改进Tricine-SDS-PAGE法分析重组牛乳铁蛋白肽

为了有效分离3.1kDa乳铁蛋白肽,试验调整分离胶中聚丙烯酰胺浓度及凝胶的交联度,并加入适量甘油,改进了传统的Tricine-SDS-PAGE方法。结果表明,该方法与常规的SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE相比较,改进的凝胶不仅可以有效分离3.1kDa的肽,而且对分子量为212kDa的大分子量蛋白也有很好的分离效果,明显优于常规的SDS-PAGE和现有的Tricine-SDS-PAGE方法。     

牛乳铁蛋白肽基因LfcinB的合成及真核表达载体的构建

根据APD抗菌肽数据库报道的牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列,合成编码LfcinB基因的2条互补的寡核苷酸链,退火后在5′端和3′端分别形成含有BamH I和Xho I位点粘性末端的双链DNA.真核表达载体pcDNA3.1(+)经Bam H I和Xho I限制性内切酶双酶切处理后与合成的LfcinB基因进行连接,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒DNA进行测序.测序结果显示,牛乳铁蛋白肽LfcinB基因成功克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,为进一步表达和抗菌活性研究奠定物质基础.     

牛乳铁蛋白肽基因LfcinB的合成及真核表达载体的构建

根据APD抗菌肽数据库报道的牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列,合成编码LfcinB基因的2条互补的寡核苷酸链,退火后在5′端和3′端分别形成含有BamH I和Xho I位点粘性末端的双链DNA。真核表达载体pcDNA3.1（+）经BamH I 和Xho I限制性内切酶双酶切处理后与合成的LfcinB基因进行连接,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒DNA进行测序。测序结果显示,牛乳铁蛋白肽LfcinB基因成功克隆到pcDNA3.1（+）真核表达载体中,为进一步表达和抗菌活性研究奠定物质基础。     

表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌抗IBDV感染的研究

为探究表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌pPG-XLFEC/M11对雏鸡抵抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染的作用,本研究利用IBDVCEF94株感染DF-1细胞,通过CCK-8法检测病毒感染后的细胞活性,利用qRT-PCR检测病毒载量,结果显示重组乳酸菌表达的牛乳铁蛋白肽可以抑制IBDV在DF-1细胞内的增殖;以重组乳酸菌pPG-XLFEC/M11饲喂雏鸡,利用IBDV强毒UK661株进行攻毒实验,结果显示饲喂重组菌的雏鸡相比于对照组,IBDV的感染对其组织器官的损伤较小,总免疫球蛋白IgG和SIgA含量增加,细胞因子IL-6、IL-8、TNF-琢和IFN-酌以及TLR2的mRNA转录水平均显著升高,且提高了雏鸡的存活率。本实验结果表明,重组鸡源乳酸杆菌表达的牛乳铁蛋白肽可以增强机体的免疫应答水平,对雏鸡具有一定的抗IBDV感染的作用。本研究为表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌在生产中的应用以及为禽类疾病的预防奠定基础。     

两段牛乳铁蛋白肽基因在乳酸乳球菌中的共表达

根据乳酸乳球菌密码子的偏嗜性,优化设计并合成牛乳铁蛋白肽的两段基因序列LFcinB和LFampin,将其与乳酸乳球菌表达载体pAMJ399分别用SalⅠ和BglⅡ双酶切后进行连接,并电转化至乳酸乳球菌MG1363中,经酶切鉴定表明获得带有两段牛乳铁蛋白肽基因的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFcinBA/MG1363。结果表明,优化表达条件,在GM17培养基中添加3.8%的β-甘油磷酸二钠可以获得表达重组蛋白的适宜pH,West-ern-blot检测可见重组蛋白大小约13 ku,表明牛乳铁蛋白肽在重组乳酸乳球菌中获得了表达。     

