猪肺巨噬细胞FcγR Ⅲ受体基因的克隆与序列分析

为研究猪肺巨噬细胞FcγRⅢ的生物学功能,本研究应用RT-PCR技术从猪肺巨噬细胞总RNA中克隆出猪FcγRⅢ的cDNA序列,并对其进行了分析。结果表明,克隆到的序列长820 bp,包含有1个771 bp完整开放阅读框(ORF),与Gen-Bank中登录的猪FcγRⅢ序列(AF237453)的核苷酸同源性为99.9%;与人、牛、马、绵羊、猕猴、狗、猫、小鼠氨基酸同源性分别为61.6%、62.9%、55.3%、62.2%、63.0%、59.0%、61.8%和53.2%;蛋白质分子结构预测结果表明,该分子由信号肽(20个氨基酸)、胞外区(185个氨基酸)、跨膜区(23个氨基酸)和胞内区(28个氨基酸)组成,在胞外区存在2个Ig样结构域。猪肺巨噬细胞FcγRⅢ基因的成功克隆,为进一步研究其结构与功能奠定基础。     

绵羊IFN-γ基因的克隆与序列分析

将无菌采集的绵羊(湖羊)脾脏淋巴细胞进行体外培养,利用刀豆蛋白(ConA)刺激24 h后提取总RNA,采用RT-PCR扩增绵羊IFNγ-基因,并将其克隆到pMD18-T载体中,经PCR和双酶切鉴定后进行测序。测序结果表明,扩增的cDNA全长554 bp,包含501 bp开放阅读框,编码166个氨基酸,分子质量约为18.4 ku。克隆的绵羊IFNγ-基因与GenBank上已公布的人、牛、山羊、马鹿、马、骆驼、猪、狗、猫和鸡的IFNγ-核苷酸序列进行比较,其同源性分别为75.2%,96.6%,99.0%,95.8%,83.0%,88.8%,86.6%,82.4%,53.9%和32.9%,与其他品种绵羊的核苷酸同源性为100%;氨基酸序列同源性分别为61.7%,94.6%,98.2%,92.2%,77.8%,86.8%,77.8%,76.0%,39.5%和6.7%,这为进一步研究绵羊IFNγ-基因的表达、生物学活性和应用奠定了一定基础。     

鸡大肠杆菌ESBLs基因的克隆及序列分析

分离纯化来自河南不同地区的鸡大肠杆菌菌株,按照NCCLS标准和双纸片协同试验法进行ESBLs基因表型鉴定。然后根据GenBank已发表的序列设计两对引物,选择阳性表型菌株并提取总DNA,进行PCR、克隆、阳性质粒测序,将测定的序列拼接后和参考菌株ESBLs基因序列比较分析。结果显示,15株大肠杆菌菌株有3株菌株含有β-内酰胺酶,为阳性菌株,这3株与2个参考株核苷酸序列同源性为98.9%~99.7%,氨基酸序列同源性为98.1%~99.2%。3株大肠杆菌阳性菌株序列ESBLs基因型均为TEM型,核苷酸有15个位点发生突变,其中6个位点突变引起氨基酸变异。     

广西水牛γ干扰素基因的克隆与序列分析

提取经刀豆素(ConA)诱导培养的水牛外周血淋巴细胞的总RNA,采用RT-PCR技术扩增水牛IFN-γ基因,将其克隆到pMD18-T载体上,并进行测序.序列分析结果表明,获得的IFN-γ基因全长为544个碱基,其开放阅读框(ORF)为501个碱基,编码166个氨基酸.与GenBank上已发表的水牛、乳牛的IFN-γ基因进行同源性比较,其核苷酸同源性均高于97%,氨基酸同源性均高于96%;与其他种类动物的IFN-γ的同源性相比,随其亲缘关系的远近有所降低.     

