创伤弧菌铁调基因fur的原核表达及多克隆抗体制备

应用PCR方法克隆了创伤弧菌Vibrio vulnificus FJ03-X2株的铁调基因fur(Ferric uptake regulator),该基因片段大小为450bp,编码149个氨基酸;以pET32a为表达载体,构建了原核表达质粒pET32a-FUR,表达质粒测序结果表明目的基因与GenBank中报道的创伤弧菌fur基因的同源性达98%以上;诱导表达获得可溶性的重组表达蛋白rFUR。镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)纯化rFUR,SDS-PAGE电泳分析其分子量约33kD。以纯化后的融合蛋白rFUR为抗原,4次免疫SD大鼠,制备抗rFUR蛋白大鼠多克隆抗体。用ELISA方法检测鼠多克隆抗体的效价达到1∶256 000,表明融合蛋白rFUR具有良好的免疫原性。     

SCMRP基因原核表达及多克隆抗体制备

SCMRP基因是根据大豆密码子偏向性,采用生物信息学方法对玉米胚乳蛋白基因(MRZP)进行改造并合成的新基因,是适合在大豆中高效表达的高含硫氨基酸基因,可用于豆科作物的品质改良。将新合成的SCMRP基因构建到含有6×His标签序列的原核表达载体pET-32b上,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,SDS-PAGE和Western blot分析表明:经IPTG诱导,转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株中能正常表达出约20ku的目标蛋白质,IPTG最佳诱导表达时间是6h,融合蛋白质以可溶组分形式存在。菌体总蛋白经金属鳌合层析纯化后免疫新西兰大耳兔,制备兔抗血清,经Western blot和琼脂板双向扩散试验表明,已纯化出SCMRP-6×His融合蛋白质,成功制备出SCMRP兔多克隆抗体,抗血清效价达到1:256。上述结果表明,新合成的SCMRP基因是能够在生物体中正常表达的完整基因,制备的SCMRP兔多克隆抗体可用于转SCMRP基因植物蛋白质表达分析。研究结果将为通过转基因技术改良豆科植物含硫氨基酸品质奠定重要基础。     

蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.【结论】PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具.     

大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因设计引物,PCR扩增得到MCP基因编码框全长序列1 392 bp,将其克隆到原核表达载体p ET-32a中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-MCP,并在大肠杆菌BL21中得到了表达,融合表达的重组蛋白分子量约为70 ku,与预期大小一致,主要以包涵体的形式存在。对IPTG浓度,诱导温度等诱导表达条件进行优化,确定0.5 mmol/L的IPTG于37℃的条件下诱导6 h重组蛋白的表达量最佳。纯化GSIVMCP重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了GSIV-MCP多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000。Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接荧光免疫结果表明,该多克隆抗体可与由GSIV感染引起细胞病变的EPC细胞(GICB)发生特异性的结合。研究为建立GSIV免疫诊断方法以及为研究GSIV MCP基因编码蛋白的功能奠定了前期基础。     

车前草花叶病毒衣壳蛋白的原核表达和多克隆抗体制备

为制备车前草花叶病毒(Plantago asiatica mosaic virus,PlAMV)衣壳蛋白(capsid protein,CP)及其多克隆抗体,采用RT-PCR方法从甘肃省种植的切花百合上克隆了PlAMV cp基因的部分序列,连接表达载体pET-28a(+),转化Escherichia coli BL21...     

魔芋花叶病毒衣壳蛋白的原核表达和多克隆抗体制备

采用小RNA测序技术对甘肃省榆中县疑似感染病毒病的当归[(Angelica sinensis(Oliv.)Diels]样品进行测序鉴定,发现样品中含有魔芋花叶病毒(Konjac mosaic virus,KoMV),通过反转录PCR(RT-PCR)扩增KoMV衣壳蛋白(capsid protein, CP)的cp基因,克隆的KoMV cp基因连接原核表达载体pET-28a(+),导入E.coli Rosetta^TM(DE3)诱导表达蛋白,在Ni-NTA重力柱层析作用下纯化CP融合蛋白,并以此作为抗原免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体。序列分析表明：KoMV cp基因片段大小为840 bp,编码280个氨基酸的外壳蛋白;与GenBank已注册同源性较高的KoMV分离物相比,核苷酸序列相似性为85.58%～99.41%,氨基酸序列相似性为89.32%～99.29%;KoMV的病毒种群分布存在明显的区域性和寄主差异。SDS-PAGE显示,不同温度诱导下KoMV CP融合蛋白在E.coli Rosetta^TM(DE3)中均以包涵体的形式大量表达,融合蛋...     