表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌微胶囊制备工艺的优化

为使重组乳酸乳球菌在发酵生产后便于存储、运输,本试验利用可表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363制备微胶囊,优化微胶囊的制备工艺条件,并对胶囊化后重组菌的相关生物学特性进行检测。通过对不同壁材及壁材浓度进行控制单一变量试验,测定其包埋量,以筛选出最佳壁材及浓度。通过模拟胃肠液环境试验,比较微胶囊释放率,并对不同壁材进行保存期试验,比较最低活菌数,利用响应面试验确定最佳工艺条件,使用最佳工艺条件制备微胶囊后进行验证。优化后的结果为:选取海藻酸钠和壳聚糖作为壁材,在海藻酸钠浓度为2.49%,壳聚糖浓度为0.96%,CaCl₂浓度为6.67%,凝固时间为57 min的条件下微胶囊效果最佳,预测包埋量为7.85×10⁸ CFU/g。微胶囊在模拟胃液中稳定存在,在模拟肠液中可完全破裂,能释放出微胶囊内95%以上的乳酸乳球菌。海藻酸钠-壳聚糖微胶囊在4 ℃保存3周后,微胶囊中活菌数为1.41×10⁷ CFU/g。对微胶囊的最佳工艺条件验证结果为微胶囊的包埋量为8.08×10⁸ CFU/g;常温保存2周后,活菌数仍可达到3.89×10⁶ CFU/g;ELISA方法检测微胶囊内重组乳酸乳球菌可见表达的牛乳铁蛋白肽,抑菌试验可见微胶囊内重组乳酸乳球菌表达的牛乳铁蛋白肽对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌仍具有明显的抑制作用。以上结果表明,表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌可制备成为低成本、保存期长、耐胃液的微胶囊,为重组乳酸菌在生产中的进一步应用奠定基础。     

牛乳铁蛋白的功能

乳铁蛋白是一种乳制菌蛋白,也有调理素性质,在它的影响下,嗜中性粒细胞的吞噬活性加强。乳房发炎时,乳铁蛋白可增加20～30倍。在大肠杆菌型乳房炎,增加的趋向较葡萄球菌型和链球菌型乳房炎显著。患乳房炎的牛乳中乳铁蛋白含量为每毫升1～8毫克,表明乳腺在遭到病原攻击时能产生大量的乳铁蛋白,以抵御疾病的侵袭。正常情况下,每毫升血清中乳铁蛋白含量低于1微克,感染时乳铁蛋白合成明显增加,每天可高达30 g,其中约30%释放于血中,发挥其各种生理作用。血清乳铁蛋白的浓度升高可作为炎症反应的一个指标。通常存在于嗜中性粒     

牛乳铁蛋白卵黄抗体的制备及纯化方法的建立

通过自制并初步纯化牛乳铁蛋白的卵黄抗体,用肌肉和皮下注射结合的方法罗曼蛋鸡进行免疫来制备多克隆抗体。选用150日龄的罗曼蛋鸡4只进行不同浓度的多次皮下免疫注射,采集卵黄抗体并用硫酸铵沉淀法进行抗体的初步纯化,经四次免疫后的罗曼蛋鸡卵黄抗体的效价分别达到了1：32000和1：24000,并在较高水平的情况下维持两周以上,同时经初步纯化后抗体纯度得到了很大提高。试验结果显示肌肉和皮下注射结合的方法对罗曼蛋鸡进行免疫来制备多克隆抗体是可行的,同时通过硫酸铵沉淀法纯化抗体可以达到试验的需求。     

重组猪源罗伊氏乳酸杆菌分泌表达牛乳铁蛋白肽对新生仔猪生长性能的影响以及抗腹泻病毒感染的保护作用研究

本试验旨在研究分泌表达牛乳铁蛋白肽(LFCA)的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌对新生仔猪生长性能的影响以及对引起仔猪腹泻的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染的保护作用.试验1:选取36头1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪,随机分为3组,分别为重组菌组、空载菌组和对照组,每组12头仔猪,分别口服表达LFCA的重组猪源罗...     

酸水解制备饲料小肽的初步研究

以大豆分离蛋白(SPI)为原料,分别在70、80、90℃条件下经6mol/l的盐酸水解2￣10、12、24、48h,对各水解产物的α-氨基氮与总氮的比值(α-NH2-N/TN)、水解产物分子量分布范围及适宜水解条件下终产物二肽、三肽含量进行了测定。结果表明,酸水解明显受反应温度和时间影响,提高水解温度,可缩短达到平均肽链长度(APL)为2所需的时间;适宜水解条件为温度90℃、反应时间5h,终产物二肽、三肽含量为19.38%。     

添加甲酸对麻叶荨麻青贮品质的影响

为探讨甲酸对麻叶荨麻(Urtica cannabina)发酵品质和青贮保存效果的影响,设置2,4,6mL.kg-1 FM共3个甲酸添加剂处理(分别为低、中、高水平),以不添加甲酸处理为对照,室温袋贮60 d后开封取样,测定其pH值、化学成分、体外消化率和乳酸含量,分析评价其发酵品质及保存效果.结果表明:无甲酸处理或添加2～4mL·kg-1甲酸青贮麻叶荨麻,其青贮品质和保存效果很差;添加高剂量(6 mL·kg-1)甲酸虽然同样未能生产出品质优良的青贮饲料,但显著降低了pH值、乳酸含量和氨态氮(P＜0.05),有降低纤维组分的趋势(P=0.132; P=0.087),显著增加了干物质、可溶性糖含量和中性洗涤纤维体外消化率(P＜0.05),有利于改善发酵品质和提高植物细胞壁利用效率.试验结果将为荨麻属植物及与之类似的高水分、高蛋白质牧草青贮技术提供基础数据.     