猪IFN-γ基因的克隆与序列分析

猪IFN-γ具有强烈的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用，作为生物药荆和疫苗佐剂具有广阔的应用前景。通过对猪PBMC刺激诱导，提取总RNA，然后采用RT—PCR技术成功克隆了猪IFN-γ基因。序列分析表明，克隆到的基因序列与NCBI GenBank上登载的猪IFN-γ基因序列完全一致。该基因的成功克隆为IFN-γ的进一步研究和开发奠定了基础。     

长白猪γ-干扰素基因的克隆与序列分析

将长白猪外周血淋巴细胞进行体外培养,在ConA的刺激下培养8h～24h后,提取培养的淋巴细胞的总RNA,应用RTPCR技术扩增淋巴细胞γ干扰素cDNA,并将其克隆到pGEMT载体上,进行测序。序列测定结果表明,克隆获得的IFNγ基因全长为534个碱基,ORF为501个碱基,编码166个氨基酸,分子质量为19.4ku。此基因与我国藏猪、成华猪以及GenBank上发表的猪IFNγ基因的核苷酸同源性均为100%,并且在氨基酸水平上也完全一致。说明几种我国地方猪IFNγ在基因的核苷酸以及蛋白的氨基酸水平上不存在差异和突变,同时也证实了长白猪干扰素γ基因的正确、完整克隆。     

延边白鹅γ干扰素基因的克隆及序列分析

为了研究延边白鹅γ干扰素的生物学特性,本试验采用刀豆素（ConA）刺激延边白鹅外周血淋巴细胞,提取总RNA,经RT-PCR方法扩增鹅γ干扰素基因,将其克隆到pMD18-T载体中,进行序列和序列分析。结果显示,延边白鹅γ干扰素基因全长495bp,经序列比对发现,克隆到的延边γ白鹅干扰素基因（JX966250）与哈尔滨鹅γ干扰素基因（AY524421）核苷酸序列同源性高达100%,与广东狮头鹅（EU030377）核苷酸序列同源性达99.6%,而三者的氨基酸同源性为100%。本试验成功克隆到延边白鹅γ干扰素基因,为进一步研究鹅干扰素的分子生物学特性和抗病毒作用机理奠定了基础。     

绵羊肝片吸虫谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆与序列分析

本研究扩增肝片吸虫(Fasciola hepatica,Fh)谷胱甘肽硫转移酶(GST)基因,并进行同源性分析。根据GenBank发表的部分Fh GST基因序列设计并合成一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增出Fh GST基因完整的开放阅读框(open reading frame,ORF),测定序列,使用分子生物学软件进行同源性分析。获得Fh GST基因全长682 bp,编码218个氨基酸,与澳大利亚分离的肝片吸虫GST同源性较高,与大片吸虫和卫氏并殖吸虫的GST也有较高的同源性。不同虫株GST基因具有较高的同源性,因此Fh GST蛋白不适合用作诊断抗原,但由于其存在交叉反应,GST基因作为分子疫苗的候选基因具有重要意义。肝片吸虫GST基因的克隆,为进一步研究GST蛋白的功能和作用奠定了基础。     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

GM-CSF在机体免疫系统中发挥重要的免疫调节作用.用PHA与LPS体外联合刺激猪外周血单个核细胞,采用RT-PCR技术成功克隆了猪GM-CSF基因.序列分析表明,该序列与NCBI/GenBank上登载的序列有两个碱基不同;将猪与人、牛、羊、狗、猫、鼠等动物的GM-CSF基因序列相比较,其一致性分别为82.1%、85%、88.1%、82.8%、83.7%、70.5%,在氨基酸水平上一致性为70.3%、70.9%、78.1%、70.3%、71.9%、54.4%.然后利用生物信息学和分子生物学软件,对猪GM-CSF的结构进行预测,结果表明,猪GM-CSF为一结构松散的球状蛋白分子.猪GM-CSF基因的成功克隆及其编码蛋白结构的预测为开发高效、低毒且性质稳定的猪GM-CSF产品奠定了基础.     

