禽多杀性巴氏杆菌不同培养方法制备的种子液对高密度发酵培养菌数的影响

本试验用扁瓶固体培养法、摇床液体培养法和10L发酵罐培养法制备禽多杀性巴氏杆菌种子液,采用细菌比浊法和活菌计数法,计算高密度发酵菌液浓度,比较3种方法制备的种子液对禽多杀性巴氏杆菌抗原生产的影响。经过3批次试验,扁瓶固体培养法制备的种子液经高密度发酵培养后测得的活菌数为1.56×1010~1.65×1010 CFU/mL,比浊计数为2.10×1010~2.59×1010 CFU/mL;而摇床液体培养法制备的种子液经高密度发酵培养后测得的活菌数为1.54×1010~1.74×1010 CFU/mL,比浊计数为2.10×1010~2.45×1010 CFU/mL。发酵罐培养制备的禽多杀性巴氏杆菌种子接种200L发酵罐进行高密度发酵培养后测得的活菌数可达1.85×1010~2.05×1010 CFU/mL,比浊计数为2.45×1010~2.80×1010 CFU/mL。结果表明,10L发酵罐培养制备的种子液优于扁瓶固体培养法和摇床液体培养法制备的种子液,而后两者无明显差别;从3批次平均值看,前者比后两者活菌计数结果提高约21.60%,比浊计数结果提高约15.52%。说明采用10L发酵罐培养制备的禽多杀性巴氏杆菌种子进行高密度发酵培养可显著提高菌液浓度,增加单位抗原含量(P0.01)。     

禽霍乱荚膜疫苗对SPF鸡免疫保护效果的研究

为了研究粗提的禽霍乱荚膜抗原对SPF鸡的免疫保护效果,试验选取了禽多杀性巴氏杆菌C48-1株,制备了粗提的荚膜抗原,将荚膜抗原和铝胶生理盐水按4∶1的比例混合,制备了两批疫苗(批号分别为2017001、2017002),在制备过程中检验了菌液的活菌数及荚膜抗原的蛋白质、SDS含量,并进行无菌检验。将制备的两批疫苗分别免疫21日龄SPF鸡,并于免疫后第21天用C48-1株进行攻菌,攻菌后连续观察7 d,每天记录鸡只死亡及发病情况。结果表明:经检验,两批疫苗蛋白质含量均在2. 0 mg/m L以上,SDS含量均为0. 03%,符合疫苗的质量标准。两批疫苗对42日龄SPF鸡的保护率为70%～80%。说明该疫苗对预防禽霍乱具有较好的效果。     

限铁培养禽巴氏杆菌制备灭活疫苗及其免疫效果分析

为控制禽多杀性巴氏杆菌病的流行,通过对禽巴氏杆菌标准菌种A群NCTC1502进行限铁培养,制备稳定性和安全性较好的甲醛油乳剂灭活疫苗,免疫江汉鸡,监测其抗体消长规律和免疫效力。结果:禽巴氏杆菌限铁培养制备的灭活疫苗稳定性和安全性好,对江汉鸡可产生高效的免疫保护力,免疫保护率达100%,显著高于非限铁培养制备的灭活疫苗(80%)。试验表明利用禽巴氏杆菌标准菌种进行限铁培养所制备的疫苗可有效防控禽霍乱。     