创伤弧菌外膜蛋白OmpU的基因克隆与表达

创伤弧菌是导致鳗鲡产生体表溃疡死亡的重要致病菌。本研究克隆了创伤弧菌FJ03-X2株外膜蛋白基因(ompU),构建含该基因的原核表达载体,命名为pET-32a-ompU,将其转化到大肠杆菌E.coli中进行融合表达。37℃,0.5mmol.L-1的IPTG诱导4h,融合蛋白rompU以可溶形式表达,采用Ni-NTA亲和层析法纯化融合蛋白,SDS-PAGE显示纯化后的rompU为与预期大小一致的单一条带。将纯化的rompU免疫SD级大鼠,ELISA检测收获的多克隆抗体血清效价,并通过Western-blot证实该OmpU多克隆抗体可以识别创伤弧菌FJ03-X2株中的天然外膜蛋白OmpU。     

ShSAP1的原核表达及多克隆抗体的制备

将ShSAP1的阅读框连接到原核表达载体p ET32a(+)中,构建成ShSAP1原核表达载体PET-ShSAP1,然后将其转入宿主菌BL21,经IPTG诱导后,宿主菌表达出与预期分子量大小相符的35 ku的融合蛋白;将纯化后的融合蛋白免疫家兔,获得了ShSAP1的特异性抗血清;以融合蛋白作抗原,用间接ELISA法测定其抗血清效价为1∶25 000。     

水稻SDG723蛋白C末端原核表达及多克隆抗体制备

水稻SDG723蛋白含有植物组蛋白甲基转移酶保守的SET结构域。选取其抗原决定簇较密集的C末端进行原核表达,通过构建原核表达载体pET28a-723C,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达融合蛋白后进行纯化。以纯化的融合蛋白为抗原免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。Western-blot分析表明,制备的多克隆抗体能有效地检测抗原的表达,为进一步深入研究SDG723蛋白的功能奠定了基础。     

水稻SDG711蛋白C末端原核表达及多克隆抗体制备

[目的]对水稻SDG711蛋白C末端进行原核表达,并制备其多克隆抗体。[方法]选取水稻SDG711蛋白抗原决定簇较密集的C末端进行原核表达,通过构建原核表达载体pET28a-711C,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达融合蛋白后进行纯化,再以纯化的融合蛋白为抗原免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体,并对其进行Western-blot分析。[结果]试验制备的多克隆抗体能有效地检测抗原的表达。[结论]该研究为进一步深入研究SDG711蛋白的功能奠定了基础。     

拟南芥乙烯应答基因HLS1的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。【方法】构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。【结果】成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。【结论】成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。     

溶葡萄球菌素的原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】制备溶葡萄球菌素(lys)的多克隆抗体,为检测其在转基因细胞、胚胎及转基因动物中的表达奠定基础。【方法】以含有lys基因成熟肽序列的PEPB质粒为模板,经PCR扩增,构建pET28a-Ly原核表达载体,并以其转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达并纯化蛋白后,常规免疫家兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体的特异性。【结果】构建的原核表达载体pET28a-Ly经IPTG诱导6h后即可高效表达lys蛋白,蛋白经纯化后,其质量浓度可达到3.05mg/mL;抗体经ELISA检测,效价为1∶27 000,West-ern blot检测结果表明,抗体的特异性较好。【结论】成功构建了lys原核表达载体,所制备的lys多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。     

团头鲂转录因子Oct4的原核表达和多克隆抗体的制备

为进一步分析鱼类干细胞多能性转录因子Oct4的功能,将团头鲂(Megalobrama amblycephala)Oct4进行原核表达并制备了兔抗Oct4多克隆抗体。采用RT-PCR方法从团头鲂卵巢中扩增Oct4基因的部分编码片段,插入载体pET32a中构建重组原核表达载体pET32a-MaOct4;将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导、Ni~(2+)亲和柱层析纯化获得分子量约49 ku的可溶性重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰兔制备抗体,通过ELISA法测定其效价,Western blot鉴定其特异性。实验结果表明:该重组载体在37℃,0.5 mmol/L IPTG条件下诱导4 h可获得Ma-Oct4重组蛋白的高效表达;制备的团头鲂Oct4多克隆抗体能够分别与纯化的Oct4蛋白、原核表达的Oct4蛋白、团头鲂胚胎中的内源Oct4蛋白以及HepG2细胞中过表达的Ma-Oct4:DsRed融合蛋白特异结合。为后续深入研究团头鲂Oct4在干细胞多能性调控中的作用提供了有效的分子工具。     