民猪IFN-γ基因的克隆及序列分析

为了获得民猪干扰素-γ(IFN-γ)基因,并对该基因进行序列分析,试验采用RT-PCR技术,根据猪IFN-γ基因设计1对引物,从刀豆素A(ConA)活化的民猪外周血淋巴细胞中提取总RNA,获得了长度为502 bp的片段,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。结果表明:民猪IFN-γcDNA长度为502 bp,IFN-γ基因的开放阅读框大小为501 bp,编码166个氨基酸,含有2个潜在N-糖基化位点;民猪IFN-γ基因与藏猪、贵州白香猪、成华猪和梅山猪等的同源性为100%。     

牛锌指蛋白312基因的克隆及序列分析

本试验采用RT-PCR和测序相结合的方法克隆了牛锌指蛋白312(ZnF312)基因,得到了1812 bp的cDNA序列,包括63 bp的5'非翻译区(1-63)、1377 bp的CDS区(64-1440)和372 bp的3'非翻译区(1441-1812)。采用生物信息学方法分析了该基因及其所编码的蛋白质的结构和功能,结果表明,ZnF312基因位于22号染色体上,编码458个氨基酸,分子质量为48.82 ku,等电点为9.419,含有6个锌指结构域(ZnF_C2H2),与人、黑猩猩、小鼠、大鼠和狗的ZnF312蛋白序列的相似性分别为97%、97%、94%、94%和95%,ZnF312蛋白亚细胞定位于细胞核的概率为95.7%,定位于线粒体的概率为4.3%。结合ZnF_C2H2在真核生物中的重要作用,推测牛ZnF312蛋白可能识别相应的靶基因,在生长发育或疾病控制中起着重要的作用。     

牛γ-干扰素基因的克隆及序列分析

根据GenBank中已公布的牛γ-干扰素(BovIFN-γ)基因序列设计引物,应用一步法逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,以从牛外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,扩增出γ-干扰素成熟肽基因片断,并对其进行了克隆、测序及序列分析.结果表明,试验所设计引物可以成功用于扩增牛γ-干扰素成熟肽基因片段,所扩增序列与GenBank中已有序列同源性达99.77%.     

山羊痘病毒疫苗株γ-IFNR基因的克隆与序列分析

为了获得羊痘病毒γ干扰素受体(interferon-γ receptor,γ-IFNR)基因,用绵羊睾丸细胞培养山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55,提取其基因组为模板,设计γ-IFNR基因特异性引物并进行PCR扩增,将其产物克隆至pGEM-T Easy载体,并进行了测序和序列分析.电泳结果显示,扩增出了2 600...     

猪乙型脑炎病毒E基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪乙型脑炎病毒SA14-14-2基因序列设计2对引物,从分离的猪源乙型脑炎病毒SD-001株的细胞培养物中扩增出包括E基因全长的两段基因,将扩增的目的片段进行克隆与序列分析。结果表明,所克隆的E基因编码结构域（Domain）区段与SA14-14-2、P3、Beijing-1等毒株的核苷酸与氨基酸序列同源性分别达97.2%与96.8%以上,属于Ⅲ型乙型脑炎病毒,与疫苗株SA14-14-2的Domain区相比,共有8个氨基酸位点变异。     

山羊c-Myc基因的克隆及序列分析

为了克隆出山羊c-Myc基因的CDS区序列,本研究利用RT-PCR技术,参照GenBank报道的绵羊、牛、猪、马等的c-Myc基因CDS区序列设计出特异性引物,从山羊胚胎皮肤组织中扩增出山羊c-Myc CDS区序列并进行序列分析。结果表明,山羊c-Myc基因CDS区全长1320 bp （包括终止密码子）,与绵羊c-Myc基因核苷酸序列（GenBank登录号：Z68501.1）比对仅有10处存在差异,其核苷酸序列同源性为99.17%,推导的氨基酸序列同源性为99.09%;与其他物种进行同源性分析结果显示,山羊c-Myc基因CDS区与猪、狼、人、大鼠、小鼠的核苷酸序列同源性分别为91.2%、92.0%、90.2%、86.9%、86.0%,推导的氨基酸序列同源性分别为93.6%、96.1%、92.3%、91.1%、89.6%;生物信息学软件分析结果表明,山羊c-Myc蛋白产物定位于细胞核并含有HLH结构域。本研究为进一步了解c-Myc基因的功能及探讨其在山羊体细胞重编程过程中的作用奠定了基础。     