牛源A型多杀性巴氏杆菌hyaD基因缺失株的构建及其在小鼠上的交叉保护性分析

hyaD为A型多杀性巴氏杆菌荚膜多糖合成相关基因,为探讨该基因对多杀性巴氏杆菌毒力及其免疫保护特性的影响,本研究利用同源重组方法,构建了牛源A型多杀性巴氏杆菌CQ2株（PmCQ2）的hyaD基因缺失株（ΔhyaD）。结果发现,与野生株相比,ΔhyaD的荚膜产生量及其感染后在脏器中的细菌定殖量均显著下降,其毒力显著降低。细胞试验发现,ΔhyaD更易黏附于巨噬细胞,被吞噬数量显著多于野生株,致使巨噬细胞相关炎性因子表达显著上调。hyaD基因的缺失,可调控与荚膜合成、LPS合成转运、铁转运等相关的基因表达显著下调,促使相关保护性抗原基因表达显著上调。以制备的PmCQ2株和ΔhyaD株灭活苗免疫小鼠（加强免疫1次）,免疫后第21天分别采用同源和异源多杀性巴氏杆菌攻毒,ΔhyaD株免疫小鼠肺组织感染后24 h无明显或轻微病理损伤,对牛源A型、B型和F型多杀性巴氏杆菌的免疫保护率分别为100%、100%和80%,对兔源、猪源和禽源A型多杀性巴氏杆菌的免疫保护率分别为90%、100%、100%;而野生株PmCQ2除对牛源A型多杀性巴氏杆菌的保护率在80%以上外,对牛源B型和F型及兔、猪、禽源A型多杀性巴氏杆菌均无明显交叉保护作用。研究结果表明,hyaD基因可通过调控荚膜产生及毒力相关因子表达影响菌株毒力;hyaD基因缺失可调控相关交叉保护性抗原表达,赋予菌株交叉免疫保护特性。该研究为多杀性巴氏杆菌通用型疫苗的研发提供了参考。     

禽霍乱与大肠杆菌病多价蜂胶二联灭活疫苗的研究

为研制绿色环保型的禽霍乱与大肠杆菌病多价二联灭活疫苗,本研究以禽多杀性巴氏杆菌强毒株G48-1、G48-2和禽致病性大肠杆菌常见血清型01/0154、02/086、078、018、08/093等为制苗菌株,分别以改良马丁琼脂和马丁肉汤进行固体表面培养和高密度发酵培养制备抗原,将灭活的抗原铺以具有广谱生物学活性的天然物质-蜂胶为免疫增强剂,已拥有完全自主知识产权的纳米蜂胶疫苗制造工艺技术平台制备禽霍乱与大肠杆菌病多价蜂胶二联灭活疫苗.试验结果表明,疫苗安全可靠,无明显的干扰现象,免疫后5～7 d产生坚强保护力,对禽霍乱和鸡大肠杆菌病的近期保护率均为100%.以实验动物小鼠代替本动物进行二联疫苗效检取得成功,本效检方法可缩短检验期限7 d,降低检验成本,具有更敏感、更特异、更客观、更简便等特点.禽霍乱采用攻毒法,大肠杆菌采用改良微量凝集试验测定抗体效价法测定禽-大二联疫苗的免疫期与保存期.结果表明,该疫苗的免疫期为6个月以上,-10℃保存期为18个月;4℃～8℃为12个月;15℃～30℃为6个月.田间免疫试验表明,疫苗安全可靠,现场应用已逾2亿羽份,效果良好.     

兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病(A)型三联灭活疫苗研制

对 5批兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病三联灭活疫苗进行了动物试验 ,结果表明该疫苗安全有效。近期效检对兔病毒性出血症的保护率为 1 0 0 % ,对兔多杀性巴氏杆菌病保护率为 92 % ,对产气荚膜梭菌病 (A)型保护率为 88%。在免疫期试验中 ,免疫 6个月后 ,对兔病毒性出血症保护率为 1 0 0 % ,对多杀性巴氏杆菌病的保护率为 79% ,对产气荚膜梭菌病 (A)型的保护率为 88%。在保存期试验中 ,4～ 8℃保存 1年仍有效。     