添加甲酸或蔗糖对苏丹草青贮品质的影响

为探讨甲酸和蔗糖添加剂对苏丹草青贮的影响,以结实期苏丹草为原料,分别设对照、添加甲酸(6ml/kg)、添加蔗糖(2%)处理,袋装密封青贮60 d后分析.结果表明,添加蔗糖或甲酸都能显著改善苏丹草青贮饲料的发酵品质,添加甲酸可以显著降低青贮饲料的pH,极显著降低氨态氮含量,极显著提高乳酸含量.添加蔗糖可以显著提高乳酸含量,极显著提高乙酸含量,显著降低氨态氮含量.添加甲酸处理可溶性碳水化合(WSC)和硝酸盐含量分别显著高于对照和蔗糖处理.与原料相比,青贮之后硝酸盐含量显著下降,而亚硝酸盐含量增加.     

应用Sj23基因重组抗原诊断牛、羊血吸虫病研究

以血吸虫基因重组抗原LHD-Sj23／pGEX(血吸虫23kD抗原大亲水区多肽／pGEX载体表达蛋白)作为抗原。应用ELISA法检测黄、水牛和绵羊血吸虫病。结果对黄、水牛的阳性符合率为94．0％(79／84)和85．5％(53／62)，阴性符合率为82．7％(81／98)和95．1％(77／81)，对绵羊的阳性符合率为86．04％(111／129)，阴性符合率为100％(9l／91)。以血吸虫成虫抗原(SWAP)及虫卵抗原(SEA)作为诊断抗原获得的结果差异不明显。对锥虫感染绵羊血清不出现交叉反应。由于基因重组抗原的制备比虫体抗原制备简便、价廉，同时由于基因重组抗原的应用有利于诊断技术的标准化，以基因重组抗原作为血吸虫病诊断抗原具有良好的研究应用前景。     

重组溶菌酶质粒pcDNAKLYZ治疗泌乳期奶牛乳房炎

通过比较注射人溶菌酶重组质粒pcDNAKLYZ的隐性乳房炎奶牛注射前后的奶样中细菌计数结果,对重组溶菌酶基因工程质粒治疗奶牛乳房炎的效果进行分析。对乳房炎患牛的156个乳区治疗前后312份奶样进行细菌培养,其中在注射前的乳样的培养结果中,阴性率为0（0/156）,菌落数在50以内的比率为12.82%（20/156）,在51～100的比率为16.67%（26/156）,大于等于100的比率为70.51%（110/150）;在注射人溶菌酶的重组质粒pcDNAKLYZ后的奶牛乳样的培养结果中,阴性率为51.92%（81/156）,菌落数在50以内的比率为45.51%（71/156）,菌落数在51～100的比率为0%（0/156）,大于等于100的比率为2.56%（4/156）。因此,从细菌计数结果来看,重组质粒组的阴性及小于50的比率（97.44%）远高于治疗前（12.82%）,重组质粒的抑菌效果显著（P〈0.05）,该重组质粒对奶牛乳房炎具有较好的治疗效果。     

乳铁蛋白及乳铁蛋白肽的基因工程研究进展

近年来,随着对乳铁蛋白和乳铁蛋白肽作用机制和空间结构的研究趋于成熟,国内外研究者逐渐将研究重点倾向于乳铁蛋白和乳铁蛋白肽的开发应用.主要介绍了乳铁蛋白和乳铁蛋白肽基因工程的研究进展,尤其是对原核表达系统和真核表达系统进行了综述.     

Bovine ephemeral fever in Taiwan (2001-2002)

Bovine ephemeral fever (BEF), a vector-borne disease of cattle, is caused by the Ephemerovirus of the family Rhabdoviridae. In the past 40 years, Taiwan has had seven BEF epizootics, and we have previously reported the first five. This study summarizes the 2001 and 2002 epizootics; conducted case-control serologic studies on 10 herds involved in the 2001 epizootic; determined whether the recent BEF viruses have varied significantly; and discusses the relationship between epizootic patterns and possible variant BEF viruses. For mature cows that had received at least 2 doses of vaccine before the study, a negative correlation between the prevaccinated (the 3rd dose and after) serum neutralization antibody (SNA) titers and their postvaccinated peak rates was found. When prevaccinated SNA levels were at < or = 32, their postvaccinated SNA levels increased significantly faster (P<0.01) than for those at > or = 32. The glycoprotein gene of isolates from 1999, 2001, and 2002 had a 99.2-99.9% homology, without consistent amino acid variations in the neutralization sites. Phylogenetic analysis of Taiwanese isolates revealed 2 distinct clusters, the 1983-1989 and 1996-2002 isolates. Cross-neutralization tests confirmed the glycoprotein gene sequence analysis results. In conclusion, annual boosters at SNA levels > 32, at more than 2 doses, or at intervals shorter than 6 months are not advisable. The occurrence of frequent small epizootics implies the dominance of BEF virus over host immunity, but not a variant virus.     