大熊猫γ-干扰素基因的克隆与序列分析

本实验应用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术,从ConA诱导培养的大熊猫外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到大熊猫γ-干扰素基因（GenBank accession No：DQ630727）,并将其克隆到pGEM-T载体中。经菌落PCR鉴定、序列测定与序列分析,结果表明,经克隆得到的IFN-1基因开放阅读框由498个核苷酸组成,编码一个由166个氨基酸组成的多肽,包括编码19个氨基酸的信号肽和147个氨基酸的成熟肽,预测蛋白分子量和等电点分别约为20Ku和9．36。与GenBank中其他哺乳动物的IFN-γ基因比较,它与犬、猫、人、猪、牛、羊、马、兔、鼠等的核苷酸序列同源性在57.7％（鼠）-93．2％（犬）之间;IFN-γ编码氨基酸序列同源性在46．8％（鼠）-92．8％（犬）之间;进化树构建结果表明大熊猫与犬的遗传距离最近。     

牦牛生长激素释放激素基因的克隆及序列分析

本文对牦牛GHRH基因进行PCR产物T—A克隆测序。通过GenBank中的Blastn分析表明：牦牛GHRH基因与普通牛同源性为98％，与猪同源性为89％。在所测序列中共有7个变异位点，变异率为1．6％，其核酸变异类型包括转换、颠换和插入，以转换最为常见。     

油茶SOD基因片段克隆及序列分析

摘要：根据已报道的多种植物Cu/Zn SOD和Mn/Fe SOD基因的氨基酸序列的保守区域分别设计简并引物,以油茶（Camellia oleifera）叶片总RNA为模板,通过RT PCR分别扩增得到一个375 bp的Cu/Zn SOD基因片段和一个429 bp的Mn/Fe SOD基因片段。将片段序列在NCBI网站上进行同源性比对,表明本研究克隆的结果均与多种植物的Cu/Zn SOD和Mn/Fe SOD基因存在亲缘关系,因而认为所克隆的基因片段就是油茶SOD基因;并运用DNAStar5.0软件分别进行序列分析,推导的氨基酸序列分别为125个残基和143个残基;具有所有植物SOD基因共有的保守区域;与多种植物Cu/Zn SOD基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均分别在80%和84%以上,与其他植物的Mn/Fe SOD基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性都在84%和86%以上。     

广西10个地方优质品种鸡γ-干扰素基因的克隆与序列分析

根据基因库中鸡γ-干扰素的基因序列设计了1对特异性引物，应用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，从ConA诱导培养的广西10个地方优质品种鸡外周血淋巴细胞RNA中扩增了γ-干扰素基因，结果，均得到了大小为520 bp的特异性片段。将扩增产物纯化并克隆到pMD18-T载体上，获得重组质粒，经PCR和EcoRⅠ＋SalⅠ双酶切鉴定后测序。序列分析结果表明，广西10个地方优质品种鸡γ-干扰席基因均编码145个氨基酸的成熟蛋白，分子质量约为16．8ku，与哺乳动物和其他品种鸡的核苷酸序列同源性分别为38．8％～39．0％和99．2％～100％，氨基酸序列同源性分别为23．69／6～24．8％和97．6％～99．4％。     

猪ESR基因一个外显子片段的克隆与序列分析

参考人、鸡、鼠的ESR基因序列，设计一对引物，采用PCR技术扩增出猪ESR基因一段DNA片段，将该片段克隆到pGEM-T Easy质粒中，重组质粒用PCR扩增和酶切分析进行阳性克隆鉴定，然后测定核苷酸序列，并推导其氨基酸序列。将测定的猪ESR基因的部分序列（332bp)与人、鼠、鸡的序列进行比较，结果表明：猪的核苷酸和氨基酸序列与人、鼠、鸡相比，同源性分别为90．06％和86．36％，85．54％和88．18％，74．10％和71．82％，显示了强的保守性，猪的核苷酸序列与人、鼠、鸡相比存在着4处特有变异，氨基酸序列aa25-30存在高变异区。