脂质体-禽巴氏杆菌荚膜抗原的免疫研究

将禽巴氏杆菌荚膜粗提物经SephadexG—200分子筛凝胶过滤层析,获得纯化荚膜抗原;然后用反相蒸发法制备脂质体-荚膜抗原(A组),并以单纯荚膜抗原(B组)、禽霍乱“731”菌苗(C组)作对照,进行免疫试验,以酶标单克隆抗体间接ELISA,分别检测IgM和IgG的效价.结果,免疫后3个组的IgM效价相差都不显著(P>0.05),A组的IgG效价明显增高,与其他两组差异非常显著(P<0.01).3个组的IgM、IgG消长规律一致,IgM于免疫后7d开始上升,峰值在14d,其后下降迅速,第8周后降至免疫前水平,IgG于免疫后14d开始明显上升,峰值在28d,其后缓慢下降.保护率,A、B、C组分别为67％、33％、33％.结果表明,脂质体对禽巴氏杆菌荚膜抗原具有明显的佐剂作用.     

禽多杀性巴氏杆菌强毒株与弱毒株制备的蜂胶灭活疫苗免疫原性的比较试验

用禽多杀性巴氏杆菌强毒株(C48-1)与弱毒株(G190E40和B26-T1200)制备的蜂胶灭活疫苗的免疫原性对比试验结果表明,强毒株C48-1制备的禽霍乱蜂胶灭活疫苗的免疫效果显著高于弱毒株G190E40和B26-T1200,近期保护率相差20%～40%,3个月后相差40%～80%.强毒株C48-1的免疫原性显著高于弱毒株G190E40和B26-T1200,说明禽多杀性巴氏杆菌荚膜上的毒力蛋白可能具有免疫原性.     

1株猪源病原菌的分离鉴定及部分生物学特性研究

通过对一起病死猪的实验室诊断 ,从病猪心血、脏器中分离到了 1株对小白鼠和家兔都具有较强致病性的细菌。经显微镜观察、培养特性观察、生化特征鉴定 ,此菌为多杀性巴氏杆菌 ,但此菌与其他多杀性巴氏杆菌不同的是它能利用水杨素、鼠李糖、阿拉伯糖。 O抗原琼脂扩散试验鉴定此菌菌体抗原为 O1型 ;Carter间接血凝试验法检验荚膜抗原类型此菌为 A型。体外滤纸扩散法检验此巴氏杆菌对药物敏感性 ,试验表明该菌耐青霉素、土霉素、四环素、磺胺嘧啶、痢特灵、阿米卡星、头孢唑啉 ;但对庆大霉素、卡那霉素、盐酸环丙沙星、氟哌酸敏感 ,对氨苄西林 ,链霉素中度敏感。自制灭活苗进行免疫原性实验检测 ,本分离菌疫苗对小白鼠和家兔保护率约为 70 % ,而市售巴氏杆菌疫苗对小白鼠和家兔保护率约为 3 0 %～ 40 %。     

禽霍乱免疫研究动态

一、多杀性巴氏杆菌血清型对免疫的指导意义由动物体分离到的多杀性巴氏杆菌(PM)具有复杂的抗原结构,根据其荚膜抗原和菌体抗原的不同分为不同的荚膜型和组.禽PM的免疫原性主要取决于荚膜,但菌体抗原在免疫学的重要地位也不可忽视,现已知禽PM的荚膜型为A型,这种具有抗原活性的荚膜性质在新分离的、毒力强的菌种中可得到充分发育,经人工培养继代后易于丧失。     

支原体PCR检测方法的建立和应用

依据GenBank中登录的常见细胞污染支原体16S rRNA基因序列,选择高度保守的区域设计引物,建立了一种快速灵敏的支原体PCR检测方法.该方法可以特异性检测出6种支原体,并能敏感的检测到10个拷贝数的目的基因.采用建立的PCR方法和传统的培养法对23个不同样品(细胞、血清、疫苗成品、半成品)进行检测,符合度100％.该方法的建立可大大缩短疫苗生产过程中支原体检验所需时间.     