Efficient Production of Cloned Bovine Embryos Using cdc2 kinase Inhibitor

This study was carried out to compare the effects of the combination of ionomycin with a H1‐histone kinase inhibitor (dimethylaminopurine, DMAP) or cdc2 kinase inhibitor (sodium pyrophosphate, SPP) on the development of reconstituted bovine eggs. For this study, the enucleated bovine oocytes were injected with a presumptive primordial germ cell pre‐treated with 1% sodium citrate, and randomly allocated into three activation groups: Group 1 (ionomycin 5 μm , 5 min), Group 2 (ionomycin + DMAP 1.9 mm , 3 h), and Group 3 (ionomycin + SPP 2 mm , 3 h). The reconstituted eggs were compared on the rates of cleavage and development with the blastocyst stage and the ploidy of embryos at 96 h post‐activation. Cleavage rates and blastocyst development in Groups 1, 2 and 3 were 7 and 0%, 63 and 17%, and 53 and 14%, respectively. The chromosomal composition differed significantly (p < 0.05) among treatments. Although the embryos in Group 1 had significantly lower developments, 60% of embryos evaluated had diploid chromosomal sets. In contrast, ～60% of embryos in Group 2 had abnormal ploidy (21% polyploid and 38% mixoploid). In Group 3, the appearance of abnormal chromosome sets was reduced with the proportion of diploid embryos being increased to 86% (19 of 22), significantly higher (p < 0.05) than in Group 2. It can be concluded that the use of SPP with ionomycin reduces greatly the incidence of chromosomal abnormalities, and may be applicable for the activation of nuclear transplant bovine embryos.     

Paenibacillus spp.BD3526金属蛋白酶对乳蛋白水解位点分析

为了比较具有凝乳功能的Paenibacillus spp.BD3526来源的金属蛋白酶与基因重组凝乳酶对乳蛋白水解位点的差异,采用BD3526金属蛋白酶和凝乳酶对αs1-酪蛋白(casein,CN)、αs2-CN、β-乳球蛋白(lactoglobulin,Lg)和κ-CN进行酶解,分别对不同时间的酶解产物采用高效液相色谱与四极杆飞行时间串联质谱(high performance liquid chromatography of quadrupole time of flight-tandem mass spectrometry,HPLC-Q-TOF-MS/MS)进行分析.结果表明:BD3526金属蛋白酶与凝乳酶在对乳蛋白的水解位点上具有较高的相似性,前者对αs1-CN、αs2-CN、β-Lg和κ-CN水解能力较后者弱,对P1为K(Lys)、R(Arg)且P1'为T(Thr)、F(Phe)和Y(Tyr)间的肽键水解特异性很高,并主要水解K-T (Lys-Thr)、K-F (Lys-Phe)、R-F(Arg-Phe)、R-Y(Arg-Tyr)肽键,水解生成的肽具有血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制、抗菌、免疫调节等功能.     

乳铁蛋白及乳铁蛋白肽结构抗菌功能及基因表达

乳铁蛋白 (LF)是一种天然的铁结合蛋白。乳铁蛋白肽 (Lfcin)是从LF上被胃蛋白酶水解下来的 2 5个氨基酸残基的小肽。本文综述了LF和Lfcin的结构、抗菌功能和基因表达调控的研究进展     

Analysis of Two Chinese Yak(Bos grunniens) Population Using Bovine Microsatellite Primers

Two Chinese domestic yak populations representing the Plateau type and the Huanhu Alpine type were analysed with 12 bovine microsatellite primers. All primer pairs functioned in the yak genome and polymorphism was found at all loci. The allele size ranges and frequencies of the two yak populations were similar and there was considerable overlap with the allele size ranges observed in cattle. Data for European cattle breeds was obtained from the Cattle Diversity Database(CaDBase)to interpret the heterozygosity and genetic distance estimates in yak populations. Heterozygosity estimated for the two yak populations was comparable to that of European cattle while Nei's Genetic Distance DA between the two yak populations was less than distances between the most closely related German cattle breeds. Bovine microsatellite primers proved to be a valuable tool for characterization of yak populations.