杜仲愈伤组织诱导与继代培养研究

[目的]对杜仲进行愈伤组织诱导及继代培养,建立愈伤组织的培养系统。[方法]以杜仲子叶、幼叶、下胚轴为外植体,接种于不同培养基中诱导和继代。[结果]不同外植体愈伤组织的诱导率高低顺序为：下胚轴〉子叶〉幼叶。子叶和幼叶在MS＋NAA 1.00 mg/L、MS＋2,4-D 1.00 mg/L培养基中诱导出的愈伤组织在MS＋6-BA 1.00 mg/L＋NAA 2.00 mg/L、MS＋2,4-D 1.00 mg/L培养基中继代培养为佳;胚轴在MS＋NAA 3.00 mg/L、MS＋6-BA 1.00 mg/L＋NAA 1.00 mg/L和MS＋2,4-D 1.00 mg/L培养基中诱导出的愈伤组织在MS＋6-BA1.00 mg/L＋NAA 2.00 mg/L、MS＋6-BA 1.00 mg/L＋NAA 1.00 mg/L和MS＋2,4-D 1.00 mg/L培养基中继代培养为佳。[结论]杜仲的子叶、幼叶和胚轴可采用多条途径实现愈伤组织的诱导和继代增殖培养,为进一步筛选高产细胞系打下基础。     

杜仲愈伤组织的诱导及植株再生的研究

在附加不同浓度ＮＡＡ,６—ＢＡ的ＭＳ培养基上对杜仲的下胚轴和子叶进行愈伤组织的诱导并获得两类不同的愈伤组织,一类是白色的结构松散的非胚性愈伤组织,虽然能继代培养,但在附加较高浓度的６─ＢＡ的ＭＳ培养基上都不能再生植株;另一类是黄绿色的结构紧密的有颗粒状突起的胚性愈伤组织．在附加适量的６—ＢＡ的ＭＳ培养基上能较容易再生小植株。实验表明,杜仲的下胚轴和子叶在附加１．０ｍｇ／ＬＮＡＡ和１．０ｍｇ／Ｌ６—ＢＡ的ＭＳ培养基上能１００％诱导成胚性愈伤组织;胚性愈伤组织在附加０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ和２．５ｍｇ／Ｌ６—ＢＡ的ＭＳ培养基上培养,植株再生频率高达９２％;小植株转移到附加１．５ｍｇ／Ｌ的ＩＢＡ的１／２ＭＳ培养基上,１５ｄ左右长出较粗的根。     

巨峰葡萄外植体愈伤组织的诱导和植株再生

选取了栽培品种巨峰作为试材,进行了外植体愈伤组织诱导和植株再生的研究．通过葡萄品系巨峰无菌外植体的获得,叶片的愈伤组织诱导、再分化,以器官发生途径实现植株再生．结果表明：外植体消毒灭菌过程中,用1g／L汞处理7min,外植体污染率和茎尖褐变的比率适中,而且茎尖被诱导分化的成活率最高,可达30．0％．最适的分化培养基为MS＋6-BA1．0mg／L＋NAA0．01mg／L;叶片愈伤组织诱导的培养基选择MS附加5．0mg／L6-BA和0．5mg／LNAA较为适宜;MS＋6-BA0．5mg／L＋NAA0．05mg／L最适宜巨峰葡萄愈伤组织再生不定芽;将所得的不定芽继代增值诱导生根,1／2MS＋IBA0．2mg／L为理想的生根培养基,根长适中,根数较多．初步建立了巨峰葡萄栽培品系的再生体系．     

罗汉果胚性愈伤组织的诱导及植株再生

为建立罗汉果高频再生体系,以无菌萌发种子的子叶为外植体,对胚性愈伤组织的诱导及植株再生进 行研究。结果表明,不同6-BA 与2,4-D 或NAA 配比均能诱导罗汉果子叶形成愈伤组织,诱导率为100%,但NAA 比 2,4-D 更有利于罗汉果胚性愈伤组织的诱导。诱导子叶胚性愈伤组织的最适培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L,诱导率为76%。罗汉果胚性愈伤组织为淡黄色或黄色,结构松散,呈颗粒状。2.0 mg/L TDZ 能有效促进不定芽的 分化,分化率为83.3%。组织细胞学观察发现,子叶胚性愈伤组织通过器官发生途径再生植株。随着愈伤组织表面逐 渐转绿,其内部细胞首先分化形成维管组织,然后出现瘤状结构的外表面。在瘤状结构內靠近表层的部位有多个分 生细胞中心,分生细胞中心向外分化形成不定芽。     