两步法培养沼泽红假单胞菌的研究

概述了沼泽红假单胞菌两步培养法。该培养法具有生产周期短、不易污染、菌体得率高等优点,为沼泽红假单胞菌的工业化生产探索了一条新的发展道路。     

不同外源激素及培养方式对甘草试管苗生长的影响

以MS为基本培养基,采用固体,液体和固液双层3种不同培养方式研究不同外源激素对甘草试管苗生长的影响,以建立优化的甘草试管快繁体系。试验结果表明,固体培养是甘草试管苗快繁的最佳培养方式,试管苗全长、根长、株重、根重、根直径以及叶片数均明显优于液体及固液双层培养方式。不同外源激素对试管苗具有显著的影响,甘草试管苗在1.0 mg/L IBA外源激素下的各项生长指标明显强于1.0 mg/L IAA,并在MS+1.0 mg/L IBA+13.5 mg/L KH2PO4培养基中表现最好。而13.5mg/L KH2PO4更有利于诱导试管苗快速生根。     

苜蓿假盘菌分离方法及培养性状比较研究

采用离心稀释法和叶面弹射法分离苜蓿假盘菌,结果表明离心稀释法能够得到纯化的菌落,而叶面弹射法能弹射出单个或成对的孢子,但无法获得菌落。南疆菌株在4种培养基上的培养性状与北疆菌株存在显著差异,尤其体现在子囊盘大小指标上,南疆菌株为147.22～199.34μm,而北疆菌株为96.29～14.74μm,在形成菌落所需的时间、菌落颜色等方面也存在一定差异。研究表明V-8苜蓿汁培养基最有利于菌落生长和孢子成熟。     

哺乳动物乳腺上皮细胞体外培养研究进展

由于具有合成和分泌乳汁的特殊生理功能,哺乳动物乳腺上皮细胞是进行乳腺生物反应器研究的重要细胞模型。用乳腺上皮细胞建立的模型,能真实反映哺乳动物乳腺生长发育及泌乳的各项生物学机制,验证乳腺特异性表达载体的构建是否合理有效,涉及到细胞生物学、发育生物学、内分泌学、生物化学与分子生物学等多个领域,对于乳腺生物反应器、乳蛋白基因表达的研究有重要意义。作者主要从培养方法方面介绍了近年来哺乳动物乳腺上皮细胞体外培养方法。     

Establishing a reproducible method for the culture of primary equine corneal cells

Objective  To establish a reproducible method for the culture of primary equine corneal epithelial cells, keratocytes, and endothelial cells and to describe each cell's morphologic characteristics, immunocytochemical staining properties and conditions required for cryopreservation.
Procedures  Corneas from eight horses recently euthanized for reasons unrelated to this study were collected aseptically and enzymatically separated into three individual layers for cell isolation. The cells were plated, grown in culture, and continued for several passages. Each cell type was characterized by morphology and immunocytochemical staining.
Results  All three equine corneal cell types were successfully grown in culture. Cultured corneal endothelial cells were large, hexagonal cells with a moderate growth rate. Keratocytes were small, spindloid cells that grew rapidly. Epithelial cells had heterogenous morphology and grew slowly. The endothelial cells and keratocytes stained positive for vimentin and were morphologically distinguishable from one another. The epithelial cells stained positive for cytokeratin. Keratocytes and endothelial cells were able to be cryopreserved and recovered. The cryopreserved cells maintained their morphological and immunocytochemical features after cryopreservation and recovery.
Discussion  This work establishes reproducible methods for isolation and culture of equine corneal keratocytes and endothelial cells. Cell morphology and cytoskeletal element expression for equine corneal epithelial cells, keratocytes, and endothelial cells are also described. This has not previously been reported for equine corneal cells. This report also demonstrates the ability to preserve equine keratocytes and endothelial cells for extended periods of time and utilize them long after the primary-cell collection, a feature that has not been reported for veterinary corneal cell culture.     

