UTR相对保守的基因序列,设计3对引物,其中1对能够扩增不同基因型BVDV 5′UTR片段(288 bp),另2对分别能够扩增BVDV-1型和BVDV-2型5′UTR片段(195 bp和116 bp)。扩增片段大小与预计片段一致。对PCR反应条件进行优化,建立了一种特异、敏感的RT-nPCR检测方法。敏感性试验表明,敏感性为10-2TCID50/mL。特异性试验表明,对猪瘟兔化弱毒疫苗株、牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的检测结果均为阴性。通过对新疆部分地区无BVD临床症状的牛场208份奶牛血样检测,阳性率为50.43%,表明该方法具有快速、简便、特异性强和灵敏度高等特点,可以作为BVDV隐性感染临床诊断的有效方法。     

锦鲤疱疹病毒TaqMan荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用

为建立快速有效的锦鲤疱疹病毒病检疫方法,根据锦鲤疱疹病毒(KHV)聚合酶基因(Sph)的保守序列设计1对引物和相应的TaqMan探针,建立了一种快速检测锦鲤疱疹病毒病荧光PCR方法。用建立的检测方法对细胞培养物进行检测,并与常规PCR对比,结果荧光PCR灵敏度高于普通PCR,能检出的最低拷贝数为1.6×102/μL。应用该方法对样品进行检测,结果表明:所建立的荧光PCR检测方法4 h内可报告检测结果。该方法具有快速、灵敏、特异及重复性好等特点,适用于锦鲤疱疹病毒的快速检疫。