小麦胚愈伤组织的诱导和植株再生

对3个小麦品种的成熟胚及幼胚进行培养，研究不同基因型、培养基对愈伤组织诱导及分化的影响。结果表明，不同培养基对小麦愈伤组织诱导有一定影响；不同基因型的小麦愈伤组织诱导、分化及生根的能力有一定差别。陕280愈伤组织诱导率及分化率最高。同一品种不同外植体经诱导后愈伤组织产生的能力有所不同，同一品种愈伤组织的诱导率幼胚比成熟胚愈伤组织的高。     

不同培养基对杜仲愈伤组织诱导和生长的影响

以MS、LS、B5、N6、H、Nitsch、White、WPM为基本培养基,分别添加1.0 mg/L NAA+0.3 mg/L BA,进行不同培养基对杜仲嫩茎及幼叶愈伤组织诱导的研究;以MS、LS、B5、N6、H、Nitsch、White、1/2 MS为基本培养基,分别添加0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L BA,进行不同培养基对杜仲嫩茎及幼叶愈伤组织继代培养的研究.结果表明,MS培养基有利于杜仲幼茎愈伤组织的诱导,而B5培养基不仅对叶的愈伤组织诱导有利,对茎和叶愈伤组织的继代培养也是最理想的.     

葡萄抗寒砧木外植体愈伤组织诱导和植株再生体系的研究

[目的] 研究葡萄抗寒砧木外植体愈伤组织的诱导和植株再生体系的建立.[方法] 以河岸、山河系列葡萄抗寒砧木为试材,采用对比试验和正交试验,研究葡萄试管苗再生的最佳外植体、最佳激素组合.[结果] 通过对葡萄叶片、叶柄砧、无芽茎段、新根再生的研究,得出最佳再生外植体为叶柄砧.利用细胞分裂素6-BA、TDZ与生长素组合诱导不定芽,MS＋ 6-BA 3.0mg/L＋ NAA 0.05 mg/L不定芽生成诱导率为6.52％;以MS＋TDZ 3.0 mg/L＋ IAA0.05 mg/L为培养基,诱导率为2.5％.[结论] 建立了葡萄抗寒砧木的再生体系.     

小麦成熟胚愈伤组织的诱导和植株再生

从完整的小麦种子和它的离体胚成功地诱导出了愈伤组织。愈伤组织诱导和继代培养基中2,4-D、VB_1和肌醇的浓度影响植株再生频率。在分化培养基中加入500mg/L 水解酪蛋白促植再生。KT 对于愈伤组织的生长和分化有抑制作用。不同品种愈伤组织的植株再生能力相差很大,京红8号的植株再生频率较高,为76%。     

杜仲愈伤组织诱导的研究

采用杜仲优树的幼叶、嫩茎及种子无菌苗的下胚轴、子叶、真叶、根为外植体,以B5和MS为基本培养基,添加1.0mg/LNAA和0.3mg/LBA,进行了不同外植体种类、外植体大小、试验接种方式、外植体采样时间、光照条件、培养基pH值共6种因素对杜仲愈伤组织诱导的影响试验。结果表明,在杜仲愈伤组织诱导中,田间材料幼叶取样时间以3月中旬为好,幼茎的取材时间以4月中旬以前最佳;无菌苗以下胚轴、子叶、真叶诱导效果较好;诱导愈伤组织的培养基pH值以6.3较适宜;培养室的光照条件以12h光照、12h暗培养较有利于愈伤组织诱导;茎段的大小和接种方式以0.7cm长度横放方式诱导效果较好。     

杜仲Fls基因的克隆及原核表达

【目的】克隆杜仲黄酮醇合成酶基因(Fls)全长,对其开放阅读框(ORF)进行原核表达分析。【方法】以杜仲叶片为材料提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆杜仲Fls基因;Fls基因的ORF经限制性内切酶酶切,构建其原核表达载体pET-28a-Fls;最后利用IPTG诱导Fls基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。【结果】获得了黄酮醇合成酶基因全长序列,长度为1 220bp,ORF为1 011bp,编码336个氨基酸;成功构建了原核表达载体pET-28a-Fls;利用IPTG诱导Fls在BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约44ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】获得了杜仲Fls基因的全长和ORF,并成功对其进行了原核表达。     

杜仲AFLP反应体系的建立及优化

【目的】建立并优化适合杜仲的AFLP技术体系,为进一步构建其遗传图谱及开展分子标记辅助育种奠定基础。【方法】对杜仲基因组DNA提取方法、酶切与连接体系、预扩增和选择性扩增程序的影响因素进行分析,并对适合杜仲AFLP分析的引物组合进行筛选。【结果】模板DNA的提取采用改进的CTAB法,酶切模板DNA用量500 ng,酶切时间6 h,连接反应时间6 h,预扩增产物最适稀释倍数30倍。同时筛选出E-AAG+M-CAA,E-AAG+M-CAT,E-AAG+M-CTA,E-AAG+M-CTG,E-ACA+M-CAA,E-ACA+M-CTA,E-ACC+M-CTG共7对适合杜仲AFLP分析的引物组合。【结论】经重复验证,建立的AFLP反应体系适用于杜仲的AFLP分析。     