Detection ofCampylobacter in 100 commercial flocks–Evaluation of plating media and filtration method

Campylobacter is a natural member of the gut microflora in many commercial broilers and as such can become a contaminant on edible surfaces during processing. Culturing gut contents or feces can be a means to determine flock status prior to live-haul. The wide variety of non-Campylobacter background bacteria in these complex samples contaminates growth media and can make it very difficult to isolateCampylobacter. Over the course of 17 months, we cultured cecal contents from 100 different broiler flocks. For the last 50 flocks, we tested 3 selective plating media with and without the additional selection of a 0.45-μm filter for detection ofCampylobacter from cecal contents. Furthermore, from the last 50 flocks we also collected and cultured carcass rinse samples. Growth media tested included: Campy–Cefex Agar, Campy–Line Agar, and RF-Campylobacter jejuni/coli agar. About half (52%) of the 100 tested flocks were positive forCampylobacter; positive flocks were detected during each month of the year. Overall, theCampylobacter status of cecal contents from one carcass was predictive of the status of a carcass rinse from the same flock. Placing a complex sample such as cecal contents onto a 0.45-μm filter laid on top of the plating medium improved the detection ofCampylobacter by eliminating non-Campylobacter background colonies. All media allowed for detection ofCampylobacter from less complex carcass rinse samples without filtering. However, Campy–Cefex agar had higher numbers of competing bacterial colonies than did Campy–Line agar or RF-Campylobacter jejuni/coli agar.     

MTT比色法在传染性法氏囊病病毒分离中的应用

应用MTT比色法检测了病料中传染性法氏囊病病毒(IBDV)在细胞培养物中的增殖情况，并对病料中加入法氏囊提取液、鸡胚浸出液2种成分对病毒增殖的影响作了比较。结果表明，MTT比色法简便、快速、可靠，能很好地反映病毒在细胞培养物中的增殖情况。     

不同采集方法对猪卵母细胞的采集效率和成熟率的影响

本研究旨在开发出一种对COCs损伤小且采集效率和卵母细胞成熟率高的卵母细胞采集方法.从屠宰场采集来的卵巢运回实验室后随机分为3组,分别用抽吸法、解剖法和刀切过滤法3种方法采集COCs,然后进行体外成熟培养,通过对COCs采集效率、COCs完整性及卵母细胞体外成熟率的比较,研究解剖法、刀切过滤法和抽吸法3种采集方法对猪卵母细胞的采集效率和成熟率的影响.结果表明:每个卵巢采集COCs个数,刀切过滤法显著高于解剖法和抽吸法(P＜0.05),而解剖法仅为1.55个,显著低于抽吸法(P＜0.05);采集效率抽吸法最佳,采集和挑选单个COCs的时间显著低于解剖法和刀切过滤法(P＜0.05),刀切过滤法次之,但显著低于解剖法(P＜0.05);A、B级COCs比例,解剖法高达99.23%,显著高于其他2种方法(P＜0.05),刀切过滤法与抽吸法差异不显著(P＞0.05);卵母细胞的成熟率,解剖法和刀切过滤法都达到80%,二者间差异不显著(P＞0.05),但显著高于抽吸法(P＜0.05);100个成熟卵母细胞所需的卵巢数量,刀切过滤法最少,仅为17.4个,而解剖法和抽吸法分别高达80.6和90.3个;需要的总采集时间(采集和挑选的时间),刀切过滤法最低,仅为126.6 min,而解剖法最高,为758.9min.综上所述,与抽吸法和解剖法相比,刀切过滤法是一种高效、快速的卵母细胞采集方法.     

札幌病毒研究进展

札幌病毒(Sapovirus)可感染人和动物,引起急性病毒性胃肠炎.随着分子生物学、病毒细胞培养和动物模型研究方面的进展,不同类群札幌病毒全基因组测序完成、病毒体外增殖和衣壳蛋白体外表达,从而对该病毒的特性有了一些新的认识.本文从札幌病毒的基因组结构与功能、流行病学、细胞培养、检测方法和疫苗发展5个方面人手,系统介绍了该病毒国内外的研究现状以及存在的问题,其中流行病学及其检测技术的研究成为研究的热点.本文还对札幌病毒分子进化、疫苗研制和病毒的传播等提出了新的观点.