梅花鹿Thymosin beta 10基因的原核表达、活性鉴定和多克隆抗体制备

为研究梅花鹿Thymosin beta 10基因(Tβ10)在鹿茸快速生长过程中的作用,利用Gateway技术构建梅花鹿Tβ10基因的原核表达载体—pDEST17-Tβ10并诱导表达,对融合蛋白进行功能检测及多克隆抗体制备。结果表明:1)获得了190bp Tβ10基因开放阅读框序列,并获得重组表达载体pDEST17-Tβ10。2)pDEST17-Tβ10在宿主BL21-SI中诱导表达条件为0.3mol/L NaCL诱导2h,获得产物的最终浓度为0.50mg/mL。3)制备的Tβ10蛋白多克隆抗体血清效价在105之上,该抗体可以特异性结合天然和原核表达的Tβ10蛋白。4)离体检测发现,Tβ10融合蛋白一方面可以促进人脐静脉内皮细胞增殖,另一方面可以抑制鹿茸前成软骨区细胞的增殖。综上所述,本研究获得了具有生物活性的Tβ10融合蛋白,并制备了高度特异性的梅花鹿Tβ10蛋白多克隆抗体,为深入研究Tβ10基因的生物学功能奠定了基础。     

拟南芥叶绿体发育必需蛋白PAC的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】将拟南芥叶绿体发育必需蛋白PAC进行大肠杆菌原核表达和纯化,并免疫家兔,获得针对PAC蛋白的多克隆特异性抗体,为进一步研究PAC蛋白在叶绿体发育中的功能提供保证。【方法】将编码拟南芥PAC蛋白的cDNA克隆至原核表达载体pET-28a中,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导后,对诱导产生的PAC蛋白进行镍柱亲和纯化和SDS-PAGE割胶纯化,并将纯化的PAC蛋白通过皮下注射免疫家兔,利用分离得到的抗血清,针对拟南芥野生型、PAC敲除突变系pac-1和PAC过表达系PACOE的总蛋白进行免疫印迹检测。【结果】成功构建了拟南芥基因PAC的原核表达载体pET-28a-PAC,在37℃、1mmol/L IPTG诱导4h的大肠杆菌细胞中,可检测到分子质量为38.9ku的重组蛋白,其大部分以可溶形式存在。用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得PAC抗血清,该抗血清能够有效地检测出1ng原核表达的PAC重组蛋白,并在植物样品中检测出1条分子质量约为35ku的条带。【结论】成功制备了PAC蛋白的多克隆抗体,可用于植物中PAC蛋白含量的检测。     

鲤春病毒血症病毒基质蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制备

根据鲤春病毒血症病毒(SVCV)基因组序列(GenBank:NC_002803),人工合成M基因开放阅读框序列,克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化工程菌株BL21 (DE3),在0.1 mmol·L-1 IPTG、37℃下诱导5h,获得高效表达的M蛋白,但其主要以包涵体的形式存在,经超声破碎、包涵体纯化后,再...     

巨型艾美耳球虫IMP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

免疫映射蛋白1(IMP1)是一种从巨型艾美耳球虫中发现的蛋白,具有良好的免疫原性和免疫保护性.本试验通过Em IMP1基因的克隆、原核表达以及多克隆抗体的制备,为后续深入研究该蛋白的生物学及免疫学功能奠定基础.首先,从未孢子化的巨型艾美耳球虫新疆株卵囊中提取总RNA,反转录合成c DNA,PCR扩增Em IMP1基因片段.其次,将Em IMP1基因扩增片段连接到原核表达载体p ET-28a构建表达质粒p ET-28a-Em IMP1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株并进行表达;将纯化后的蛋白与等量弗氏佐剂乳化后皮下注射至2只新西兰大白兔体内,每隔2周免疫一次,一共免疫4次后取得的兔血清即为多克隆抗体.最后,用所获得的多克隆抗体,对纯化后的Em IMP1进行免疫印迹试验鉴定,用酶联免疫吸附测定法检测多克隆抗体的效价.结果表明,克隆出的Em IMP1基因的全长为1 140 bp,诱导出的蛋白大小为70 ku,且该蛋白在上清液和包涵体中均有存在.免疫印迹试验检测结果显示,用上述方法制备的多克隆抗体具有良好的特异性,酶联免疫吸附测定法检测结果表明该多克隆抗体具有高效价.因此,可通过原核表达蛋白Em IMP1免疫兔子制备特异性好且效价高的多克隆抗体.     

鳗鲡疱疹病毒ORF51基因的原核表达及多克隆抗体的制备

将鳗鲡疱疹病毒(AngHV)福建株(AngHV-FJ)ORF51基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建表达质粒pGEX-4T-2-ORF51,将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导后,收集表达菌体,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹试验验证,结果表明,获得了高效表达的AngHV-FJ ORF51融合蛋白.经割胶回收纯化,获得高纯度的融合表达蛋白.用纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的兔抗ORF51多克隆抗体.这为进一步研究ORF51蛋白的结构和功能及开展AngHV病的防治研究提供了重要的研究基础.