杜仲幼果和叶片MVA途径基因表达差异分析

【目的】杜仲橡胶是一种多萜类物质,而甲羟戊酸(MVA)途径是合成萜类物质的重要途径之一。分析杜仲MVA途径相关基因表达的差异,预测杜仲橡胶合成的主要上游途径。【方法】在杜仲幼果和叶片转录组测序的基础上,根据基因功能注释和表达分析,确定MVA途径的系列基因,并对其进行表达差异分析。【结果】杜仲橡胶合成的MVA途径共涉及23条Unigene,分别为3条EuACOT、3条EuHMGS、8条EuHMGR、2条EuMK、1条EuPMK和6条EuMDP基因。根据转录组RPKM(Reads Per Kilo bases per Million reads)数据对基因表达差异进行分析,结果表明杜仲MVA途径中的EuACOT8、EuACOT10、EuHMGS4、EuHMGS5、EuHMGS6、EuHMGR18、EuMK3、EuMK4、EuMDP7、EuMDP8、EuMDP9、EuMDP10、EuMDP11基因在幼果和叶片中的表达量具有显著差异,其中仅EuMDP9在叶片中的表达量大于幼果,而其余基因在幼果的表达量大于叶片;EuHMGR15和EuHMGR17只在幼果中特异表达。【结论】MVA途径绝大部分基因在果实中大量表达,这与果实中杜仲橡胶含量远超过叶片的现象相吻合,推测杜仲果实MVA途径为杜仲橡胶合成的主要途径。     

杜仲叶水提取物对几种农作物的化感作用

研究农林复合系统中杜仲枯落叶水浸提液对小麦、油菜、大豆和玉米种子萌发及幼苗生长的影响.结果表明,杜仲枯落叶水浸提液使受试农作物种子发芽指数显著降低.0.1 g·mL-1浸提液处理对4种农作物的发芽率有极显著的抑制作用.油菜、大豆和玉米种子在0.1 g·mL-1时均未长成幼苗,浸提液对其苗高和苗鲜质量有高质量浓度抑制,低质量浓度促进的双重效应.同时除0.005 g·mL-1浸提液对油菜根鲜质量无影响外,对其他3种作物的根长和根鲜质量有显著抑制作用.小麦的苗高、苗鲜质量、根长和根鲜质量均明显低于对照值.4种农作物的根系活力、细胞膜透性和过氧化氢酶活性同样反映了不同程度的化感效应,同时彼此相互作用.     

水分对杜仲截干萌条光合特性及生长的影响

【目的】确定杜仲截干萌条林的适宜供水量,为杜仲人工林的经营提供理论依据。【方法】通过对6年生杜仲进行截干处理,研究了生长季单株供水量分别为0.14(Ⅰ级)、0.28(Ⅱ级)、0.42(Ⅲ级)、0.56(Ⅳ级)m3条件下杜仲萌条的生理及生长指标。【结果】不同水分处理时,杜仲净光合速率日变化曲线不同,自然条件及供水不足(处理Ⅰ、Ⅱ)条件下,杜仲净光合速率日变化呈"双峰"曲线,表现出明显的光合"午休"现象;充足供水(处理Ⅲ、Ⅳ)时,杜仲净光合速率日变化呈"单峰"曲线,"午休"现象消失,且净光合速率提高,6月份是杜仲净光合速率最大的时期。人工供水能增加杜仲萌条的生长,6~9月份,处理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的杜仲萌条枝长总生长量分别较对照增加8.6%,33.9%,70.7%和41.6%,新枝基径总生长量分别较对照增加5.7%,51.4%,114.2%和108.6%。人工供水可以显著增加杜仲二次分枝的数量,处理Ⅲ二次单株分枝数、平均枝条长度、叶干重分别达到21个,18.3 cm,8.4 g/株。【结论】单株供水量为0.42 m3最有利于杜仲萌条生长,二次分枝数最多,平均枝条长度最长,单株叶干重最大。     

基于RNA-Seq的杜仲转录组微卫星特征分析

对杜仲(Eucommia ulmoides)国审良种‘华仲6号’和‘华仲10号’花后70和160d的种仁共4个样本进行转录组测序,对测序数据进行组装和功能注释分类,并对转录组获得的单基因簇(unigene)进行微卫星特征分析。利用新一代高通量测序技术Illumina HiSeq~(TM)2000对杜仲样品进行转录组测序,采用软件Trinity进行组装;利用BLAST软件将unigene序列分别与Nr、GO、COG和KEGG等数据库比对分析;利用MISA软件对转录组的96 469条unigenes进行SSR搜索。结果表明:转录组测序分析,共得到72 791 399个高质量的序列读取片段(Clean reads),包含了14 702 548 161个的碱基序列(bp)信息。对reads进行序列组装,共获得96 469个平均长度为690bp的unigene,序列信息量达到了66.56 Mb。同源性分析结果显示,有49 856个与其它物种同源的unigenes得到注释,占All-unigene的51.68%。将杜仲转录组中的unigene与GO数据库进行比对分析,根据其功能可将注释到的38 983条unigene分成3大类(细胞组分、分子功能和生物学过程)56个分支;根据COG功能可将注释的14 796条unigene基因划分成25个类别;KEGG数据库作为参照,可将注释到的11 260条unigene定位到117个代谢途径分支;SSR位点搜索结果显示,96 469条unigenes中共包含9 621个完整型SSR位点,占总SSR位点的84.14%。完整型SSR位点共包含55种重复基元,其中出现频率最高的重复基序类型为单核苷酸重复中的A/T(4 597个),其次是AG/CT(2 597个)、AT/AT(439个)。     

杜仲雄花氨基酸主成分分析与综合评价

【目的】研究不同种质杜仲Eucommia ulmoides雄花氨基酸含量差异,评价杜仲雄花基于氨基酸构成的综合品质。【方法】利用自动氨基酸分析仪对193份杜仲种质雄花氨基酸含量及组成进行测定,采用主成分分析法对杜仲雄花氨基酸进行客观评价,计算综合得分及排名。【结果】193份杜仲种质雄花中均含有17种氨基酸,总氨基酸和必需氨基酸质量分数分别为206.23和68.37 mg·g-1,天冬氨酸和谷氨酸是主要的2种氨基酸。经主成分分析提取了6个主成分,且第1和第2主成分(必需氨基酸因子)对杜仲雄花氨基酸影响较大。按5%入选率确定了氨基酸性状优良的6种雄花资源,综合评价得出9个种质(10419x、10519x、10345x、10444x、10370x、10552x、10589x、10339x和10515x)杜仲雄花氨基酸品质较好。【结论】主成分分析法可以有效比较不同种质杜仲雄花氨基酸综合质量。     

桑树幼树条、杜仲条和柳条木材化学成分及其在树干上的变异研究

【目的】研究桑枝、杜仲条和柳条木材的化学成分及各主要化学成分含量在树干高度上的变化规律,为木材更合理更有效的利用提供依据。【方法】以桑枝、杜仲条和柳条木材为研究对象,参考我国木材化学成分分析标准中规定的系列测定方法对其纤维素、综纤维素、木质素以及抽提物(热水抽提物、10g/L NaOH抽提物、苯醇抽提物)、灰分和含水率6个指标进行分析,并与重组木常用木材沙柳、杨木、速生杉木及棉秆进行比较。【结果】在树干不同高度上,对桑枝木材而言,纤维素含量差异达显著性水平,基部显著高于中部和梢部,中部与梢部差异不显著;木质素含量差异达极显著性水平,基部极显著高于中部和梢部,中部与梢部差异不显著;综纤维素含量基部和梢部极显著高于中部,基部与梢部差异不显著;灰分含量和含水率差异不显著。对杜仲条木材而言,苯醇抽提物含量梢部极显著高于基部和中部,基部与中部差异不显著;综纤维素、纤维素含量基部和中部极显著高于梢部,基部与中部差异不显著;灰分含量差异不显著;含水率差异达显著性水平,中部与梢部显著高于基部,中部与梢部差异不显著。对柳条木材,各部位综纤维素和木质素含量差异达极显著水平,基部均极显著高于梢部;灰分含量差异不显著;含水率差异达显著性水平,基部显著高于梢部。【结论】就木材化学成分而言,3种木材的基部和中部木材性能优于梢部,3种木材均可作为生产重组木的优质原料,且杜仲条更优。     

杜仲内生真菌中抗苹果炭疽病活性菌株的筛选

对杜仲植株中的内生真菌进行分离纯化,共得到32株内生菌株。通过离体平板对峙培养检测、光学显微镜观察,以及测定在活体果实上的拮抗活性,研究杜仲拮抗真菌与病原菌及其寄主植物苹果果实之间的相互作用。对峙培养显示杜仲内生真菌DZGS07对苹果炭疽菌有较强拮抗作用,具有较强的营养和空间竞争能力,显微观察表明其能造成病原菌菌丝畸形等现象。在生防研究中,内生真菌DZGS07对苹果炭疽病具有较好的生防潜力,处理后的第7天防效达84.19%;对该菌株的ITS 序列进行测定分析,初步鉴定DZGS07为炭疽菌属(Colletotrichum)的真菌。